Capitolo 2 Deficit primario del trasportatore di creatina cerebrale (SLC6A8)

Capitolo 2

Deficit primario del trasportatore di

creatina cerebrale (SLC6A8)

In questo capitolo ci occuperemo più nello specifico del deficit del trasportatore della creatina, in quanto oggetto della parte sperimentale del nostro studio.

2.1 Incidenza

Riguardo all’incidenza del deficit di CTRT, alterazione trasmessa con modalità X-linked, un primo studio è stato condotto da Rosenberg nel 2004; egli ha esaminato una popolazione di 288 pazienti maschi con ritardo mentale non sindromico legato all’X: furono identificate 6 mutazioni del gene SLC6A8, di cui 5 nuove (una mutazione nonsenso e 4 missenso), con una prevalenza stimata del 2,1% (6/288). Secondo tali dati, la prevalenza del deficit di CTRT sarebbe

stata paragonabile a quella della sindrome dell’X fragile, cioè stimata del 2-3% [18].

In seguito, questa stima è stata ridimensionata dalla valutazione operata da Clark nel 2006, con uno studio condotto su 478 maschi con ritardo mentale di origine sconosciuta, sia idiopatico che all’interno di famiglie in cui era stata riconosciuta un’ereditarietà X-linked. Sono state identificate sei nuove mutazioni potenzialmente patogene (quattro delle quali appurato essere causa della sindrome), non riscontrabili nella popolazione di controllo; ciò equivale ad una prevalenza del deficit del trasportatore dell’1% circa sul totale della popolazione di maschi affetti da RM di origine ignota [19].

2.2 Pattern biochimico

I pazienti con deficit di CTRT, in conseguenza della difficoltà nel trasporto cellulare di creatina, mostrano una deplezione intracellulare di Cr e CrP, mentre la concentrazione extracellulare di Cr (misurata nelle urine) è normale o elevata [14].

- Cr nel muscolo

Il muscolo contiene più del 90% del pool di Cr dell’intero organismo. Così come avviene nel tessuto nervoso, la Cr viene estratta dal circolo contro gradiente di concentrazione grazie alla presenza di un trasporto attivo. E’ stato però osservato che pazienti con mutazione del gene CT1 hanno una concentrazione muscolare

di Cr paragonabile ai controlli: ciò può essere attribuito ad una risposta adattativa del tessuto muscolare, oppure essere in relazione con la specificità del ruolo della BEE nei riguardi del trasporto della Cr [20].

- Cr, Crn e GAA nei liquidi biologici

Il dosaggio urinario della creatina espresso per la creatinina (rapporto Cr/Crn) viene utilizzato come primo marker diagnostico del disturbo. Nei pazienti studiati, tale rapporto è generalmente aumentato da 2 a 10 volte il normale. La Cr plasmatica è di solito entro i limiti della norma; non risulta alterata neanche la concentrazione di GAA in urine e plasma, elemento che consente di escludere il deficit di Cr da alterazioni di AGAT e GAMT [5] [16] (Tab. 1). I dosaggi biochimici di Cr, Crn e GAA possono essere effettuati con cromatografia (HPLC) o con strumentazioni spettroscopiche di massa su campione di urine, su sangue eparinato o su spot di sangue essiccato su carta bibula come quello prelevato per lo screening neonatale degli errori congeniti del metabolismo [21] [22].

- Studio dell’uptake di Cr dei fibroblasti in coltura

Il deficit del CTRT può essere confermato nella diagnosi per mezzo dello studio dei fibroblasti in coltura, secondo il metodo riportato da Salomons. I fibroblasti del paziente furono incubati con Cr per misurarne l’uptake: il test dimostrò assenza di captazione a concentrazioni fisiologiche (25 µM) e di 125 µM, captazione pari ad un terzo rispetto al valore di controllo per concentrazioni di 500 µM (spiegabile con la diffusione passiva o per la funzione vicariante di altri trasportatori) [23].

Fig. 3: Uptake della Cr nei fibroblasti in coltura; a) Fibroblasti del paziente (nero) di due portatori (grigio) e di due controlli (bianco) coltivati per 24h in mezzo contenente concentrazioni crescenti di Cr; b)cellule del paziente, di portatori e di controlli, incubate con 500µM di Cr in assenza (bianco) e in presenza (grigio) di inibitore del trasportatore, il 3-guadidinopropionato. Modificato da Salomons 2001.

2.3 Clinica e revisione della letteratura

Nel 2001, Cecil riportò il caso di un paziente affetto da CDS, in cui l’assenza del picco di Cr/CrP alla risonanza si accompagnava a livelli normali nei liquidi biologici di Cr, Crn e GAA; in tale paziente, la supplementazione orale di Cr (340 mg/Kg/die per quattro mesi) non si era dimostrata efficace, ma aveva avuto il risultato di aumentare i livelli plasmatici e urinari di Cr e Crn, segno di un corretto funzionamento degli enzimi AGAT e GAMT.

