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4. RISULTATI
Durante il nostro lavoro si sono presentati molteplici ostacoli a cui
abbiamo dovuto far fronte, il primo dei quali, ovviamente è stata la difficoltà nel reperire embrioni umani in arresto mitotico in condizioni morfologiche adeguate per poter eseguire la biopsia del blastomero.
Per questo motivo, in una prima fase del nostro lavoro, sono state messe a punto la tecnica di fissaggio di poche cellule amniotiche su un vetrino e la tecnica FISH al fine di acquisire la manualità e l’esperienza necessaria per poter lavorare successivamente su una sola cellula.
Per quanto riguarda la fase di fissaggio delle cellule amniotiche sono stati effettuati molti vetrini.
In particolare sono state eseguite 4 prove, per ognuna delle quali sono stati selezionati i 10 vetrini ritenuti migliori. All’interno di ogni gruppo sono stati divisi i vetrini con più di 5 cellule fissate da quelli con meno di 5 cellule e su di essi è stata fatta la FISH.
Nella prima prova la percentuale totale di vetrini in cui era visibile all’interno del nucleo il segnale della sonda è risultata essere solo del 30%
(figura 9).
Figura 9 FISH con sonda centromerica D14Z1-D22Z1 AQUARIUS
Per questo motivo nella seconda prova effettuata è stato deciso di
aumentare la quantità di soluzione ipotonica utilizzata, passando da 2 µl a 4 µl
totali. Nella prova successiva la percentuale di vetrini positivi al segnale di FISH
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è stata del 40% e, osservando i vetrini al microscopio a fluorescenza, è stato dedotto che probabilmente la fase di fissaggio non era ancora in grado di digerire completamente il citoplasma presente. E’ stata quindi aumentata anche la quantità di fissativo di Carnoy da 2 - 3 µl a 5 - 6 µl totali. Questo passaggio ha permesso di ottenere alla prova successiva una percentuale di positivi nettamente superiore (70%)(figura 10).
Figura 10 FISH con sonda centromerica D14Z1-D22Z1 AQUARIUS
Infine, allo scopo di aumentare ancora di più questa percentuale, i vetrini
della 4° prova, una volta fissate le cellule, sono stati tenuti 7/10 minuti all’interno
di una falcon contenente il fissativo di Carnoy, in modo da eliminare il materiale
presente nel liquido amniotico fissato insieme alle cellule sulla superficie del
vetrino(proteine ecc…), in grado di ostacolare non solo l’entrata della sonda
all’interno del nucleo, ma anche di causare una colorazione di fondo che rende
la lettura del vetrino molto più difficoltosa.
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E’ stata in questo modo ottenuta una percentuale dell’80% (Tabella 1).
Numero di prove svolte
Numero di vetrini
FISH 14 / 22
Positivi Negativi Percentuale di vetrini positivi
1°prova
10
Vetrini con più di 5
cellule
8
3 5 37.5 %
Vetrini con circa 5 cellule
2
0 2 0 %
2°prova
10Vetrini con più di 5
cellule
9
4 5 44,4%
Vetrini con circa 5 cellule
1
0 1 0 %
3°prova
10Vetrini con più di 5
cellule
6
4 2 66,6%
Vetrini con circa 5 cellule
4
3 1 75%
4°prova
10Vetrini con più di 5
cellule
7
6 1 85,7%
Vetrini con circa 5 cellule
3
2 1 6,6%
Tabella 1 In ogni prova sono stati divisi i vetrini in due gruppi(1° Gruppo: vetrini con più di 5 cellule fissate, 2° Gruppo: vetrini con circa 5 cellule fissate). In ogni gruppo è stato contato il numero di vetrini positivi alla FISH e il numero di vetrini negativi.
Per ogni gruppo è stata calcolata la percentuale totale di vetrini positivi.
Una volta eseguite queste prove sono stati allestiti altri vetrini, tra i quali
sono stati selezionati i 10 migliori all’analisi microscopica, e sui quali è stato
eseguito il protocollo di FISH abbreviato a 4 ore
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Da tali vetrini è risultata una percentuale di positività pari al 90%(Tabella 2).
Figura 11 FISH con sonda centromerica D14Z1-D22Z1 AQUARIUS
Facendo un confronto tra i vetrini su cui è stato eseguito il protocollo di FISH tradizionale e quelli sottoposti al protocollo abbreviato, non sono state evidenziate particolari differenze dal punto di vista della qualità e della quantità dei segnali, né sulla percentuale di positivi ottenuta in media (figura 11).
I successi e i fallimenti riflettono il risultato della letteratura (rischio di fallimento della tecnica FISH=7-10%) (Thornhill AR. et al., 2005).
NUMERO VETRINI
FISH 14/22 di 4 h
Positivi Negativi Percentuale
vetrini positivi
10 con <5 cell 9 1 90 %
Tabella 2
In entrambe le ibridazioni fatte utilizzando la sonda centromerica 13/21
(figura 12) e successivamente quella del cromosoma N. 15 i segnali sono
risultati positivi e di qualità comparabile alla prima ibridazione con la sonda 14-
22.
56 Figura 12 FISH con sonda centromerica D13Z1 – D21Z1 AQUARIUS della CYTOCELL
Nella seconda fase del nostro lavoro è stato fissato un blastomero su un vetrino e su di esso è stata eseguita l’ibridazione in situ fluorescente di tipo 14/22 (figura 13). Dopo aver ottenuto un segnale positivo dalla prima ibridazione effettuata è stato quindi deciso di provare ad effettuare sempre sullo stesso blastomero ulteriori due FISH, la prima per mezzo delle sonde X/Y (figura 14) e la seconda per mezzo delle sonde 8/9 (figura 15).
Mentre dalla FISH di tipo X/Y sono stati ottenuti dei risultati positivi, per
quanto riguarda la terza FISH con la sonda 8/9 è stata rilevata la presenza di
segnali aspecifici all’interno del nucleo (15).
57 Figura 13 FISH con sonda centromerica D14Z1-D22Z1 AQUARIUS
Figura 14 FISH con sonda centromerica X-Y LSI CEP X DXZ1/ CEP Y DYZ3
Figura 15 FISH con sonda centromerica LSI D8Z2-D9Z3 della CYTOCELL
