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MATERIALI E METODI
ACQUISIZIONE DOCUMENTAZIONE TECNICA E MATERIALI
In una fase preliminare a quella della Qualificazione delle Prestazioni della strumentazione analitica IH-1000 della ditta Diamed, e quindi, nell’ambito della fase di Qualificazione dell’Installazione (QI), il primo passaggio ha riguardato il recupero della seguente documentazione tecnica a corredo dei prodotti:
- Attestati di formazione del personale abilitato all’utilizzo dello strumento - Procedure Operative Standard (SOP) elaborate dal Centro Trasfusionale,
inerenti alle attività analitiche finalizzate all’ assegnazione di concentrati eritrocitari
- Capitolato di gara e delibera di aggiudicazione dei dispositivi IH-1000 - Verbale di installazione e collaudo dei dispositivi IH-1000
- Piano di manutenzione
- Gestione dei Controlli di Qualità Interni (CQI) - Manuale operativo
- Informazione sui livelli di accesso al dispositivo e sulla loro diversificazione - Informazioni sui sistemi di back-up, sui tipi di barcode letti e sui volumi minimi
accettati dal dispositivo
Nel corso delle attività di convalida e quindi della Qualificazione delle Prestazioni (QP), sono state acquisite documentazioni riguardanti:
- Schede tecniche delle provette utilizzate ai fini delle prove di convalida;
- Schede tecniche di lotti di schedine e reagenti utilizzati nel corso delle prove di convalida con relative scadenze, sulla base dei profili analitici precedentemente scelti in corso di pianificazione del disegno sperimentale (Validation Plan). Durante le attività svolte nel laboratorio di Immunoematologia eritrocitaria dell’AOU di Careggi, sono in particolare state utilizzate provette BD-Vacutainer contenenti Eparina di Litio micronizzata (17 UI/ml) e provette BD-Vacutainer contenenti EDTA K2 (1,8 mg/ml), entrambe di volume di 6 ml e di dimensioni 13x100 mm.
26 Sulla base dei profili scelti sono state utilizzate schedine AB0/D (Diaclon) e Nacl Enzyme and Cold agglutinins, per la tipizzazione di gruppo diretto e indiretto, Rh-subgroups+K (DiaClon) per la determinazione del fenotipo e del Kell, LISS/Coombs cards, per i test antiglobulinici diretti, indiretti e per l’identificazione anticorpale, ABD Confirmation for patients per il controllo di gruppo.
I reattivi utilizzati nell’ambito delle prove di convalida sono stati: emazie Diacell ABO (A1, A2, B, O) per la tipizzazione di gruppo indiretta, ID-Diacell I, II, III (Diamed-Biorad), per i test di Coombs diretti ed indiretti, DiaMed ID-DiaPanel (11 cellule) per l’identificazione anticorpale sui test di Coombs positivi, il potenziante LISS, soluzione a bassa forza ionica, per i test non sierologici.
Il buon esito delle prove di convalida permetterà di recuperare dalla ditta i Certificati di Qualità (Quality Assurance) sui lotti di schedine e di reagenti utilizzati, documenti attestanti l’adeguatezza dei prodotti all’utilizzo previsto nella nostra ST.
PRINCIPI DELLA METODICA DI AGGLUTINAZIONE SU COLONNA DI GEL DI SEPHACRYL
La metodica di agglutinazione su microcolonna in cards utilizza come principio separatore il gel di Sephacryl, preseminato in sei microcolonne, opportunamente mescolato con l’anticorpo di interesse. Le cards sono quindi pronte all’uso e disponibili in svariate configurazioni di profilo a seconda delle necessità. La strumentazione automatica dispensa campioni e reagenti ausiliari all’interno delle microcolonne e, dopo eventuale incubazione, se prevista da metodica, le cards vengono centrifugate per 10 min a 85g. Durante la fase di centrifugazione, se si sono formati degli agglutinati, questi vengono trattenuti all’interno del gel o sulla sommità dello stesso (reazione positiva con score da 1+ a 4+) (Fig.4).
27 In caso contrario, i globuli rossi liberi si raccolgono sul fondo della microprovetta e sono chiaramente distinguibili come un bottone rosso (reazione negativa). Si descrivono due tipologie di analisi con questa metodica: 1) Determinazione diretta degli antigeni eritrocitari sui globuli rossi dei pazienti; 2) Ricerca anticorpi irregolari o naturali (RAI) nel siero/plasma del paziente o sulle emazie in vivo (DAT).
1) Esempio di determinazione diretta di gruppo ABO/Rh con schedine con anticorpi monoclonali profilo : A-B-AB-D(VI+)-D(VI-)-Ctl (Fig.5).
