Capitolo 1 Stimolazione e Monitoring delle Cellule: Dispositivi Miniaturizzati

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Capitolo 1

Stimolazione e Monitoring delle Cellule:

Dispositivi Miniaturizzati

1.1 Stimolazione cellulare: motivazioni biologiche

L'Ingegneria Tissutale (Tissue Engineering, TE) è un campo interdisciplinare in cui conoscenze ingegneristiche e conoscenze relative alle scienze della vita si uniscono per creare sostituti biologici che consentano di migliorare, di riparare, o di curare i tessuti. Una strategia di base è quella di isolare le cellule da una sorgente nativa ed espanderle in vitro, al fine di disporre di numerose cellule che possono essere successivamente seminate su uno scaffold di forma e architettura definita. Lo scaffold fornisce un supporto 2D o 3D in grado di promuovere l'accrescimento e la diversificazione delle cellule e deve possedere caratteristiche meccaniche adatte all’interazione con il tessuto che si vuole rigenerare. Il TE è diventato uno dei campi più promettenti per la medicina rigenerativa, e molti sforzi sono stati rivolti verso la ricerca di sistemi innovativi per promuovere la differenziazione delle cellule attraverso la stimolazione fisica [3]. In letteratura sono presenti molti esempi sulla medicina rigenerativa e sulla sua applicazione nel trattamento di molte patologie, ma, attualmente, esiste una netta spaccatura tra la ricerca di base e l'applicazione clinica. Le cellule in vivo sono sottoposte continuamente e simultaneamente a svariate tipologie di stimoli i quali, singolarmente o collettivamente, innescano risposte cellulari importanti per le loro funzioni biologiche. In Figura 1.1 è presente uno schema degli stimoli tipici a cui le cellule sono sottoposte in vivo. Le risposte delle cellule a specifici stimoli sono particolarmente rilevanti nel caso delle cellule staminali le quali richiedono un livello di controllo del loro ambiente extracellulare su scala micrometrica attraverso stimoli fisici e biologici per valutare gli esatti meccanismi di crescita e differenziazione. Per raggiungere questi obiettivi scientificamente importanti è stata sviluppata una grande varietà di tecniche basate su microtecnologie ai fini di creare o controllare stimoli biochimici, meccanici (ad esempio l'interazione con la matrice extracellulare), elettrici, topologici (legati alla superficie su cui vengono seminate le cellule), cellulari (interazioni cellula-cellula, ecc.), e altri vari tipi di stimolazione (termica, magnetica, ottica). Sebbene le cellule richiedano specifici stimoli per suscitare certe risposte, questi possono essere facilmente confusi da segnali di background che interferiscono con il segnale di interesse. Idealmente, sarebbero necessari dei dispositivi opportunamente ingegnerizzati che favoriscano il controllo assoluto sui segnali di stimolazione per le cellule. Tuttavia, a causa della mancanza di un'approfondita conoscenza dei tipi di segnali a cui le cellule rispondono, dei parametri principali (ad esempio frequenza,

9 ampiezza, ecc.) e a causa dell'elevata variabilità tipica dei sistemi biologici, non è semplice stabilire a priori l'entità di questi stimoli. Per questo motivo recenti sforzi di ricerca si stanno concentrando sull'isolamento degli stimoli più rilevanti[4]. Nell'ambito della microtecnologia, i ricercatori hanno iniziato ad apprezzare l'importanza del controllo delle stimolazioni multiple per valutare la risposta di vari tipi di cellule. Ad esempio, gli stimoli meccanici migliorano l'adesione cellulare grazie all'attivazione delle integrine (proteine di membrana che promuovono l'adesione). Questo tipo di stimolazione, insieme ad altri stimoli biochimici, ha come risposta ultima la differenziazione delle cellule staminali in certi fenotipi. Una profonda comprensione dei meccanismi cellulari permetterebbe una variazione sistematica e opportunamente controllata di molteplici fattori fisici. In questo capitolo verrà fatta una valutazione che riguarderà lo stato attuale dei sistemi di stimolazione e monitoraggio cellulare basati su microtecnologie. In particolar modo, vedremo quali sono i dispositivi allo stato dell’arte atti ad apportare determinati stimoli fisici alle cellule. I sistemi miniaturizzati possono garantire alle cellule stimoli fisici attraverso un ambiente controllabile e simultaneamente gli stessi dispositivi permettono di monitorare le cellule stesse e/o adattare in real time i parametri di stimolazione. Gli obiettivi che questi dispositivi si propongono di raggiungere sono [5]:

1. ottimo rapporto costo/efficacia; 2. buona controllabilità;

3. utilizzo di bassi volumi di soluzioni;

4. possibilità di effettuare più test in parallelo; 5. alta risoluzione;

10 Figura 1.1.Esempi di stimolazione del microambiente che circonda le cellule. La stimolazione singola è

ampiamente utilizzata per indagare sugli eventi di stimolazione specifici (sinistra); inoltre le stimolazioni collaterali possono interferire con la risposta cellulare specifica (in basso a sinistra). In realtà è possibile creare dei microambienti fisiologici in vitro, applicando stimoli multipli (destra). Gli stimoli multipli possono rivelare nuove risposte attraverso stimolazioni additive (f(A)+f(B)+…) o date da diverse interazioni (f(A,B,…)) (in basso a destra)

[4].

1.1.1 Micro- e nano-tecnologie in ingegneria tissutale

Le cellule rappresentano la base di approcci innovativi per la rigenerazione dei tessuti e per la costruzione di nuovi modelli per applicazioni biomediche. Come descritto nel Paragrafo 1.1, nel loro normale ambiente le cellule sono sottoposte a numerosi stimoli che variano nel tempo e nello spazio [6]. La capacità naturale delle cellule di adattarsi al loro ambiente circostante ha dei limiti ed è per questo che fino ad ora non è stato possibile generare dei tessuti complessi. Infatti uno degli inconvenienti più importanti dei sistemi attualmente disponibili per applicazioni di TE è legato alla mancanza di mezzi per creare dei percorsi adatti a dare un apporto di ossigeno, nutrienti e stimoli in maniera omogenea ad un costrutto tissutale nella sua totalità. Ne segue che, per generare costrutti capaci di replicare e sostituire accuratamente strutture ben definite ed organizzate come organi e tessuti, sono stati sviluppati recentemente nuovi tipi di