Il quadro clinico all’esordio (prima osservazione a 7 mesi) consisteva in lieve ritardo dello sviluppo e ipotonia assiale; a 2 anni comparve uno stato epilettico parziale, con un EEG caratterizzato da anomalie parossistiche multifocali; alla MRI si notava una piccola area di iperintensità nella regione periventricolare posteriore destra. A 6 anni il bambino presentava un severo ritardo del linguaggio, lieve ipotonia con abilità motorie conservate, scarsa partecipazione all’ambiente ma buon aggancio oculare [24]. Il paziente era figlio unico di genitori sani, ma sia la madre che la nonna materna avevano una storia di disturbi dell’apprendimento; la madre inoltre aveva una sorella sana ed un fratello con ritardo mentale severo. La presentazione clinica e la storia familiare avvaloravano quindi la tesi di un disturbo trasmesso con modalità X-linked. Si ipotizzò il deficit del trasportatore della creatina, confermato dal riscontro di una mutazione nonsenso nella sequenza del gene SLC6A8 (traslocazione A 1539C→T, che consiste nella sostituzione di un Arginina con un codone di stop terminale). Ne risultava una proteina di 513 aminoacidi, mancante dei 122 aminoacidi C-terminali, del tutto inattiva [23].

Il primo caso in Italia di deficit del CRTR fu descritto da Bizzi nel 2002: si trattava di un bambino di 4 anni con ritardo mentale grave, assenza di linguaggio e comportamento autistico (assenza di risposta ai comandi verbali e stereotipie motorie). All’età di 16 mesi si erano manifestate crisi epilettiche parziali con secondaria generalizzazione, non più ripresentatesi a seguito di trattamento con Valproato sodico. La MRI dell’encefalo mostrava un quadro suggestivo di sclerosi mesiale dell’ippocampo [25].

Mancini nel 2005 ha riportato la storia di una famiglia olandese in cui è stata riconosciuta una nuova mutazione del gene SLC6A8: si trattava di due fratelli di 6 e 8 anni, affetti da ritardo dello sviluppo psicomotorio, disturbo del linguaggio e lieve sindrome piramidale e della loro madre, nella cui storia si erano rintracciati disturbi dell’apprendimento e del linguaggio, accompagnati da episodi epilettici, in giovane età (12-16 anni). Il maggiore dei due fratelli, nato a termine di gravidanza complicata da ipertensione di media entità, aveva mostrato un ritardo di crescita fin dal primo anno di vita (parametri auxologici inferiori a 2 DS dalla media). Acquisita la deambulazione a 22 mesi, la sua andatura si caratterizzava per passo incerto con piedi intraruotati, difficoltà nella corsa, coordinazione insufficiente; erano presenti lieve sindrome piramidale, più pronunciata a sinistra, ipotonia generalizzata e scialorrea. Nei tratti somatici si riconoscevano una fronte ampia, un naso piccolo, la rima palpebrale rivolta in basso. Il linguaggio era limitato a poche parole, frasi semplici di 3 elementi al massimo, con frequenti ecolalie e dispassia orale. Il grado di ritardo mentale si collocava tra il moderato e il severo (QI 50). Il fratello minore, al momento della prima osservazione all’età di 3 anni, non aveva ancora acquisito l’uso del linguaggio, presentava una deambulazione su base allargata, ma aveva un buon contatto con l’ambiente esterno ed un buon temperamento. Successivamente aveva mostrato progressi più significativi negli aspetti motori, con un linguaggio arrestatosi all’uso di poche parole, complicato da disartria e disprassia. La MRI del primo fratello evidenziava una dilatazione dei ventricoli laterali, una perdita di sostanza bianca a livello del corpo calloso e segni di gliosi nel corno frontale dei ventricoli, soprattutto a destra; quella del fratello minore era invece

sostanzialmente normale. Sottoposti a screening metabolico, erano risultati inalterati i valori plasmatici di aminoacidi, sialotransferrine, precursori del colesterolo, lattato, ammonio. Tuttavia, nelle urine erano elevati i livelli di alcuni aminoacidi (istidina, alanina, glicina), dei mucopolisaccaridi, degli acidi organici e dell’acido sialico [26].

Un altro caso italiano di deficit del CRTR è stato rilevato da Schiaffino, nel 2005: si tratta di un bambino figlio di genitori sani non consanguinei, giunto ad osservazione all’età di 21 mesi per un ritardo di crescita (peso, lunghezza e circonferenza cranica al di sotto del 3° percentile già alla nascita), legato a vomito ricorrente e disturbi motori. Presentava ipotonia centrale di grado medio, tono muscolare degli arti e riflessi profondi normali. Pur essendo palese il riconoscimento visivo della madre, il contatto visivo restava occasionale. Sporadicamente reagiva al richiamo vocale ed era quindi evidente una marcata chiusura relazionale. Rivalutato all’età di 2 anni e 8 mesi, il bambino restava per i parametri di peso e altezza al di sotto del 3° percentile, interessato da un ritardo globale importante, non presentando ancora parole distinguibili [27].