Fig.5 Profilo di determinazione di gruppo con schedine ABO/Rh
Il primo anti-D permette di rilevare la presenza della variante DVI, in accordo agli Standard vigenti, mentre il secondo anti-D non reagisce con la stessa. In questo modo è possibile discriminare, già alla prima determinazione, eventuali antigeni D aberranti. Nella tipizzazione antigenica diretta, lo strumento prepara e dispensa nelle corrispondenti microcolonne della card, una sospensione di emazie del campione al 5% con soluzione LISS. La Card viene immediatamente centrifugata, letta e interpretata.
2) Esempio di determinazione indiretta di gruppo sanguigno ABO con schedine NaCl ed emazie test A1,A2,B,0. Lo strumento dispensa prima le emazie test di donatori noti nei micropozzetti della card e poi aggiunge il siero/plasma del paziente (50µl per emazie e siero/plasma). Dopo incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente, la card viene centrifugata, letta e interpretata (Fig.6).
28 Fig.6 Tipizzazione di gruppo indiretto mediante schedina Nacl Enzyme and cold agglutinins. Nell’immagine ogni schedina è relativa a due pazienti diversi (tre microcolonne per ogni paziente).
Il fenotipo di un campione e l’eventuale presenza dell’antigene Kell vengono determinati mediante la dispensazione di una aliquota di emazie in microcolonne di schedine Rh-subgroups+K, nella cui matrice del gel sono presenti rispettivamente anticorpi monoclonali anti-C, anti-c, anti-E, anti-e e anti-K (Fig.7).
Fig.7 Esempio di fenotipo RH e di positivà all’antigene Kell
Per i test di screening e identificazione anticorpale (TCI), lo strumento dispensa prima le emazie test di donatori noti nei micropozzetti dedicati e poi il siero/plasma del paziente (50µl per emazie e siero/plasma). Anche in questo caso dopo incubazione di 10 minuti, la card viene centrifugata, letta e interpretata. In genere, una volta avvenuta la dispensazione dei campioni e dei reagenti, le schedine vengono lasciate ad incubare in un termostato a 37 °C per 10-20 minuti, a seconda della tipologia di test. Successivamente le schedine vengono trasferite in apposite centrifughe per 10 minuti e sottoposte a lettura elettronica.
29 Nel caso del TCD (Test di Coombs diretto o DAT), le emazie dei campioni vengono distribuiti in microcolonne di schedine LISS-Coombs, nella cui matrice del gel sono presenti reagenti polispecifici antiglobulina-umana (AHG) che rivelano l’eventuale presenza di immunoglobuline di tipo IgG. In caso di positività al DAT, la discriminazione tra le diverse tipologie anticorpali, viene effettuata attraverso test monospecifici (Fig.8).
Fig.8 Esempio di Test antiglobulinico diretto positivo per anticorpi di tipo IgG.
Sia nel caso di uno screening TCI che nel caso di una eventuale necessità di effettuare identificazione anticorpale, viene dispensato il siero in presenza rispettivamente di emazie ID-DiaCell I,II,III (Fig.9) ,e di 11 tipi di emazie test ID-DiaPanel. In entrambi i casi l’interpretazione viene effettuata mediante il confronto di lettura con pannelli forniti dalla ditta per ciascun lotto di reagenti.
Fig.9 Pannello per l’interpretazione di uno screening a tre cellule di un TCI positivo. Le tre cellule presentano i principali siti antigenici eritrocitari ottenuti da combinazioni di eritrociti di donatori.
30 Questo metodo presenta il vantaggio di abbreviare spesso i tempi di esecuzione, di ridurre la quantità dei siero e di emazie utilizzate (sia di quelle dei kit commerciali che quelle del paziente) e soprattutto di dare un risultato stabile, e quindi oggettivo, che può essere verificato in momenti successivi, può essere facilmente registrato ed accuratamente interpretato anche con sistemi di lettura elettronici.
RISK ASSESSMENT PER I TEST ANALITICI PRETRASFUSIONALI
Allo scopo di valutare, nelle normali condizioni di lavoro della ST, la performance dello strumento analitico IH-1000, adottato per l’esecuzione delle indagini pre-trasfusionali dei riceventi, nonché quelle connesse allo studio e alla prevenzione delle MEN e MEA, il primo passo è stato quello di analizzare i punti critici del processo relativo alle procedure analitiche finalizzate all’assegnazione di sacche eritrocitarie concentrate, mediante analisi FMECA (Tab. 10).