11 scaffold e dispositivi che permettono di ottenere un controllo fine sul posizionamento, l’organizzazione e l’interazione delle cellule [7]. L'Ingegneria Biomedica ha un ruolo primario nella progettazione e nello sviluppo di strumenti miniaturizzati ed opportunamente integrati capaci di fornire alle cellule una serie di stimoli fisici per controllare il loro comportamento. Le micro- e nanotecnologie negli ultimi anni stanno dando un contributo cruciale per lo sviluppo di questo campo scientifico, sia per la realizzazione di scaffold funzionalizzati con le più attuali tecniche di microfabbricazione sia per la realizzazione di dispositivi che consentono di fornire alle cellule gli stimoli necessari alla loro crescita e differenziazione. Dalla letteratura è emerso che recentemente, grazie allo sviluppo di nuove tecnologie, si stanno progettando molti microsistemi di stimolazione cellulare, tra cui i più recenti sono i sistemi di stimolazione optogenetica basati su micro-LED [7]. Le micro- e nanotecnologie consistono essenzialmente nella progettazione, caratterizzazione, produzione e applicazione di strutture, dispositivi e sistemi attraverso il controllo delle loro forme e dimensioni su scala micrometrica e nanometrica. In Figura 1.2 è messa in luce la suddivisione degli ambiti di interesse tipici dell' Ingegneria Tissutale, che dimostra come essa comprenda varie discipline e come le micro- e nanotecnologie abbiano contribuito al suo sviluppo a alle sue più recenti evoluzioni.

Figura 1.2. Schema rappresentantivo delle differenti aree di interesse dell' Ingegneria Tissutale. In evidenza ci

sono i contributi di ingresso apportati dalle micro- e nanotecnologie. Queste ultime consentono, oltre alla realizzazione di scaffold biomimetici, anche la manipolazione del microambiente extracellulare e la realizzazione di esperimenti ad alto rendimento [8].

Le micro-tecnologie rappresentano strumenti potenti per condurre il TE verso enormi cambiamenti. Ad esempio i dispositivi MEMS (Microelectromechanical Systems) possono essere usati per controllare parametri alla lunghezza di scala che oscilla tra

12 meno di 1µm fino a circa 1cm. Molti strumenti basati sulle micro- e nanotecnologie sono compatibili con le cellule e attualmente si opera per una loro integrazione con i biomateriali al fine di facilitare le interazioni tra cellule e tra cellule e dispositivo. Al tempo stesso le microtecnologie consentono di controllare l'ambiente in cui si trovano le cellule in coltura e di miniaturizzare i saggi per applicazioni ad alto rendimento [9,8]. Alcuni studi recenti hanno dimostrato l'importanza di riprodurre in vitro alcuni aspetti critici presenti nell'ambiente nativo dei tessuti da rigenerare. Pertanto, oltre alle strategie di base del TE, basate essenzialmente su cellule e scaffold, è altrettanto importante fornire al costrutto cellule-scaffold il microambiente appropriato per consentire un'efficace organizzazione del tessuto. I sistemi di coltura operano prevalentemente in condizioni di coltura statiche; è noto però che questo tipo di approccio potrebbe causare una distribuzione non omogenea di cellule e nutrienti e non riprodurre così le condizioni presenti in vivo. A tal proposito i micro-bioreattori sono sistemi che permettono di monitorare e modificare strettamente sia i processi biologici e biochimici, sia le condizioni di coltura come il pH, la temperatura, la pressione, lo shear stress e l'apporto di nutrienti,offrendo molti vantaggi per le colture cellulari [6,10]. Oltre a questi sistemi dinamici, negli ultimi venti anni si sono sviluppati dei sistemi che, pur lavorando in condizioni di coltura statiche, sono in grado di generare degli stimoli fisici (elettrici, meccanici, ecc.) tali da garantire la crescita e la differenziazione delle cellule. Nei prossimi paragrafi saranno analizzati sia i sistemi di stimolazione cellulare sia i sistemi di analisi, cercando di mettere in luce quali potranno essere i punti di forza che promuoveranno lo sviluppo del TE.

1.2 Dispositivi per la stimolazione cellulare

Le caratteristiche della matrice extracellulare (extracellular matrix, ECM), gli stimoli fisici intracellulari ed extracellulari giocano un ruolo determinante sul destino delle cellule. L’applicazione di stimoli fisici su cellule è stata oggetto di studio approfondito e, in taluni casi, di esperimenti molto sofisticati. Questi stimoli (ad esempio campi elettrici, correnti elettriche, campi magnetici, pressioni statiche o dinamiche, deformazioni meccaniche, ecc.) possono essere forniti a diverse scale, utilizzando differenti tecnologie. La stimolazione intracellulare può essere fornita alle cellule attraverso nanoparticelle attive. Le cellule possono internalizzare strutture nanometriche e biocompatibili che possono essere localizzate, a loro volta, in vacuoli o altri compartimenti citoplasmatici. È stato dimostrato che eccitando nanoparticelle internalizzate attraverso opportune sorgenti di energia esterne, è possibile rilasciare stimoli fisici all'interno delle cellule stesse [11]. Nanoparticelle possono essere utilizzate anche per rilasciare farmaci in maniera controllata ad un particolare bersaglio[12]. La stimolazione extracellulare, invece, viene effettuata attraverso dispositivi miniaturizzati (ad esempio elettrodi microfabbricati, mini-attuatori, ecc.). Per quanto riguarda la stimolazione meccanica delle cellule, questa può essere eseguita mediante dispositivi di stretching, mediante flussi indotti e mediante substrati che possono variare la loro rigidezza [13,14,15]. Attualmente, la maggior parte dei dispositivi sono progettati come tool di caratterizzazione meccanica passiva, con qualche sporadico caso di dispositivi in grado di fornire effettivamente stimoli meccanici alle cellule.

13 Benché si conosca molto circa la struttura delle cellule, poche sono le informazioni sulla meccanica cellulare e sulla risposta cellulare agli stimoli meccanici. Le cellule, infatti, possono sentire forze meccaniche e convertirle in risposte biologiche, e, viceversa, segnali biologici e biochimici influenzano l'abilità cellulare nel sentire, generare e sopportare forze di tipo meccanico.

