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4. MATERIALI E METODI
4.1 Il modello animale
Sono stati utilizzati n° 10 suini di età stimata tra 8 e 16 settimane circa appartenenti alla categoria del maiale pesante derivante da incrocio tra maschio ibrido Goland X femmina, a sua volta, incrocio tra le razze Large White X Landrace. 2
Di sesso sia maschile che femminile sono stati scelti di peso corporeo compreso tra da 24 kg a 43 kg, permettendo così l'utilizzo della strumentazione ad uso umano.
caso n. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
peso(kg) 27 32 43 43 34 30 24 32 27 30
sesso ♂ ♂ ♂ ♂ ♂ ♂ ♀ ♂ ♂ ♀
Tabella 3. Dati relativi ai suini oggetto delle procedure
Le procedure sono state eseguite con gli animali in stato di anestesia generale profonda e al termine di un altro studio sperimentaledi elettrofisiologia("Condizionamento della frequenza di depolarizzazione del nodo del seno da parte di stimolazione ventricolare destra unipolare mediante pacemaker") che non ha portato alterazioni fisiologiche tali da compromettere il nostro studio; è stato così limitato il numero di animali sacrificati a scopo scientifico.
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4.2 Strumenti per cateterismo transettale
Verranno citati solo i nomi degli strumenti le cui caratteristiche sono già state descritte in precedenza.
Catetere
Catetere transettale in RF Baylis Toronto Introduttore del catetere
Introduttore TorFlex
Generatore dienergia in radiofrequenza
BAYLIS MEDICAL COMPANY radiofrequency generator Fluoroscopioanalogico
Il fluoroscopio analogico impiegato in tale studio è: PHILIPS MEDICAL SYSTEM model MD0709BRM.
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4.3 Preparazione dell'animale e strumentazione
Ogni soggetto è stato sedato con iniezione intramuscolare dell'associazione di tiletamina cloridrato e zolazepam (Zoletil ®) 10 mg/kg e atropina 0,05 mg/kg dopo di che è stata cannulata la vena auricolare per la successiva somministrazione di propofol (1 mg/kg) i.v., infine si è proceduto all’intubazione orotracheale e con collegamento al respiratore meccanico (servo ventilator siemens elema sweden 900B). Il mantenimento dell’anestesia è stato garantito tramite miscela gassosa O2:NO (70:30) e isofluorano (1%) a 2 mg/kg/h.
La strumentazione è avvenuta con l’animale in decubito dorsale. Quattro elettrodi a placca sono stati posizionati all'estremità degli arti per il rilevamento dell'ECG di superficie. Dopo aver controllato il corretto stadio anestesiologico e il quadro elettrocardiografico si è proceduto all’isolamento chirurgico delle vene giugulari destra e sinistra (esterne ed interne) e dell'arteria carotide sinistra attraverso un' incisione longitudinale a livello della zona mediana del collo quindi si è preceduto alla loro cateterizzazione con introduttori 7 Fr. in giugulare interna sinistra, in giugulare esterna sinistra, introduttore 8 Fr. in carotide sinistra, e un CVC (Central Venous Catheter, catetere venoso centrale) in giugulare interna destra per la somministrazione di farmaci e infusioni. L’introduttore arterioso è stato collegato ad un apposito trasduttore di pressione per il rilevamento della pressione arteriosa sistemica in continuo.
La vena femorale destra è stata anch’essa isolata chirurgicamente a livello della faccia mediana della coscia.
Al termine della procedura chirurgica è stata somministrata eparina sodica alla dose di 150 U.I./kg i.v.
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4.4 Procedura di cateterismo
I- Posizionamento di cateteri radiopachi come punti di riferimento anatomici:
• inserimento di catetere in seno coronarico tramite introduttore venoso di giugulare per demarcare il limite caudo ventrale del setto interatriale;
• inserimento di catetere in auricola di atrio destro tramite introduttore venoso in giugulare ;
• inserimento di catetere in radice aortica tramite introduttore in carotide. Il corretto posizionamento è stato verificato tramite fluoroscopia.
II- Posizionamento del sistema per il transettale:
• inserimento del sistema di introduzione (introduttore e dilatatore) in vena femorale tramite tecnica di Seldinger: tramite ago per puntura venosa è stata introdotta, sotto guida fluoroscopica, una guida metallica (lunga 150 cm e di diametro 0,32’’) fino alla radice della vena cava craniale quindi viene sfilato l'ago e sulla guida viene fatto procedere il sistema di introduzione;
• avanzamento, sotto guida fluoroscopica, del sistema di introduzione in direzione caudale fino a livello della fossa ovale;
• sostituzione della guida metallica con il catetere Baylis Toronto la cui corretta posizione viene visualizzata tramite iniezione di mezzo di contrasto sotto fluoroscopia;
• emissione di energia in RF di potenza variabile tra 5W e 25W per una durata variabile tra 1" e 3" quando questo è stato posizionato, sotto fluoroscopia, a livello della fossa ovale o di altre sedi non bersaglio per la corretta cateterizzazione dell'atrio sinistro quali: parete libera di atrio destro, atrio sinistro e ventricolo destro, parete di aorta e di tronco polmonare.
