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Capitolo 6
DISCUSSIONI E CONCLUSIONI
Le infestazioni da strongili gastrointestinali rappresentano uno dei principali problemi sanitari e produttivi per gli allevamenti ovi-caprini in tutto il mondo in quanto causa di perdite economiche significative per la ridotta produzione di latte e lana, il decremento ponderale e l’ipofertilità che provocano negli animali parassitati (Waller, 1999; Traversa et al., 2007).
Il ricorso a molecole di sintesi rappresenta ancora il metodo più diffuso per la lotta a questa importante parassitosi; tuttavia il loro uso è attualmente connesso con alcune importanti problematiche, quali la presenza di residui nei prodotti di origine animale e nell’ambiente, lo sviluppo, sempre più frequente, di fenomeni di farmaco-resistenza, la tossicità nei confronti degli animali trattati, il costo elevato dei farmaci antielmintici (Jackson e Coop, 2000; Assis et al., 2003; Alawa et al., 2003).
Alla luce di questi problemi esiste la necessità di disporre di nuove molecole per il controllo delle malattie parassitarie che abbiano un’elevata efficacia, un’elevata biodegradabilità, una bassa tossicità, la capacità di non residuare nei tessuti e nelle secrezioni ed escrezioni degli animali trattati, una facile reperibilità ed una facile somministrazione (Douglas, 1994; Cabaret, 2002).
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Le molecole di origine naturale con attività antielmintica possono fornire un valido aiuto per aggirare, almeno in parte, tali problematiche, in quanto sono totalmente biodegradabili nell’ambiente e quindi non
provocano nessun tipo di inquinamento, non lasciano residui nei prodotti di origine animale e quindi non necessitano del rispetto di alcun periodo di sospensione e spesso sono anche facilmente reperibili ed a basso costo di produzione.
Nel presente lavoro è stata valutata l’efficacia antielmintica di alcuni composti di origine naturale nei confronti dei nematodi responsabili di strongilosi gastrointestinale dei piccoli ruminanti domestici. Sono state effettuate alcune prove in vitro in cui è stata valutata l’efficacia della quercetina alle dosi dello 0,75% e dello 0,5%, di un estratto commerciale a base di Aloe arborescens alle dosi dell’1%, dello 0,75% e dello 0,5%, dell’aloina-A alla dose dell0 0,5%, dell’aloe-emoidina alla dose dello 0,1% e dell’acido glicirretico alla dose dell’1%.
Quindi sono stati eseguiti test in vivo con i due principi che hanno mostrato maggiore efficacia in vitro.
La quercetina fa parte del gruppo dei flavonoidi e tra questi è uno dei più rappresentati nel mondo vegetale e si riscontra in numerose piante. Essa presenta attività antibatteriche in vitro ed in vivo con somministrazione orale nei confronti di Helicobacter pylori nelle cavie; dosi di 200 mg/kg di principio puro al giorno per 15 giorni in somministrazione per via orale hanno portato a riduzione dell’infezione e della risposta immunitaria (Gonzaléz-Segovia et al., 2008).
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Le piante appartenenti al genere Aloe sono conosciute da tempo per le loro proprietà medicamentose. L’Aloe vera ha mostrato attività antimetastatiche ed antimicrobiche soprattutto su lesioni cutanee dovute a bruciature (Ali et al., 1999; Ferro et al., 2003; Reynolds e Dweck, 1999), inoltre uno studio recente ha dimostrato che ha anche una certa efficacia contro la leishmaniosi (Dutta et al., 2007). Attività antiparassitaria è riportata per un estratto acquoso di Aloe barbadensis nei confronti di culture in vitro di Trichomonas vaginalis; attività antimicotica è stata osservata da parte di estratto di Aloe ferax nei
confronti di Trychophyton spp e Candida albicans, mentre componenti ad alto peso molecolare presenti nelle foglie di Aloe arborescens sembrano avere azione inibitoria nei confronti di Trychophyton
mentagrophytes; infine è dimostrata anche l’azione antimicrobica degli
atraquinoni, presenti nelle foglie dell’aloe (tra cui vi è l’aloe-emoidina), nei confronti di Bacillus subtilis (Vàzquez et al., 1996; Reynolds e Dweck, 1999; Rojas et al., 1995; Ho et al., 2007).
Per quanto riguarda l’aloe sono stati testati un estratto commerciale di
Aloe arborescens e due principi attivi presenti in questo genere di piante:
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Fig. 6.1 Pianta di Aloe
Arborescens
(www funghiitaliani it)
L’acido glicirretico è invece un triterpene che deriva dall’idrolisi della glicirrizina, un principio attivo della Glycyrrhiza glabra, ovvero della liquirizia; questa molecola ha mostrato attività antinfiammatoria e si ritiene che agisca indirettamente potenziando i corticoidi endogeni (Campanini, 2006).