ANALISI E VALUTAZIONE DEI RISCHI - TEST ANALITICI PRETRASFUSIONALI-
31 FASE ANALITICA
32 FASE POST-ANALITICA
Tab.10 Analisi FMECA delle procedure analitiche di test pretrasfusionali
NOMENCLATURA PROFILI E TEST ASSOCIATI
La maggior parte dei punti critici definiti nella fase analitica dell’analisi FMECA sono già stati oggetto di prove definite nell’ambito della Qualificazione dell’Installazione (IQ) e della Qualificazione delle funzioni (OQ) da parte della ditta fornitrice e dell’Ingegneria clinica.
33 In relazione ai requisiti richiesti dalle linee guida del CNS per la qualificazione delle
performance (QP) degli strumenti, quali l’accuratezza diagnostica dei test in termini di
sensibilità e specificità analitica, la riproducibilità e l’adeguatezza del TAT (Turn Around Time) rispetto ai tempi per la disponibilità dei risultati analitici, definiti dal laboratorio, viene effettuata la scelta dei profili sui quali effettuare le prove di convalida sulla base del proprio contesto lavorativo. Si è ritenuto opportuno effettuare le prove esclusivamente per i profili ritenuti come essenziali dalle normative vigenti per l’assegnazione delle sacche, con l’aggiunta dei test di approfondimento quali l’identificazione anticorpale su TCI positivi ed i test monospecifici sui DAT positivi.
34 PROTOCOLLO DI CONVALIDA
Una volta individuati i punti critici di processo attraverso una analisi FMECA, come precedentemente detto, uno step successivo nella formulazione di un disegno sperimentale prevede l’identificazione dei parametri da controllare per verificare l’adeguatezza del processo all’interno del proprio contesto lavorativo. Nel caso dei test analitici, come visto, si possono considerare tre tipi di output:
1) “Accuratezza diagnostica in termini di sensibilità e specificità analitica”; 2) “Riproducibilità dei risultati”;
3) “TAT (Turn Around Time)”
Escludendo le prove relative agli stress-test (worst case) ed assumendo come variabili indipendenti, e quindi ininfluenti ai fini dell’alterazione della conformità degli output di processo, la posizione delle provette sull’analizzatore, la loro grandezza, il tipo di anticoagulante utilizzato (Litio Eparina o EDTA non modificano l’output atteso), la loro temperatura nelle condizioni routinarie, possiamo individuare al massimo un solo
fattore di stratificazione, come la “tipologia di analizzatore utilizzato”.
I livelli di carico dell’analizzatore come “analizzatore vuoto” o “analizzatore a medio carico”, potrebbero essere altri due fattori di stratificazione da poter considerare ma, essendo le prove di convalida effettuate in parallelo (“convalida concomitante”) alla produzione di routine si potrebbero ridurre i fattori di stratificazione al solo utilizzo dell’analizzatore a medio carico. Si può, infine, aggiungere che l’“analizzatore a pieno carico” è un fattore di stratificazione utilizzabile solo nell’ambito degli stress-test, dal momento che in routine difficilmente può avvenire una casistica di questo tipo, disponendo di due analizzatori.
Tuttavia l’output relativo al rispetto dei tempi (TAT) può essere influenzato dal numero di urgenze in arrivo, indicato come criticità nell’analisi del rischio, per cui le prove di convalida non possono non prescindere dal monitoraggio dei tempi di risposta che, almeno per i profili richiesti in urgenza, non devono superare quelli previsti dalle
35 normative in vigore e dalle procedure operative standard (SOP) della Struttura. In questo caso è opportuno eseguire le prove tenendo conto delle diverse modalità di carico dell’analizzatore.
Le URS ed in particolare i “must” presi in considerazione per gli Standard di riferimento attesi per il processo sono gli stessi previsti dal SIMTI, indicati come “Requisiti e raccomandazioni essenziali”10.
Fatte queste premesse, le prove di convalida devono prevedere tre cicli consecutivi di corse analitiche su ciascuno dei due analizzatori, dal momento che viene considerato un unico fattore di stratificazione.
Pertanto, ai fini della verifica dei requisiti attesi sopra definiti, le prove sono state pianificate in dettaglio secondo le seguenti modalità:
Accuratezza diagnostica in termini di sensibilità e specificità analitica
Per la verifica dei parametri di sensibilità e specificità analitica dei test di immunoematologia eritrocitaria sono stati utilizzati 10 campioni di siero positivi, con debole espressione anticorpale di anticorpi anti-D, diluiti in concentrazioni note di 0,1 UI/ml, 0.05 UI/ml e 0,025 UI/ml, 9 dei quali provenienti da ditta di produzione esterna. La finalità è quella di testare la capacità dei reagenti di identificare campioni positivi alla presenza di anticorpi anti-D.
