Xotx2 253∆C
Questo costrutto codifica per una proteina Xotx2 che è priva della Otx-tail. È stato denominato in questo modo perché contiene i primi 253 residui amminoacidici (1-253) di Xotx2 wild type. Il costrutto è stato generato utilizzando un primer comune agli altri costruti deleti di Xotx2 (denominato 5Xotx2) e un primer specifico per questo costrutto (denominato Xotx2 253). Il primer specifico contiene al suo interno un codone (TCA) che genererà sul filamento antiparallelo un codone di stop (TGA) e subito dopo il sito di taglio riconosciuto da EcoRI (GGGAAT). Il primer 5Xotx2 contiene invece solo il sito di taglio dell’enzima. La creazione del costrutto è avvenuta tramite l’amplificazione per PCR di frammenti così generati, che presentano alle estremità 3’ e 5’ dei siti di taglio per EcoRI. La digestione di tali frammenti ha permesso la formazione degli inserti che sono poi stati clonati all’interno di pCS2+ precedentemente linearizzato con lo stesso enzima. Il costrutto Xotx2
253∆C è stato generato utilizzando i seguenti primers:
Sequenze primers:
5Xotx2: GGGAATTCGATCAAACACGAGCATGATGT
Xotx2 146∆C
Questo costrutto è stato generato in maniera analoga al precedente. Si è utilizzato il primer 5Xotx2, già utilizzato per generare il costrutto Xotx2
253∆C, ed un primer al 3’ specifico per questo costrutto. Anche questo primer
conteneva il codone di stop e il sito di taglio per EcoRI. I primers utilizzati sono stati:
Sequenze primers:
5Xotx2: GGGAATTCGATCAAACACGAGCATGATGT Xotx2 146: GGGAATTCATGTGCTGCTTGAGATGACTG
Xotx2 101∆C
Questo costrutto è stato realizzato allo stesso modo dei due precedenti. I primers usati sono stati 5Xotx2 (lo stesso dei costrutti precedenti), e un primer specifico al 3’ (Xotx2 101). Anche in questo caso il primer specifico contiene sia il codone di stop che il sito di taglio per EcoRI.
Sequenze primers:
5Xotx2: GGGAATTCGATCAAACACGAGCATGATGT Xotx2 101: GGGAATTCACTGCTGCTGCTGTTGCTGC
Xotx5 255∆C
La tecnica di generazione di questo costrutto è la stessa già usata per i costrutti deleti di Xotx2. Anche in questo caso si è utilizzato un primer comune e sempre uguale per tutti i costrutti di Xotx5, che è stato denominato 5Xotx5 e che conteneva un sito di taglio per l’enzima EcoRI. L’altro primer utilizzato, al
stop (TCA) e un sito di taglio riconosciuto da EcoRI.
Sequenze primers:
5Xotx5: GGGAATTCTTGGTCACTGAAATGATGTC
Xotx5 255: GGGAATTCACACTGAGGTGAAGCCAAGAC
Xotx5 145∆C
Anche questo costrutto, come il precedente e i costrutti di Xotx2 è stato generato tramite amplificazione per PCR di frammenti di DNA. I primers usati sono stati il primer 5Xotx5 e il primer specifico Xotx5 145.
Sequenze primers:
5Xotx5: GGGAATTCTTGGTCACTGAAATGATGTC
Xotx5 145: GGGAATTCAACTAGCTGAGGAACTAGGGG
Xotx5 99∆C
Questo costrutto è stato generato come i precedenti. Codifica per una proteina Xotx5 troncata subito dopo l’omedominio ed i primers usati sono stati 5Xotx5 e il primer Xotx5 99.
Sequenze primers:
5Xotx5: GGGAATTCTTGGTCACTGAAATGATGTC Xotx5 99: GGGAATTCACTGCTGTTGTTGCTGGCGAC
Xotx2 87NS
Questo costrutto è stato generato in maniera diversa dai precedenti. Esso deriva infatti da una mutazione nonsenso inserita nel codone che specifica l’amminoacido 87 della proteina. Tramite “QuikChangeTM Site-Direct Mutagenesis Kit” si è generata la mutazione puntiforme che ha trasformato il codone AAA nel codone TAA. In questo modo l’amminoacido 87, cioè la lisina in posizione 50 dell’omeodominio, è stato rimosso, troncando in questo modo la proteina all’amminoacido precedente. Questa transversione, che ha trasformato l’adenina in prima posizione del codone in timina, è stata realizzata inserendo oligo complementari che portavano la mutazione. Successivamente si è amplificato il resto del plasmide, generando un nuovo plasmide. Per eliminare i filamenti parentali del plasmide (quindi senza la mutazione) si è utilizzato l’enzima DpnI in grado di digerire specificamente il DNA emimetilato o metilato. I primers complementari utilizzati sono stati:
Sequenze primers:
Xotx2 87 NS F: GTCCAGGTCTGGTTCTAAAACCGCAGAGCAAAG Xotx2 87 NS R: CTTTGCTCTGCGGTTTTAGAACCAGACCTGGAC
Xotx5 87 NS
Anche questo costrutto come il precedente è stato generato tramite mutazione e anche in questo caso si è trasformata la lisina responsabile della elevata specificità di legame in un codone di stop. La mutazione introdotta è identica a quella introdotta nel costrutto di Xotx2, con un’adenina che viene sostituita da una timina. I primers utilizzati sono stati:
Xotx5 87 NS F: GTGCAGGTCTGGTTTTAAAACAGAAGGGCAAAATG Xotx5 87 NS R: CATTTTGCCCTTCTGTTTTAAAACCAGACCTGCAC
2.5 Embrioni di Xenopus laevis
(Newport e Kirschner, 1982)
Gli embrioni utilizzati sono stati ottenuti mediante la fecondazione in vitro. Il maschio viene anestetizzato immergendolo in una soluzione allo 0,1% di MS-222 (metansulfonato dell’estere etilico dell’acido 3-aminobenzoico), prima di essere operato per la rimozione dei testicoli. I testicoli possono essere conservati per qualche giorno a 4°C in MMR 1X e gentamicina (20 µg/ml).
Le femmine di Xenopus laevis vengono prestimolate con 100 UI di Folligon Intervet per uso veterinario, da 4 a 11 giorni prima della deposizione e con 800/1000 UI di Profasi HP 5000 Serono (gonadotropina corionica) 12-15 ore prima della deposizione; entrambi gli ormoni vengono somministrati tramite iniezione nel sacco perilinfatico.
La stimolazione con Profasi viene effettuata di sera e le femmine stimolate iniziano a deporre dopo circa 12 ore. Le uova da fecondare vengono ottenute esercitando una leggera pressione sull’addome degli animali e vengono raccolte in piastre Petri, contenenti MMR 0,1X. La fecondazione è effettuata tramite omogenato di testicolo in MMR 1X, disposto sulle uova da fecondare. L'avvenuta fecondazione è evidenziata dal fenomeno della rotazione corticale.
