PCR (Polymerase Chain Reaction)

(1)

TIPI DI MARCATORI

(2)

L’amplificazione è di tipo esponenziale:

ad ogni ciclo il numero di molecole di DNA bersaglio (tratto di DNA compreso tra i due primers) raddoppia. In una PCR di 40 cicli per ogni molecola di DNA inizialmente presente se ne formeranno 2⁴⁰, cioè

un numero dell’ordine di 10¹² Ogni ciclo consta di 3 fasi:

denaturazione (temp. 94° C),

appaiamento dei primer (a una temp. che dipende dalla lunghezza e dalla composizione in basi dei primer ),

sintesi di un nuovo filamento (temp. 72°C)

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Tecnica in grado di amplificare in maniera altamente specifica una regione di DNA di cui si conoscono le

sequenze fiancheggianti

(3)

Per una reazione di PCR sono necessari:

primer (forward e reverse)

dNTP (deossinucleotidi trifosfati: dATP, dCTP, dGTP e dTTP )

DNA polimerasi resistente alle alte temperature (spesso Taq polimerasi, estratta da Thermus

acquaticus)

Buffer appropriato MgCl₂

La reazione avviene in un termociclatore cioè in un blocco di alluminio che può essere riscaldato e raffreddato rapidamente

(4)

Marcatori basati sulla PCR

RAPD

(Random Amplification Polymorphic DNA)

STS

(Sequence-Tagged Sites)CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)

SCAR

(Sequenced Characterized Amplified Regions)

AFLP

(Amplified Fragment Length Polymorphisms)

SSR

(Simple Sequence Repeat)

(5)

History

• Shortly after Kary Mullis invented the Polymerase Chain Reaction (PCR) it was realized that short primers would bind to several

locations in a genome and thus could produce multiple fragments

• Williams et al. (1990) developed Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) a technique using very short 10 base primers to generate

random fragments from template DNAs

• RAPD fragments can be separated and used as genetic markers or a kind of DNA fingerprint

• Techniques related to RAPD include:

– DNA Amplification Fingerprinting (DAF) - Caetano-Anolles et al. (1991) uses very short (eight nucleotide long) primers

– Arbitrary Primed PCR (AP-PCR) - Welsh and McClelland (1990) uses

longer primers, but lowers primer annealing stringency to get priming at many sites

(6)

Components of a PCR and RAPD Reactions

RAPD

1.

Buffer (containing Mg⁺⁺) - usually high Mg⁺⁺ concentrations are used lowering annealing stringency

2.

Template DNA

3.

1 short primer (10 bases) not known to anneal to any specific part of the template DNA

4.

dNTPs

5.

Taq DNA Polymerase (or another thermally stable DNA polymerase) PCR

1.

Buffer (containing Mg⁺⁺)

2.

Template DNA

3.

2 Primers that flank the fragment of DNA to be amplified

4.

dNTPs

5.

Taq DNA Polymerase (or another thermally stable DNA polymerase)

(7)

PCR

_Melting

94 ^oC Melting

94 ^oC

Annealing Primers

50 ^oC

Extension 72 ^oC

T em p er at u re

100

0 50

T i m e

30x

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

(8)

Modifying Thermal Cycling

• Two modifications made to typical thermal cycling when RAPD is being done:

1. Annealing temperatures are generally very low, around 36

^o

C - This allows very short primers to anneal to template DNA

2. More thermal cycles are used, typically 45 - This compensates for the inefficiency which results from using such short

primers.

(9)

RAPD

Template DNA

Primer binds to many locations on the template DNA

Only when primer binding sites are close and oriented in opposite

direction so the primers point toward each other will amplification

take place

(10)

RAPD

Template DNA

Primers point away from each other, so amplification

won’t happen

(11)

RAPD

Template DNA

Primers point in

the same direction,

so amplification

won’t happen

(12)

RAPD

Template DNA

Primers too far apart, so

amplification won’t happen

> 2,000 bases

(13)

Template DNA

Primers are just the right distance apart, so fragment is amplified 100 - 1,500 bases

RAPD

(14)

M M

2 3 4 5 6 7 8 9 10

Separated RAPD Fragments

4mM MgCl² 1.2 U Taq 5 pM OPA-16

Normal

concentrations are shown in yellow text. M = A size standard

Lowering

Magnesium ion concentration results in loss of the largest

fragment visible in lanes 2-7

RAPD reactions were run in groups of 3 using the same template and primer, but varying

Magnesium, polymerase and primer

concentrations

Which variable has the greatest impact on

fragment patterns?

(15)

15

MARCATORI RAPD e AP-PCR

Figura 17.21

Esempi di profili RAPD:

A) landrace di radicchio (primer OPA1);

B) popolazione segregante di mais (primer OP-B20);

C) linea inbred di mais (primer OP-C7);

D) landrace di radicchio (primer M13).

A B

D C

17.7 MARCATORI MOLECOLARI BASATI SU TECNICHE

DI AMPLIFICAZIONE (PCR-DERIVATI)

(16)

RAPD ( Random amplification of polymorphic DNA)

Random Amplification of Polymorphic DNA. It is a type of PCR reaction, but the segments of DNA that are amplified are random.

Advantages:

• Fast

• Relatively inexpensive

• Highly variable Disadvantage:

• Markers are dominant

• Presence of a band could mean the individual is either homozygous or heterozygous for the Sequence

• Data analysis more complicated

(17)

STS (Sequence-tagged-Sites = siti riconosciuti tramite sequenza)

Sono marcatori a copia singola la cui specificità si ottiene con progettazione della PCR sulla base della sequenza target (es. sonda RFLP)

Tipi particolari di marcatori STS sono i marcatori SCAR (Sequence-

Characterized Amplified Regions = regioni amplificate e specificate dalla sequenza), ottenuti dal sequenziamento di frammenti RAPD o AFLP.

•

I marcatori STS e SCAR hanno basso polimorfismo e spesso risultano in frammenti amplificati di uguali dimensioni in diversi genotipi.

•

CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) sono marcatori STS

digeriti con uno o più enzimi di restrizione (es.4 cutter) che aumentano il livello di polimorfismo, evidenziando differenze di sequenza in frammenti con medesima lunghezza

(18)

(19)

(20)

(21)

ISSR

- ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat).

- A PCR-based molecular marker assay of genomic sequence lying between adjacent microsatellites (SSRs). Primers carrying, at their 3'-end, sequence

complementary to the repeat unit of the microsatellite

will amplify this genomic DNA.

(22)

(23)

Plant Cell Rep (2002)

20:1162–1166 DOI 10.1007/s00299-002-0450-3

M.-T. Scarano · L. Abbate · S. Ferrante · S. Lucretti N. Tusa

ISSR-PCR technique: a useful method for characterizing new allotetraploid somatic hybrids of mandarin

(24)