A tal proposito dei sistemi miniaturizzati, i microattuatori MEMS (Microelectromechanical System, MEMS), che si prestano bene per stimolare meccanicamente le cellule [16,17]. La tecnologia MEMS offre numerosi vantaggi sia per costrutti 2D che per costrutti 3D alla microscala, includendo diversi materiali con differenti proprietà chimiche e fisiche come polimeri, metalli e materiali dielettrici. La scelta dei dispositivi MEMS è dovuta al fatto che essi abbiano dimensioni compatibili con le strutture cellulari (tra 100 e 300 nm) ed operativi e permettono di lavorare in ambiente liquido. Le forze di trazione e compressione negli studi di biomeccanica cellulare variano fra valori di pN e mN, le quali si possono ottenere facilmente mediante microattuatori MEMS. In Figura 1.3 è illustrato un tipico sistema MEMS in grado di stimolare meccanicamente le cellule con forze di trazione e compressione.

Lo studio di Lin et al. sull'effetto della tensione meccanica sulla neurogenesi della corteccia cerebrale si inserisce molto bene in questo ambito. Il dispositivo miniaturizzato è costituito da una membrana di PDMS, sulla quale sono state coltivate le cellule, posizionata su di un apposito sistema per l'applicazione di una sollecitazione in trazione,avente un'estremità fissa ed una mobile. Lo studio ha dimostrato che le deformazioni indotte modulano la migrazione delle cellule neurali, fattore chiave dello sviluppo della corteccia cerebrale [18].

Figura 1.3. Illustrazione di un tipico sistema MEMS per la stimolazione meccanica di colture cellulari [17].

Per quanto riguarda la stimolazione elettrica, essa è ampiamente utilizzata per studiare sia le cellule muscolari che i neuroni. Sia la contrazione muscolare sia il trasferimento di informazioni da parte dei neuroni sono infatti controllati da segnali elettrici. I segnali elettrici giocano anche un ruolo importante nel processo di guarigione delle ferite: gradienti di potenziale di circa 100 mV/mm sono stati misurati in strati epidermici sottostanti a ferite cutanee [19]. Questi esempi suggeriscono che i segnali elettrici regolano molte funzioni cellulari in vivo. Ad esempio, le cellule muscolari sono sensibili alla direzionalità del campo elettrico applicato per la loro stimolazione [20]. La

14 stimolazione elettrica in più direzioni favorisce la crescita delle cellule con la conseguente formazione di un nuovo tessuto.

Numerosi progressi sono stati ottenuti grazie alla realizzazione di interfacce elettriche capaci sia di stimolare che di monitorare i processi cellulari. Ne sono un esempio interessante i dispositivi MEA (Micro-Electrode Array), costituiti da array di microelettrodi su cui è possibile coltivare cellule o depositare dissezioni di tessuti [21]. I dispositivi MEA sono in grado di registrare biopotenziali o di segnali intra ed extra-cellulari. Un sistema MEA è essenzialmente costituito da un disco di vetro o plastica, sulla cui superficie vengono realizzati dei microelettrodi attraverso tecniche di fotolitografia [5,22]. Ogni singolo elettrodo è connesso tramite una sottile piastra isolata ad un contatto adibito al collegamento esterno del sistema. Questa linea di collegamento può essere interfacciata al calcolatore tramite appositi connettori che isolano l'intero sistema dall'ambiente esterno. In Figura 1.4 è mostrato lo schema generale di un sistema MEA e l’immagine di un sistema MEA presente in commercio prodotto dalla ALA Scientific [23].

Figura 1.4. Struttura di un dispositivo MEA. A sinistra sono illustrate le principali componenti di un generico

sistema MEA. A destra è illustrato un sistema MEA commerciale costituito da 64 elettrodi di TiN disposti in una griglia 8X8 [cm]. Il diametro degli elettrodi può essere di 10 µm o di 30 µm. [23].

Esistono diversi tipi di MEA, che, pur essendo utilizzati per il medesimo scopo, presentano caratteristiche strutturali e proprietà fisiche diverse. La distinzione deriva dal tipo di materiale impiegato nella costruzione, dalle proprietà strutturali e dal numero di alloggiamenti per singolo MEA. Ci sono, infatti, MEA che sono in grado si ospitare un solo campione e altri che permettono di registrare e stimolare contemporaneamente più campioni sia in vivo che in vitro. Le principali caratteristiche dei dispositivi MEA sono:

1. non invasività;

2. abilità di registrare attività sia di una singola cellula che di una complessa rete costituita da più cellule.

Invece i principali limiti di questi dispositivi sono:

1. utilizzo specifico per registrare; infatti nel caso della stimolazione devono essere ingegnerizzati con l'aggiunta di uno stimolatore accoppiato ad una capacità;

15 2. scarsa biocompatibilità (fenomeni di biofuling all'interfaccia elettrodo-cellula); 3. costi elevati legati alle tecniche di fabbricazione.

Interessante è il lavoro di Jimbo et al. in cui viene progettato un sistema di stimolazione multipla basato su MEA, applicando una tensione tipica (dell'ordine del Volt) per la stimolazione extra-cellulare. Questo sistema di stimolazione e registrazione è stato progettato con nuovi circuiti di interfaccia in cui sono integrati dei preamplificatori e dei transistor per effettuare uno switching tra stimolazione e registrazione [24]. Il sistema richiede, inoltre, la presenza di un PC per il controllo da remoto per ogni substrato di elettrodi; ciò non solo consente una più flessibile selezione dei siti di stimolazione, ma anche un rapido switching tra stimolazione e recording dei siti selezionati in 1.2 ms. Grazie a questo sistema è possibile fare un controllo continuo sia di stimolazione che di registrazione dei biopotenziali provenienti dalle cellule senza che ci sia interferenza tra i due tipi di segnale. In Figura 1.5 è illustrato un diagramma di un sistema MEA per stimolazione multipla. Il sistema consiste in una piastra per coltura cellulare con a bordo un array di microelettrodi di stimolazione, che variano la composizione ionica delle cellule a contatto con essi, e di registrazione dei segnali elettrici provenienti dai canali ionici delle cellule. I biopotenziali registrati da ogni singola cellula sono stati confrontati con quelli ricavati dai sistemi classici utilizzati in elettrofisiologia, per dimostrare l'efficienza del sistema.