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Fig. 6.2 Pianta di Glycyrrhiza Glabra.
(www.douggeivett.wordpress.com)
Per la valutazione in vitro dell’efficacia delle sostanze in esame sono stati utilizzati i test ritenuti più validi a questo scopo a livello internazionale ed ampiamente utilizzati sia per valutare l’efficacia di nuove molecole che per valutare l’antielmintico-resistenza di queste specie di parassiti nei confronti dei comuni farmaci antielmintici (Sutherland e Lee, 1990; Coles et al., 1992; Hubert e Kerboeuf, 1992; Taylor et al., 2002).
In particolare, utilizzando uova di strongili gastrointestinali isolate da campioni fecali di pecore naturalmente infestate, sono state allestite delle culture che sono state utilizzate per valutare la capacità di concentrazioni diverse delle sostanze in esame di inibire la schiusa delle uova (Egg Hatch Test o EHT), di inibire lo sviluppo larvale fino allo stadio L3
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infettante (Larval Development Test o LDT) e di determinare la morte/paralisi delle larve L3 (Larval Motility/Mortality Test o LMT). I risultati ottenuti dalle prove effettuate con i principi naturali testati sono stati confrontati con quelli ottenuti da controlli non trattati e trattati con tiabendazolo allo 0,1%, assunto come farmaco antielmintico di riferimento.
Inoltre, per ciascun test, sono stati identificati i generi coinvolti utilizzando le chiavi di identificazione fornite dal “Manual of Veterinary Parasitology Laboratory Techniques” (MAFF, 1986) e la quantità di larve per ciascun genere è stata espressa in percentuale.
Per quanto riguarda la quercetina possiamo notare come i risultati ottenuti nelle prove in vitro siano discordanti; infatti questo principio si dimostra efficace sia alla concentrazione dello 0,75% che dello 0,5% (rispettivamente del 41,91%±19,30 e del 33,11%±13,48) al test dell’inibizione della schiusa delle uova, anche se molto inferiore rispetto ai controlli trattati con tiabendazolo allo 0,1% (96,82%±3,12) mentre non ha avuto nessuna efficacia nel test dell’inibizione dello sviluppo larvale dove si hanno valori medi (rispettivamente del 4,26±0,38 per la concentrazione allo 0,75% e del 4,76±0,40 per quella allo 0,5%) addirittura inferiori a quelli del controllo non trattato (10,41±6,04). Infine, nel test della paralisi/mortalità larvale si riscontra un basso livello di efficacia sia alla concentrazione dello 0,75% (12,21±7,28) che alla concentrazione dello 0,5% (9,17%±5,80) non paragonabile a quello del tiabendazolo allo 0,1% (67,07%±1,12).
L’estratto di aloe, invece, all’EHT mostra buona efficacia a tutte e tre le concentrazioni testate (1%, 0,75%, 0,5%) con valori rispettivamente di
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73,28%±25,18, 70,58%±26,31 e 64,46%±10,65 anche se inferiore a quella del tiabendazolo allo 0,1% (100% e 94,90%±4,26); lo stesso composto alla concentrazione dell’1% ha mostrato al pari del tiabendazolo allo 0,1% un’ottima efficacia nell’inibire lo sviluppo
larvale dallo stadio L1 allo stadio L3 (100% vs 100%), mentre, nello stesso test, alla concentrazione dello 0,5% la percentuale di efficacia risulta molto inferiore (43,35%±2,34) anche se sempre efficace se paragonata al controllo non trattato (10,41%±6,04). Nel test LMT i risultati ottenuti sono un po’ discordanti, infatti si riscontra che alle concentrazioni dell’1% e dello 0,5% abbiamo una certa efficacia (rispettivamente di 61,83%±10,17 e di 48,37%±6,00) che per la concentrazione più alta è addirittura paragonabile a quella del tiabendazolo allo 0,1% (61,83±10,17 vs 67,07%±1,12), mentre alla concentrazione dello 0,75% i valori ottenuti (22,22%±5,86) non mostrano nessuna differenza statisticamente significativa con quelli del controllo non trattato (18,15%±7,99).
L’aloina-A alla concentrazione dello 0,5% mostra una blanda efficacia sull’inibizione della schiusa delle uova degli strongili all’EHT (28,86%±19,74) rispetto al tiabendazolo allo 0.1%; invece nel LDT l’efficacia di questo principio vegetale è paragonabile a quella del farmaco di riferimento (97,01%±1,85 vs 100%). Per quanto riguarda il Larval Motility Test si riscontra addirittura una maggior efficacia
dell’aloina-A allo 0,5% rispetto al tiabendazolo allo 0,1% (34,83%±30,86 vs 20,39%±9,67) nel paralizzare le larve di terzo stadio. L’aloe-emoidina alla concentrazione dello 0,1% non ha mostrato nessuna efficacia sull’inibizione della schiusa delle uova degli strongili
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gastrointestinali ma, al contrario, ha avuto un’ottima attività inibitoria sullo sviluppo larvale dal primo al terzo stadio molto prossima a quella del tiabendazolo alla concentrazione dello 0,1% (97,01%±1,85 vs 100%).