Sono state utilizzate per le stesse finalità campioni di sangue provenienti dal settore di Immunoematologia di Base, di cinque pazienti noti e donatori, afferenti all’Azienda UO Careggi, risultati positivi a test Week-D con metodo analitico diverso (metodica in Capture su strumento Neo-Galileo Immucor). I campioni sono stati testati contemporaneamente ad altri dieci risultati francamente RH negativi e dieci risultati francamente RH positivi, usati come controlli. I test sono stati, poi, ripetuti in tre cicli analitici diversi.
Sono inoltre stati saggiati cinque campioni noti, provenienti dal settore di Immunoematologia di Base, di gruppi espressi debolmente, il cui esito deve essere
36 compatibile con le specifiche tecniche riportate nel Kit del produttore in tutti e tre i cicli di prove.
Le diverse caratteristiche di gruppo e di fenotipo RH dei campioni scelti hanno la finalità di dimostrare che la specificità dei reagenti sia conforme a quella dichiarata dal produttore. Per testare la specificità dei test sono stati, infine, scelti dieci campioni positivi al test antiglobulinico diretto (DAT) da dati di archivio di pazienti ambulatoriali sui quali sia stato effettuato, parallelamente sui due strumenti IH-1000, un approfondimento di identificazione degli anticorpi e/o fattori del complemento adesi alla superficie eritrocitaria (test monospecifici).
Tutti i campioni sono stati analizzati in sedute analitiche diverse e processati per i medesimi profili in parallelo nel corso della stessa giornata su entrambi gli strumenti IH-1000, utilizzando i medesimi lotti di schedine e di reagenti. I test sugli stessi campioni sono stati ripetuti in 3 batch in giornate diverse come indicativamente prospettato dalle linee Guida del CNS.
Trattandosi di analisi semiquantitative i risultati di sensibilità e specificità analitica dovranno essere conformi alle specifiche indicate dal produttore in termini di score di reattività per espressioni deboli antigeniche e anticorpali.
Riproducibilità dei risultati
In un contesto di convalida retrospettiva sono stati utilizzati dati di archivio di 20 pazienti ambulatoriali afferenti al Centro Sangue di Careggi, confrontando i risultati ottenuti per gli stessi profili dei medesimi pazienti testati in parallelo su entrambi gli strumenti IH-1000.
Sono, inoltre, stati saggiati 12 campioni di gruppo noto, distinti in 3 di gruppo A, 3 di gruppo B, 3 di gruppo AB e 3 di gruppo O, provenienti dal settore di Immunoematologia di Base, già testati con metodica in Capture. I campioni sono stati saggiati entro 24h dal loro arrivo alla Struttura e sono stati processati per profilo anche di ricerca di anticorpi irregolari lo stesso giorno in parallelo su entrambi gli strumenti IH-1000, utilizzando stessi lotti di reagenti e schedine, per valutare la variabile critica
37 della congruenza degli output. I test sono stati, poi, ripetuti in tre cicli in giorni diversi, per valutare la variabile critica della riproducibilità dei risultati.
Adeguatezza del TAT (Turn Around Time)
Sono stati testati su entrambi gli strumenti IH-1000 venti campioni di pazienti per i profili di legge in urgenza in diverse modalità di carico dell’analizzatore, verificando che i tempi di risposta fossero conformi alle normative di legge e agli Standard SIMTI e comunque rientrassero nei tempi tecnici non superiori ai 45’ stabiliti dalla ST. I risultati sono stati confrontati con i tempi analitici indicati nelle specifiche tecniche del produttore.
Il numero di test falliti e/o ripetuti che hanno causato un tempo di risposta superiore a quanto stabilito, è stato indicato per ogni saggio effettuato per la successiva analisi statistica di processo (SPC).
PIANO DI CHANGE CONTROL
Nel contesto di un cambiamento avvenuto nelle procedure operative standard della fase preanalitica, ed in particolare sui tempi e velocità di centrifugazione dei campioni, vengono saggiati 10 campioni noti con caratteristiche particolari. Di questi vengono scelti tre campioni positivi e tre negativi al TCI, due con espressione debole dell’antigene D, uno positivo all’antigene Kell ed uno TCI positivo con tipizzazione di gruppo incerta con metodo in Capture. I test di prima determinazione sui campioni sono,anche in questo caso, ripetuti in tre cicli su entrambi gli strumenti IH-1000 per ciascuna delle due diverse modalità di centrifugazione (3000 rpm per 10 min. e 4300 rpm per 5 min), onde valutare la riproducibilità degli output in seguito a variazione del trattamento preanalitico. L’indice del rischio IPR viene rivalutato sulla base dei risultati ottenuti e gli stessi sono confrontati con la finalità di dimostrare che le modalità operative siano tenute sotto controllo.