Figura 1.5. Sistema di registrazione e stimolazione di neuroni basato su MEA. Il sistema è costituito da un

substrato MEA sul quale sono coltivati i neuroni, un sistema di stimolazione e registrazione extracellulare e in più un sistema di micro pipette per registrare l'attività dell'intera cellula. Tale substrato MEA è costituito da 64 elettrodi. Il sistema di registrazione extracellulare contiene 64 canali amplificati e un sistema di processing dei dati. La stimolazione multicanale è portata fuori attraverso 64 elettrodi. [24].

Gli elettrodi di stimolazione sono connessi ad una linea elettrica che collega l'uscita dello stimolatore agli elettrodi stessi. I fattori di cui bisogna tener conto sono numerosi, come ad esempio la compatibilità con le convenzionali tecniche di analisi elettrofisiologiche (ad esempio il patch clamp) e la possibilità di registrare un segnale con alto SNR (rapporto segnale rumore). Un tipico circuito di interfacciamento tra gli

16 ingressi del sistema di misura extracellulare e i MEA è rappresentato in Figura 1.6. Il diagramma a blocchi del circuito mostra lo switching tra stimolazione e registrazione, grazie al quale è possibile studiare i segnali biologici provenienti sia da una rete complessa di cellule che da una singola cellula [24].

Figura 1.6. Diagramma a blocchi di un circuito di interfacciamento per un sistema di stimolazione multicanale basato su MEA. Il circuito comprende un preamplificatore, un attenuatore, tre transistor che fungono da tasti e un

circuito di campionamento di tipo sample and hold [24] .

Akiyama et al. hanno realizzato un sistema di stimolazione elettrica, allo scopo di far contrarre cellule muscolari, in modo da realizzare un bio-microattuatore controllabile

[25]. Il sistema di stimolazione che è stato utilizzato per l'esperimento è mostrato in

Figura 1.7. La tensione di stimolazione utilizzata è di 50 V e la durata del segnale applicato è di 30 ms. Inoltre per evitare fenomeni di elettrolisi è stata inserita una capacità tra lo stimolatore elettrico e l'anodo di platino. L'inserimento della capacità permette di far passare solo la corrente alternata in modo che la rapida inversione di polarità agli elettrodi faccia sì che le reazioni di elettrodo si invertano di continuo e impedisca che le concentrazioni delle specie coinvolte nel passaggio di corrente cambi in modo significativo. La chiara relazione tra la frequenza dell'impulso di stimolazione e la contrazione è stata osservata al microscopio.

Figura 1.7. Schema di un sistema di stimolazione elettrica. Viene utilizzata una capacità di 220 µF per evitare

elettrolisi nel mezzo di coltura. Gli stimoli sono applicati a cellule muscolari scheletriche attraverso elettrodi di platino [25].

17 Anche Ken-ichi Yamasaki et al. hanno creato un sistema di stimolazione elettrica per il controllo della contrazione dei miotubi. Il sistema di stimolazione proposto è mostrato in Figura 1.8. La stimolazione elettrica avviene per mezzo di elettrodi in platino posizionati su un disco di policarbonato [26]. Gli elettrodi sono connessi ad un generatore di impulsi elettrici (massima tensione di uscita 10 Vpp); una resistenza viene

inserita in serie al circuito per facilitare il monitoraggio della corrente. La forma d'onda della corrente e della tensione sono controllate da un oscilloscopio. Il sistema permette la misura della distribuzione del potenziale elettrico nel mezzo di coltura privo di cellule al fine di individuare la direzione del campo elettrico atto a causare la contrazione dei miotubi. L'ampiezza della tensione decresce con il crescere della distanza dall'anodo, per questo motivo i miotubi sono posizionati al centro del disco quando la direzione e l'intensità del campo elettrico sono costanti. Grazie a questo metodo si riesce ad ottenere la confluenza delle cellule dopo 4 giorni.

Figura 1.8. Illustrazione di un sistema di stimolazione elettrica con la distribuzione del campo elettrico. A

sinistra è illustrato uno schema di un sistema di stimolazione di miotubi per un micro-bioattuatore. Le frecce indicano la direzione di applicazione del campo elettrico. Gli SWs sono gli switch che permettono di cambiare la direzione di applicazione del campo elettrico; DPDT, double pole double throw. A destra è illustrata la distribuzione del campo elettrico nel mezzo di coltura quando ancora non sono state seminate le cellule [26].

Nonostante questi sistemi permettano di stimolare e monitorare elettricamente una coltura cellulare nella sua interezza, essi non permettono di effettuare più esperimenti in parallelo.

Per effettuare più studi in parallelo si possono utilizzare le piastre per coltura cellulare costituite da più pozzetti (Figura 1.9). Uno stimolatore elettrico per la contrazione di cellule muscolari adattabile a piastre per coltura standard da 6 o da 24 pozzetti è stato progettato e testato da Marotta et al. [27]. Il sistema è in grado di stimolare in maniera efficiente la contrazione sincrona di cellule muscolari della linea C2C12 senza danneggiarle. La progettazione della configurazione elettrica non è semplice da standardizzare vista la difficoltà nel fornire in modo ripetibile la stessa intensità di corrente a tutti i pozzetti. Lo stimolatore elettrico per colture cellulari (Electrical Stimulator of Cultured Cells, ESCC) è costituito da due schede di connessione posizionate in direzione dell'asse corto delle piastre. Queste schede sono connesse ad un

18 generatore di segnale commerciale che genera impulsi elettrici variabili. Per evitare elettrolisi viene inserita una capacità di 220 µF in serie al circuito per generare così un segnale ad una polarità alternata. Gli elettrodi costituiti da fili di platino di diametro 0.25 mm sono posizionati in modo tale che le colture dei pozzetti di ogni riga possano essere uniformemente stimolate. Tali elettrodi sono connessi alle schede adiacenti alla piastra. La porzione di elettrodi immersa nel mezzo di coltura ha una forma semicircolare che si adatta alle pareti dei pozzetti. Gli elettrodi interni, detti anche elettrodi ponte, sono immersi nei pozzetti intermedi di ogni riga in modo da connetterle a due a due e dividere così le piastre in righe indipendenti. La connessione di ogni riga si può accendere o spegnere grazie alla presenza di connettori. Le condizioni di stimolazione utilizzate sono di 50 V per 30 ms ad una frequenza di 3 Hz.