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4.5 Monitoraggio intra-operatorio
Durante lo svolgimento delle procedure interventistiche ciascun animale è stato sottoposto a monitoraggio continuo dell'elettrocardiogramma e della pressione arteriosa per la valutazione emodinamica e elettrocardiografica. Gli esami emogasanalitici (GEM Premier 3000 heparinized blood only instrumentation laboratory) su sangue arterioso hanno permesso il controllo della corretta ventilazione, del quadro idroelettrolitico e dell'ematocrito. Un altro importante parametro monitorato è stato il Tempo di Coagulazione Attivato (ACT - Hemochron 401) eseguito prima del posizionamento dei vari cateteri, dopo tre minuti dalla somministrazione dell'eparina e durante le procedure di cateterismo ad intervalli regolari. L'ACT è un test specifico utilizzato in cardiochirurgia che valuta il grado di coagulabilità del sangue del paziente ovvero quantifica quanto tempo impiega il sangue intero a coagulare. È l'unico test in grado di quantificare il grado di scoagulazione dato dalla terapia eparinica a dosi elevate. Si ritiene che il valore necessario per mantenere una buona scoagulazione, indispensabile durante queste procedure, debba essere almeno il doppio del valore basale.
Al termine delle procedure di cateterismo transettale i suini sono stati tenuti in osservazione, sempre in stato di anestesia profonda, per circa 20' minuti. Durante tale intervallo di tempo è stato possibile valutare l'effetto clinico della puntura transettale in sedi errate. Gli animali sono stati poi sacrificati con iniezione endovenosa di cloruro di potassio 200 mEq (fiala da 10 ml da 20 mEq/ml).
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4.6 Valutazione anatomopatologica e istopatologia
Successivamente al sacrificio degli animali è stato eseguito l'esame autoptico con particolare attenzione alla cavità toracica. La tecnica operativa adottata per lo studio delle lesioni provocate da catetere a RF ha portato a suddividere l'esame necroscopico in due fasi: osservazione del cuore in situ ed esame dell'organo isolato.
Durante la prima fase abbiamo valutato lo stato esterno dell'organo all'interno della gabbia toracica aperta. Sono state valutate: condizione del pericardio comprese raccolte patologiche nel sacco omonimo, eventuali alterazioni di forma, volume, colore del cuore e la presenza di lesioni sia su questo che sulle strutture annesse.
Il cuore è stato poi attentamente prelevato recidendo i grossi vasi venosi ed arteriosi più distalmente possibile dal cuore ed è seguita la seconda fase dell'esame necroscopico. Per poter localizzare e valutare l'aspetto delle lesioni, sia sulla superficie epicardica che su quella endocardica, l'organo è stato parzialmente sezionato. Dal momento che la fossa ovale è stato un bersaglio quasi costante della cateterizzazione si è reso necessario valutare tale sede anatomica con particolare attenzione avendo cura di non alterare l'aspetto delle lesioni lì presenti. Per questo motivo l'apertura dell'atrio destro è stata sempre effettuata eseguendo un taglio che percorreva le vene cave creando così una breccia sulla volta dell'atrio destro. Ulteriori tagli sono stai eseguiti in punti diversi a seconda della localizzazione delle altre lesioni. Al termine dell'esame macroscopico il cuore è stato fissato, per almeno 72 ore, in formalina al 10% tamponata a pH 7.2. Le osservazioni anatomopatologiche sono proseguite anche dopo la fissazione in formalina. Durante questa fase è stata prestata particolare attenzione a confermare la localizzazione e l'entità delle lesioni riscontrate in sede necroscopica. Con il prezioso ausilio delle fotografie effettuate durante l'autopsia abbiamo confrontato l'aspetto morfologico delle lesioni già catalogate e verificato che non ne fossero state tralasciate altre. Il tessuto miocardico dopo fissazione appare più pallido quindi permette di visualizzare con maggiore facilità, per evidente contrasto cromatico, il sito lesionato. I blocchetti tissutali così ottenuti sono stati posti all'interno delle gabbiette di plastica, orientandoli, quando possibile, su un piano trasverso all'asse longitudinale della lesione in preparazione del taglio. Tali blocchetti tissutali sono stati processati per l'istologia e sezionati tramite microtomo. Per ogni blocchetto sono state allestite, ad intervalli di 30µm, un numero variabile di sezioni (da 7 a 37) in base alle localizzazione della lesione. Ogni sezione istologica, dello spessore di 4 µm, sparaffinata, è stata colorata con Ematossilina-Eosina.