Tra quelli testati nel presente studio, il principio naturale più efficace nelle prove in vitro è stato l’acido glicirretico alla concentrazione
dell’1%, il quale in tutti e tre i test ha mostrato valori di percentuale di efficacia paragonabili a quelli del tiabendazolo alla concentrazione dello 0,1.
Alla luce dei risultati ottenuti nelle prove in vitro, possiamo notare che i principi che hanno mostrato maggiore attività antielmintica sono stati l’ estratto di aloe, l’acido glicirretico e l’aloe-emoidina; per quanto riguarda quest’ultima è da segnalare l’ottima efficacia sull’inibizione dello sviluppo larvale nel LDT anche ad un dosaggio molto basso come quello dello 0,1% utilizzato in queste prove.
Considerando il costo elevato dell’aloe-emoidina rispetto agli altri due composti, per l’esecuzione delle prove di efficacia in vivo sono stati utilizzati l’estratto di Aloe arborescens e l’acido glicirretico.
Per questa prova è stato utilizzato un piccolo gregge costituito da 15 pecore meticcie di incroci di razze da carne; gli animali sono stati suddivisi in tre gruppi: il primo composto da quattro soggetti trattati con acido glicirretico al dosaggio di 1 mg per kg di peso vivo in un'unica somministrazione, il secondo composto da cinque soggetti trattati con l’estratto di aloe al dosaggio di 1 mg per kg di peso vivo in tre somministrazioni a distanza di 24 ore l’una dall’altra; ed il terzo, infine,
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costituito da sei soggetti che hanno svolto il ruolo di controllo non trattato.
La valutazione dell’efficacia antielmintica è stata effettuata tramite il test di riduzione della conta fecale delle uova o FECRT, cioè si è effettuato un esame copro-microscopico utilizzando la tecnica di Mc Master per calcolare il numero di uova di strongili gastrointestinali per grammo di feci (UPG) sia appena prima del trattamento (giorno 0) sia 14 giorni dopo (giorno 14).
Dai risultati ottenuti è emerso che non vi è stata una riduzione significativa nel numero di uova emesse prima e dopo il trattamento pertanto i principi vegetali che abbiamo usato non hanno mostrato attività antielmintica nei confronti degli strongili gastrointestinali in vivo. Poiché sia l’estratto di aloe che l’acido glicirretico hanno mostrato un’elevata attività antielmintica nelle prove in vitro, molto probabilmente il fallimento di questi principi nelle prove sperimentali in
vivo è imputabile ad alcuni fattori di ordine farmacocinetico che possono
modificare l’efficacia delle sostanze.
Per cercare di spiegare la causa di tale inefficacia nel test in vivo possiamo elencare una serie di ipotesi secondo cui i principi utilizzati non hanno potuto esplicare le loro proprietà antielmintiche.
Il dosaggio utilizzato potrebbe essere risultato troppo basso e quindi i principi non hanno potuto arrivare a contatto con i parassiti in quantità tale da provocarne la morte, oppure potrebbero essere richieste più somministrazioni consecutive in modo da avere un contatto più prolungato nel tempo dei principi naturali con i parassiti che quindi risentirebbero maggiormente dell’effetto antielmintico.
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Un'altra causa potrebbe essere un’ eventuale metabolizzazione a livello del tratto digerente, soprattutto a livello ruminale, dei principi somministrati che potrebbero quindi venire trasformati in metaboliti inattivi; pertanto bisognerebbe ricorrere a tecniche di somministrazione che prevedano una protezione da questo fenomeno, ad esempio somministrando le sostanze in boli capaci di by-passare il rumine.
È possibile anche che non si abbia ottenuto il raggiungimento del sito d’azione perché le sostanze possono essere state assorbite a livello della mucosa del tratto digerente, oppure perché vi è stato un rapido transito nel tubo digerente ed una conseguente rapida escrezione.
Altre cause possono essere ricercate in una possibile inattivazione a livello ruminale ad opera di alcuni micro-organismi, oppure in una probabile diluizione dei principi nella massa delle ingesta.
Concludendo possiamo affermare che con questo studio è stata dimostrata l’attività antielmintica in vitro nei confronti degli strongili gastrointestinali di alcuni principi di origine naturale.
Sarebbe quindi interessante procedere in futuro con ulteriori studi, in modo da ottenere una più completa valutazione dell’efficacia di queste sostanze naturali soprattutto per quanto riguarda la valutazione della loro efficacia in vivo che tenga conto delle considerazioni fatte nel presente studio.