Figura 1.9. Immagine dello stimolatore elettrico ESCC con il relativo schema elettrico. In a) è illustrata una

visione di insieme dello stimolatore con due schede di connessione c, che sono disposte ai lati di una normale piastra per coltura da 6 pozzetti. Le componenti interne delle schede sono indicate in figura: il condensatore Cp, gli interruttori s, e i plug per gli elettrodi p. In b) è illustrato lo schema del sistema ESCC con la posizione e la progettazione degli elettrodi collegati alle schede di connessione. A destra è rappresentato lo schema elettrico della scheda con il generatore di impulsi PG [27].

Un esempio caratteristico sulla stimolazione multipla è stato realizzato da D. Rouxel et al. che hanno introdotto un setup sperimentale per studiare gli effetti di stimolazione fisica (meccanica e/o elettrica) su cellule staminali, utilizzando piezoelettrici nanocompositi. Infatti, i materiali piezoelettrici hanno la peculiarità di combinare insieme la stimolazione meccanica e la stimolazione elettrica. Questi ricercatori hanno utilizzato sistemi da 36 pozzetti ciascuno dei quali rilascia una tensione di 100mV all'ambiente cellulare. Il dispositivo risponde alle seguenti caratteristiche [3]:

1. capacità di rilasciare una tensione elettrica alternata alle cellule; 2. biocompatibilità;

3. sistema multipozzetto;

4. possibilità di inserimento in un incubatore; 5. resistenza a corrosione in atmosfera;

19 6. superficie piatta e rigida per le cellule;

7. facilità di sterilizzazione;

8. possibilità di adattarsi a nuovi parametri;

9. rapidità di rimozione dei pozzetti in modo da effettuare test senza compromettere l'intero esperimento;

10. trasparenza per le osservazioni al microscopio.

La Figura 1.10 mostra il processo fisico di generazione della stimolazione, il tipo di elettrodi utilizzato, il setup sperimentale e il dispositivo realizzato. Gli elettrodi utilizzati sono dei trasduttori interdigitati stampati su un copolimero di PVDF. Il setup sperimentale è composto da un generatore di tensione alternata collegato ad una scheda elettrica passiva con sei uscite le quali a loro volta sono collegate ad altrettante schede aventi ognuna sei uscite.

20 Figura 1.10. Illustrazione di un sistema di stimolazione elettrica per la differenziazione cellulare. In a) e b) è

mostrato lo schema fisico di generazione della tensione e gli elettrodi costituiti da trasduttori interdigitali. In c) e d) è illustrato il setup sperimentale e la piastra a sei pozzetti con sei connessioni elettriche in uscita [3].

Infine, recentemente l'optogenetica si è affermata come nuovo, interessante settore di ricerca scientifica con importanti applicazioni in TE. L’optogenetica combina tecnologie proprie dell’ottica con quelle della genetica ed è basata sull’utilizzo di alcune proteine sensibili alla luce le quali, una volta illuminate, generano microcorrenti che attivano o disattivano i circuiti neuronali di cui si vuole studiare il funzionamento. Recentemente Hung Cao et al. hanno proposto un prototipo di un probe neurale integrato per la stimolazione optogenetica basato su microscale light-emitting diode (µLED) dotato di un sistema di microelettrodi per la registrazione simultanea dell'attività elettrica dei neuroni in vivo [28].

1.5 Microsistemi per la rilevazione dell'attività cellulare

L'analisi della funzione e della risposta cellulare al fine di comprendere al meglio la fisiologia dell'organismo umano e il comportamento delle cellule opportunamente stimolate ha avuto un notevole avanzamento grazie all’utilizzo di tecnologie avanzate. In Figura 1.11 è schematizzato un esempio di sistema di riproduzione del microambiente cellulare e i rispettivi sistemi di rilevazione dell'attività delle cellule stesse. La maggior parte dei chip basati su cellule è costituita essenzialmente da un recettore o elemento sensibile (recettori sulla superficie della cellula o canali transmembrana), da un trasduttore (la cellula stessa che metabolizza il principio attivo o risponde a stimoli producendo metaboliti, corrente o enzimi) e da veri e propri sensori che processano il segnale rendendolo leggibile [5].

21 Figura 1.11. Rappresentazione di un microambiente cellulare (cell niche). Si evidenzia una lista di stimoli ed

effetti che si evolvono nel mantenimento delle caratteristiche della cellula o nella loro differenziazione. A destra sono mostrati dei multi-sensori che permettono di effettuare un'analisi dinamica della risposta a stimoli da parte delle cellule [5].

Per la rilevazione dell'attività meccanica delle cellule una delle strategie proposte prevede l’impiego di dispositivi costituiti da sottili membrane microfabbricate, che si flettono sotto l'azione delle forze sviluppate dalle cellule. Vari algoritmi sono stati sviluppati ad hoc per l’analisi della deformazione, consentendo così la valutazione della forza esercitata da ciascuna cellula. Uno dei principali svantaggi di tale approccio è dato dal fatto che non si possono studiare cellule su substrati troppo rigidi dal momento che le membrane devono avere una rigidezza locale sufficientemente bassa da permetterne la flessione. Un approccio alternativo è stato proposto da LocKwood e Palacek con un sistema di colture cellulari a cristalli liquidi. Il sistema è composto da una griglia microfabbricata, nella quale sono stati depositati i cristalli liquidi aventi la proprietà di cambiare colore sotto azione di una forza. L'intera superficie è stata ricoperta da un sottile strato di proteine. Il sistema fornisce una regione sufficientemente rigida sulla quale le cellule possono crescere fornendo il riscontro sulle forze cellulari coinvolte [29].

Negli ultimi anni si sta assistendo ad un'evoluzione dei sistemi di recording dell'attività elettrica delle cellule. Infatti, si è passati da tecniche di misura dell'attività elettrica caratteristica di una singola cellula, sia in vivo che in vitro, attraverso micropipette di vetro o fili micrometrici, a sistemi più avanzati per lo studio simultaneo di più popolazioni di cellule. Come mostrato in Figura 1.12 le classiche tecniche usate per la rilevazione dell'attività elettrica delle cellule differiscono tra loro per il diverso tipo di elettrodi e per il modo in cui viene effettuata la misura [30]. La registrazione diretta del potenziale di transmembrana viene talvolta effettuata inserendo una micropipetta o fili micrometrici nella membrana cellulare. Nonostante questo metodo sia in grado di registrare un ampio range del segnale (fino a circa 100 mV), esso presenta un limite dovuto alla fragilità della connessione meccanica cellula-micropipetta compromettendola composizione ionica intracellulare. Per questo motivo risulta difficile effettuare una misura per lungo tempo e ottenere un biopotenziale più realistico possibile.