Nel 2005, Póo-Argüelles ha presentato due nuovi casi di deficit del trasportatore in due pazienti spagnoli con sindrome da deficit della creatina cerebrale. Il primo paziente, un bambino di 11 anni, figlio unico di genitori non consanguinei, aveva presentato il primo arresto dello sviluppo già nel primo mese di vita. Mostrava scarso interesse per l’ambiente circostante e importante ritardo nell’acquisizione del linguaggio. Dopo aver intrapreso terapia psicologica a 30 mesi, giunse alla prima osservazione all’età di 3 anni, quando ancora non aveva sviluppato il

A 6 anni, occorse la prima crisi epilettica parziale secondariamente generalizzata, seguita da altre 4 crisi, l’ultima delle quali con paralisi di Todd postictale. Se pure anche nelle successive valutazioni il linguaggio restava assente, era migliorato l’interesse comunicativo (introduzione di segni e gesti con valenze semantiche) e la comprensione di istruzioni semplici. Permaneva un ritardo di livello grave.

Il secondo paziente, un bambino di 14 anni, figlio di genitori non consanguinei, aveva mostrato all’età di 21 mesi un disturbo di tipo autistico con ritardo psicomotorio. In seguito, se sul piano delle capacità motorie si erano avuti sensibili miglioramenti, il linguaggio era progredito più lentamente e all’età di 4 anni utilizzava ancora poche parole isolate. La prima crisi parziale secondariamente generalizzata si manifestò all’età di 8 anni, ripresentandosi poi a 12 anni e mezzo, dopo un anno di sospensione della terapia, che fu di conseguenza reintrodotta. Pur essendo in definitiva migliorato il linguaggio espressivo, permanevano gravi problemi comportamentali, con iperattività, atteggiamenti ossessivo-compulsivi e aggressività [28].

Gli ultimi casi sono stati riportati da Anselm nel 2006 e si caratterizzano per la presenza di ampie delezioni genomiche, con sintomi più severi di quelli precedentemente descritti. Il primo paziente fu osservato per la prima volta all’età di 30 mesi, a causa di un difetto di crescita (difficoltà nella suzione e nella deglutizione presenti fin dalla nascita), associato a profonda ipotonia, severa distonia oromandibolare e degli arti, grave ritardo del linguaggio. Rivalutato un anno dopo, erano migliorate le condizioni generali e la distonia grazie alla terapia con BDZ e alla gastrotomia che aveva assicurato un incremento

ponderale, ma permanevano l’ipotonia e il mancato controllo del capo. A 33 mesi, inoltre fu rilevata la comparsa di movimenti coreiformi.

Il secondo paziente, figlio di genitori non consanguinei, era nato a termine di gravidanza complicatasi con oligoidramnios, ed aveva richiesto ventilazione assistita nell’immediato postpartum. Alla prima osservazione effettuata a 12 mesi, il bambino era microcefalico (50° percentile per 3 mesi), non aveva acquisito il controllo del capo, presentava severa ipotonia e deficit assiale del tronco, nonché vari caratteri dismorfici (orecchie piccole e cupoliformi, occhi incavati, palatoschisi sottomucosa, esotropia intermittente con angolo variabile). A 15 mesi fu diagnosticata un’ipoacusia neurosensoriale bilaterale; a 3 anni ha sviluppato movimenti coreoatetoidi prima intermittenti, poi più pronunciati; a 3 anni e 10 mesi è comparsa la prima crisi, sfociata in uno stato di male (epilessia in seguito controllata con successo per mezzo di fenobarbital). All’età di 4 anni permanevano difficoltà nel controllo del capo e l’assenza di un linguaggio espressivo significativo.

Tratti distintivi di questi due pazienti erano dunque i movimenti coreoatetoidi, già riportati in pazienti con deficit di GAMT ma una sola volta in caso di deficit del CRTR. Inoltre, per entrambi i bambini il quadro era stato inizialmente mascherato da indicatori di disfunzioni mitocondriali (possibile ruolo patogenetico nella CDS della deplezione energetica causata dal difetto della catena respiratoria) che avevano fatto porre una diagnosi alternativa. Infine, la gravità dei sintomi e la consistenza della delezione facevano ipotizzare una qualche correlazione genotipo/fenotipo [29].

Tab. 2 : Schema riassuntivo delle mutazioni del gene SLC6A8 (Modificata da Salomon 2001)