22 Figura 1.12. Illustrazione delle classiche tecniche di registrazione dell'attività elettrica cellulare. Per la tecnica

"whole cell patch" la registrazione intracellulare ed il monitoraggio delle caratteristiche dell'impedenza della membrana, una micropipetta viene messa in contatto con una cellula e viene applicata una piccola suzione in modo da formare un sigillo stretto. Per la " intracellular recording" la micropipetta viene inserita attraverso la membrana per misurare direttamente il potenziale interno. Per il monitoraggio e la registrazione del potenziale extracellulare la micro pipetta o il microfilo vengono posizionati vicino alla cellula stessa [30].

Le tecniche di rilevazione dell'attività elettrica delle cellule attualmente in uso rispondono a diverse caratteristiche:

1. biocompatibilità; 2. non invasività; 3. piccole dimensioni;

4. accurato circuito di read-out della misura.

In tale contesto i biosensori microelettronici basati su cellule si prestano bene a fornire una tecnologia di misura rapida, sensibile e a basso costo. Questi sensori sono dispositivi speciali che si propongono di studiare le cellule come elementi sensibili, combinati con sensori o trasduttori per registrare le condizioni del microambiente intra- ed extracellulare, i parametri fisiologici, e produrre risposte attraverso le interazioni tra gli stimoli e le cellule; essi possono essere applicati per la misura del potenziale d'azione extracellulare, dell'impedenza e dei percorsi di trasmissione dei canali ionici, come ad esempio la velocità di trasmissione dei segnali biologici lungo layer di neuroni. i principali problemi che essi presentano sono:

1. le naturali condizioni in cui le cellule vivono normalmente per lunghi periodi non possono essere mantenute continuamente e questo richiede controlli severi sui parametri fisici e chimici dell'ambiente in cui vengono coltivate;

2. il metabolismo delle cellule non può essere mantenuto perché le cellule dovrebbero essere nutrite continuamente;

23 In accordo con i metodi di trasduzione, i biosensori microelettronici basati su cellule possono essere di diversa natura: i dispositivi MEA, i sensori ECIS (electric cell-substrate impedance sensor-based), i sensori FET (field-effect transistor-based), i sensori LAPS (light adressable potentiometric sensors-based), i chip patch clamp e i chip SPR (surface plasmon resonance) [5]. In Figura 1.13 è illustrato il concetto di biosensore basato su cellule (cell based).

Figura 1.13. Diagramma schematico di un cell-based biosensor [31].

I dispositivi MEA di cui si è parlato nel Paragrafo 1.2 sono utilizzati oltre che per la stimolazione elettrica anche per la rilevazione dell'attività elettrica delle cellule. In Figura 1.4 è illustrato lo schema generale di un dispositivo MEA.

I segnali elettrici misurati nello spazio extracellulare sono dovuti al verificarsi dei seguenti eventi:

l’attività della cellula che corrisponde alla variazione della conduttanza di membrana (dovuta ai canali ionici) produce un flusso di corrente attraverso il fluido circostante;

il campo elettrico genera gradienti spaziali di potenziale.

Un dispositivo simile ai MEA, basato su microelettrodi è stato realizzato da Hiroaki Oka et al.; il sistema, denominato MED probe (Multi-Electrode Dish probe), ha lo scopo di rilevare l'attività extracellulare di una fetta importante dell'ippocampo [32]. In Figura 1.14 è illustrato il sistema sviluppato da questo gruppo di ricerca.

24 Figura 1.14. Immagine della struttura del probe MED. In A) sono rappresentati 64 microelettrodi planari disposti in un array 8x8 con una distanza interpolare di 150 µm. La superficie di ogni microelettrodo è di 50x50 µm. In B) è rappresentata la vista in sezione del MED[32].

La differenziazione delle cellule invece viene studiata attraverso sensori ECIS, che si propongono di rilevare l' impedenza delle cellule. Nei sistemi ECIS viene applicata una piccola corrente alternata (I) agli elettrodi con conseguente generazione di un potenziale (V). Quando le cellule sono seminate sugli array di elettrodi degli ECIS e sono stimolate a cambiare morfologia o a proliferare, l'impedenza Z (Z=V/I) varia al variare della copertura degli elettrodi.

I biosensori basati su FET prevedono, generalmente un substrato costituito da un singolo cristallo con due zone densamente dopate (source (S) e drain (D)) che si trovano sulla superficie superiore del cristallo. La corrente fluisce da una di queste due regioni all'altra attraverso uno stretto canale presente sul substrato stesso. I sensori FET basati su cellule possono essere classificati in due categorie: quelli che misurano il metabolismo cellulare e quelli che misurano i potenziali extracellulari [31]. Nel 1970 Bergveld fu il primo ad utilizzare i FET per la misura della concentrazione di ioni extracellulari[5]. Modificazioni successive hanno consentito di effettuare misure biochimiche (pH extracellulare, potenziale redox, consumo di ossigeno, produzione di anidride carbonica, ecc.) sfruttando le proprietà dei FET. Oltre a queste misure i FET sono stati anche utilizzati per misurare il potenziale extracellulare di cellule elettrogeniche (neuroni e cellule muscolari)[5].

I sistemi LAPS, sono dei sistemi disponibili commercialmente [33]. Essi sono utilizzati soprattutto per l'analisi della risposta di una singola cellula, per il monitoraggio di potenziali elettrici (come i dispositivi FET e MEA) e per l'analisi del metabolismo cellulare [5]. Altre applicazione dei LAPS riguardano: l’analisi delle proprietà elettrofisiologiche delle cellule, i meccanismi di signaling, i legami ligando-recettore e l'analisi farmacologica. La rilevazione real time di biomolecole intracellulari, l'attività enzimatica e il pH (facilmente ottenuti con sistemi LAPS) possono contribuire alla comprensione dei meccanismi biologici delle cellule e migliorare, di conseguenza, le tecniche di controllo dell'attività cellulare. In Figura 1.15 sono rappresentate differenti tipologie di biosensori. Ogni microchip realizzato per il sensing è capace di rilevare specifiche risposte con principi fisici differenti e diversa sensitività; in Tabella 1 sono elencati i sistemi di rilevazione costituiti da chip elettronici. L’utilizzo dei sistemi integrati ha contribuito a migliorare la comprensione dei processi cellulari e l'analisi dei processi di differenziazione e proliferazione delle cellule. Bao et al. hanno dimostrato come la microfluidica possa offrire piattaforme ideali per misure elettriche su cellule

25 [34]. I progressi tecnologici in microfluidica, in microelettronica, in elettrochimica e in elettrofisiologia hanno tracciato una linea di sviluppo verso la realizzazione di dispositivi microfluidici-elettrici che lavorano sia con un basso numero di cellule sia con cellule singole.

Tabella 1. Tabella riassuntiva dei metodi di analisi usati in differenti microchip elettronici cell- based.

Metodo di Analisi Informazione estrapolata Riferimenti

Impedenza (EICS)

Forma della cellula (normale, apoptotica, necrotica, ecc.),

motilità (migrazione, infiltrazione tumorale, invasione), differenziazione, aderenza, estensione, polarità e

integrità della membrana epiteliale.

[35]

Amperometrico (MEA) _{(metaboliti, esocitosi)} Secrezione cellulare [34]

Capacitivo (MEA) Struttura e attività della _{membrana cellulare} [36]

Potenziometrico (LAPS) cellulare, misura del potenziale Analisi del metabolismo extracellulare

[37]

Patch- clamp array Analisi dei canali ionici di una _{singola cellula} [38]

FET Corrente intracellulare/extracellulare, segnali elettrici e comunicazione cellula-cellula [39]

Indice di rifrazione (SPR) Adesione cellulare, morfologia, _motilità [40] Effetto piezoelettrico

(QCM)

Proliferazione, forma e

interazione con il substrato [41]

Per lo studio di più colture cellulari in parallelo in maniera non invasiva ed efficace, Ressler et al. hanno progettato un dispositivo per l'analisi di impedenza cellulare utilizzando una struttura con elettrodi interdigitati (Interdigital Electrode Structure, IDES) [42]. Attualmente le piastre multipozzetto sono degli strumenti standard in tutte le aree di applicazione bioanalitica. Lo stato dell'arte propone, il più delle volte, l'uso di queste piastre in sistemi di read-out ottici. Con la progettazione e la realizzazione di un sistema di sensori di impedenza adattati a piastre per coltura multipozzetto è possibile

26 studiare più colture in parallelo in maniera non invasiva e più efficace (Figura 1.16). Tale sistema è utile per misurare l'impedenza elettrica che ci dà informazione sulla crescita delle cellule e sui cambiamenti della loro morfologia [42].

Figura 1.15. Schema di tre tipologie di biochip per l'analisi dell'attività cellulare. A) Diagramma schematico di

un biosensore EICS basato su cellule; con la misura della corrente e la tensione agli elettrodi ricoperti, si può calcolare l'impedenza. Quando le cellule coprono gli elettrodi la misura dell'impedenza cambia perché la membrana cellulare blocca il flusso di corrente. B) Schema di un chip FET: l'area del gate del FET è completamente coperta da una cellula, il source e il drain sono connessi mentre B rappresenta il bulk. C) Schema di setup di un dispositivo LAPS con cellule viventi e sorgenti luminose [5].

27 Figura 1.16. Illustrazione di un tipico IDES. In a) è illustrato uno schema di un IDES e in b) è mostrato

l’adattamento di elettrodi IDES ad una piastra per coltura cellulare da 24 pozzetti [42].

In sintesi, alcuni vantaggi dell'analisi elettrica per il monitoraggio dell'attività cellulare sono i seguenti:

1. paragonata ad altri tipi di rilevazione, come la rilevazione dei segnali ottici, essa rappresenta la forma più conveniente di recording e di processing; inoltre, è possibile e facile la miniaturizzazione dei dispositivi grazie anche all'integrazione su chip microelettronici, diversamente dalle sorgenti di luce e dai sistemi di analisi ottica ;

2. la rilevazione elettrica normalmente non richiede requisiti stringenti circa l’allineamento tra l'oggetto di interesse e il rilevatore, a differenza dell'allineamento nella rilevazione ottica che risulta spesso critico;

3. le proprietà elettriche delle cellule e dei tessuti forniscono informazioni su processi specifici come le attività dei canali ionici. Questo tipo di informazione è difficile da ottenere con altri tipi di approcci;

4. la rilevazione elettrica non richiede il labeling delle cellule con molecole target, processo che risulta invasivo e spesso non garantisce l’ottenimento di dati analitici realistici a causa dello scarso adsorbimento di colorante da parte delle cellule.

1.3 Piattaforme multifunzionali e prospettive future

Per comprendere e riprodurre l'ambiente nativo delle cellule e l'influenza delle stimolazioni meccaniche ed elettriche sul comportamento cellulare, soprattutto sulla migrazione e la differenziazione, nell'ambito del TE sono sempre di più ricercate piattaforme multifunzionali per la crescita e differenziazione delle cellule in tessuti maturi.

I microsistemi creano nuove opportunità per il controllo spaziale e temporale della crescita cellulare e della stimolazione con la combinazione di superfici che mimano le proprietà biochimiche e geometriche della ECM. Inoltre l'integrazione con microsistemi

28 bioanalitici potrebbe consentire di ottenere delle piattaforme multifunzionali per la conoscenza di fenomeni cellulari e tissutali.

Un esempio di piattaforma multifunzionale per colture cellulari, proposta da El-Ali et al. comprende in un unico sistema l’insieme di numerose procedure che normalmente vengono svolte in un laboratorio per le colture cellulari. In Figura 1.17 è rappresentato il design della piattaforma [6].

Figura 1.17. Organizzazione tissutale, colture e analisi in un unico chip. Le avanzate tecniche di organizzazione

tissutale e cellulare possono essere eseguite in microsistemi grazie all'interazione di assemblati eterogenei o omogenei di cellule, di scaffold 3D per la guida alla crescita delle cellule, e sistemi microfluidici per l'apporto di nutrienti e altri fattori di crescita (ad esempio citochine). Il microsistema contiene anche numerose tecniche per l'analisi delle reazioni biochimiche nelle cellule compresa l'analisi delle immagini [6].

Questi tipi di dispositivi potranno essere ampiamente utilizzati in ricerche biomediche di base grazie alla loro multifunzionalità. Inoltre la tendenza verso sistemi sempre di più multifunzionali da applicare in TE emerge anche dalla spinta alla brevettazione. In Figura 1.18 sono mostrati due brevetti su dispositivi multifunzionali applicabili in TE.

Figura 1.18. Illustrazione di due brevetti di dispositivi cell-based. In a) è illustrato un sistema di misura passivo

delle proprietà meccaniche, elettriche ed ottiche delle cellule in coltura[43]. In b) è illustrato un brevetto di un dispositivo che comprende una camera per coltura cellulare e garantisce sia la stimolazione elettrica mediante elettrodi che il movimento meccanico[44].

29 Recentemente, Kazunori et al. hanno sviluppato un dispositivo multifunzionale Si-MEMS per la stimolazione elettrica di singole cellule muscolari scheletriche ai fini di misurarne la forza generata [45]. Il sistema è stato fabbricato come un semplice dispositivo Si-MEMS costituito da un microcantilever e una base per misurare la forza attiva generata dai miotubi derivanti da mioblasti murini della linea cellulare C2C12. Per l'integrazione dei miotubi nel dispositivo è stato seguito un particolare processo di fabbricazione.

Per quanto riguarda la contrazione muscolare dei miotubi sul dispositivo, essi generano delle forze attive per effetto di una stimolazione elettrica; è stato visto che la forza generata per una stimolazione tetanica è di circa 0.1 µN per singolo miotubo. In Figura 1.19 è rappresentato il dispositivo insieme al sistema di stimolazione elettrica e all'unità per il monitoraggio. Il dispositivo così progettato può essere utilizzato per molti studi in vitro su cellule muscolari nell' ambito della medicina rigenerativa, della fisiologia, ecc. L'assemblato è immerso in un mezzo di coltura dove i miotubi sono stati messi in coltura per sette giorni e stimolati da segnali elettrici generati elettrodi di carbonio posti su entrambi i lati del dispositivo. I segnali elettrici sono generati da un sistema costituito da un calcolatore e da amplificatori custom a diverse frequenze: 1 Hz, 2 Hz e 3 Hz. Per una stimolazione tetanica è inoltre applicato un segnale a 20 Hz per 4 secondi. La forza generata dal singolo miotubo viene misurata, osservando gli spostamenti del microcantilever con un microscopio e attraverso un'analisi di immagini effettuata al PC. Il valore della forza è stato calcolato considerando la costante elastica del microcantilever. L'andamento della forza in funzione del tempo è mostrato in Figura 1.19.

Figura 1.19. Design di un sistema di misura e risposta di cellule muscolari a stimolazione elettrica. A sinistra è

schematizzato il sistema utilizzato per analizzare la forza generata da un miotubo. A destra sono illustrati i grafici delle forze in funzione del tempo a diverse frequenze rispettivamente in blu 1 Hz, in verde 2 Hz, in arancione 3 Hz, in rosso 20 Hz [45].

30

1.4 Considerazioni riassuntive e motivazioni della scelta

La Tabella 2 riassume una possibile selezione di sistemi presenti in letteratura di cui alcuni progettati prettamente per vari tipi di stimolazione e altri prettamente per il monitoraggio dell'attività cellulare. Alcuni dispositivi si propongono di stimolare le cellule attraverso stimoli biochimici e scaffold funzionalizzati, altri utilizzano sistemi di rilevazione dell'attività cellulare in seguito a una stimolazione elettrica, altri ancora sono progettati per studiare l'attività elettrica e meccanica delle cellule stesse. Tutti questi sistemi e altri ancora presenti nello stato dell'arte hanno lo svantaggio di dover essere progettati ad hoc per lo specifico studio da effettuare. Lo scopo della presente tesi è di superare questo limite con la realizzazione di un dispositivo multifunzionale adattabile ad ogni singolo pozzetto per piastre per coltura da 24 pozzetti ai fini di stimolare uno scaffold attraverso elettroadsorption di proteine. Questo dispositivo avrà la caratteristica di implementare più funzionalità in un unico sistema, rispondendo a queste vanatggiose esigenze:

1. miniaturizzazione;

2. possibilità di effettuare più stimolazioni in un unico sistema; 3. alta integrabilità e universalità;

4. facile controllabilità; 5. utilizzo di piccoli volumi; 6. bassi costi di produzione.

31 Tabella 2. Possibili approcci per dispositivi di stimolazione e sensing cell-based.

Tipo di

Dispositivo Funzionalità

Esempi di

Dispositivi Vantaggi Svantaggi Ref.

Dispositivi per stimolazione

Apporto di nutrienti e ossigeno alle cellule Stimolazione meccanica mediante shear stress o substrati patternati Stimolazione biochimica Stimolazione intracellulare mediante nanoparticelle MEA, MEMS, Sistema di stimolazione elettrica adattato a piastre per coltura cellulare, micro-bioattuatori Dimensioni paragonabili alle cellule Fabbricazione tramite tecniche convenzionali di litografia ottica e soft lithography Apporto di nutrienti non uniforme Limitati nella stimolazione Biofouling interfaccia elettrodo-cellule [25] [27] Dispositivi di analisi Analisi dell'attività elettrica delle cellule; Analisi della crescita e della differenziazione cellulare

MEA, biosensori basati su FET,

LAPS

Possibilità di studiare reti neurali

Biocompatibilità Bassi costi Alta integrabilità Possibilità di lavorare in ambiente liquido e con bassi volumi

Monitoraggio delle cellule non invasivo Rivelazione del segnale all'interfaccia elettrodo- cellula Studio di segnali provenienti da una singola cellula [46] Dispositivi complessi su microscala Stimolazione fisica Sistemi di studio per la meccanica cellulare Applicazioni di microfluidica per colture cellulari. Microattuatori basati su cellule, microaghi, lab-on-chip, biochip basati su cellule Bassi costi Facilità di fabbricazione Integrabilità con substrati

topologicamente attivi Bassi volumi Stimolazione di singole cellule Limiti nella riproduzione del microambiente biologico [47] [28] Dispositivi complessi su macroscala Stimolazione fisica e apporto di nutrienti Analisi dell' attività cellulare

Bioreattori

Stimolazioni multiple Capacità di riprodurre in

vitro l'ambiente in cui le cellule vivono Dimensioni non paragonabili alle cellule Stimolazione non omogenea Ingombranti [44]