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Capitolo 4. PARTE SPERIMENTALE
4.1 SCOPO DELLA TESI
Il presente lavoro di tesi ha avuto lo scopo di approfondire alcuni aspetti relativi a
Pseudomonas alteranti di origine lattiero-casearia, in particolare isolati da mozzarelle
del commercio con difetti di pigmentazione anomala. La capacità pigmentante degli isolati è stata saggiata in diverse condizioni di sviluppo. Inoltre, sulla base di risultati già acquisiti nel corso di prove precedentemente eseguite presso il Laboratorio di Microbiologia degli Alimenti del Dipartimento di Scienze Veterinarie dell'Università di Pisa, è stato approfondito lo studio dell'effetto inibente di bicarbonato di sodio, dell’EDTA sale sodico e delle loro combinazioni, sullo sviluppo di alcuni isolati, già identificati come appartenenti alla specie Pseudomonas fluorescens. Infine, su due degli isolati di Pseudomonas, produttori di una pigmentazione rosa-arancio e risultati non appartenere alla specie Ps. fluorescens sulla base di evidenze genotipiche precedentemente ottenute sempre presso il Laboratorio di Microbiologia degli Alimenti (PCR specie-specifica), è stato effettuato un approfondimento identificativo tramite sequenziamento.
4.2 MATERIALI E METODI
4.2.1 MICRORGANISMI UTILIZZATI
Nelle varie prove sperimentali sono stati presi in esame complessivamente 11 isolati di Pseudomonas alteranti, provenienti da differenti campioni di mozzarelle del commercio con pigmentazione anomala, oltre ad un ceppo di referenza (Tabella 8).
64 Tabella 8. Pseudomonas impiegati nelle prove sperimentali.
Isolato Provenienza Pigmentazione
mozzarella Identificazione (PCR specie-specifica)* Ps 59 IZS Lazio-Toscana (Sez. Pisa) Blu Pseudomonas fluorescens Ps 60 IZS Lazio-Toscana (Sez. Pisa) Blu Pseudomonas fluorescens Ps 63 IZS Lazio-Toscana (Sez. Pisa) - Pseudomonas fluorescens Ps 70 IZS Lazio-Toscana (Sez. Pisa) Blu Pseudomonas fluorescens Ps 71 IZS Lazio-Toscana (Sez. Pisa) Blu Pseudomonas fluorescens Ps 231 IZS Lazio-Toscana (Sez. Pisa) Blu Pseudomonas fluorescens Ps 249 IZS Lazio-Toscana (Sez. Pisa) Blu Pseudomonas fluorescens Ps 251 IZS Lazio-Toscana (Sez. Pisa) Blu Pseudomonas fluorescens Ps 264 IZS Lazio-Toscana (Sez. Pisa) Arancio No Pseudomonas fluorescens Ps 282 IZS Lazio-Toscana (Sez. Pisa) - Pseudomonas fluorescens
PiB Dip. Scienze Veterinarie di Pisa
Rosa-Arancio No Pseudomonas
fluorescens
ATCC 13525 American Type Culture Collection
- Pseudomonas
fluorescens
*: precedentemente eseguita presso il Laboratorio di Microbiologia degli Alimenti secondo Ikeda et al. (2006), utilizzando i primer indicati da Scarpellini et al. (2004).
4.2.2 CONSERVAZIONE DEGLI ISOLATI
Gli Pseudomonas sono stati stoccati a -70°C in brodo Tryptone Soya Broth (TSB, Oxoid, Basigstoke, GB, vedi Tabella 9) con il 15% di glicerolo. Prima delle prove, gli isolati sono stati rivitalizzati in TSB.
65 Tabella 9. Composizione del Tryptone Soya Broth
(http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM0129).
FORMULA gm/litre
Pancreatic digest of casein 17.0 Enzymatic digest of soya bean*
(*contains papain) 3.0 Sodium chloride 5.0 Dipotassium hydrogen phosphate 2.5
Glucose 2.5
pH 7.3 ± 0.2 at 25°C
4.2.3
IDENTIFICAZIONE
GENOTIPICA
PER
SEQUENZIAMENTO
DEGLI
ISOLATI
DIVERSI
DA
PSEUDOMONAS FLUORESCENS
L’identificazione a livello di specie è stata eseguita tramite amplificazione di un frammento del DNA codificante l’rRNA della subunità ribosomiale 16S, utilizzando la metodica PCR descritta da Marchesi et al. (2015) dopo aver effettuato l’estrazione del DNA batterico, con successivo sequenziamento.
Per l'estrazione del DNA batterico è stato utilizzato il metodo per bollitura. In breve, la coltura overnight dell'isolato in TSB è stata centrifugata per recuperare il pellet cellulare. Un'ansata del pellet è stata risospesa in 0,5 ml di acqua bidistillata per PCR (Ultra Pure Water, BI Biological Industries, Israele) in Eppendorf e mantenuta a 95°C per 10 minuti. Dopo la bollitura è stata effettuata una centrifugazione ed il surnatante contenente il DNA estratto è stato conservato a -20°C fino al momento dell'amplificazione con PCR.
Per quanto riguarda la PCR 16S: per l'amplificazione è stato utilizzato un termociclatore LifePro (Bioer, Cina), usando per ogni campione: 13 μl di acqua, 25 μl di TaqEconoTaq® PLUS 2XMaster Mix (Lucigen, Middleton, USA), 3 μl di primer forward (63f, 5’ -CAGGCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) e 3 μl di primer reverse
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(1387r , 5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’), e 6 μl di DNA. Il programma di amplificazione era formato da 30 cicli alle seguenti condizioni:
- 95°C per 1 minuto - 55°C per 1 minuto - 72°C per 90 secondi
seguiti da un’estensione finale di 5 minuti a 72°C.
I primer amplificano un segmento di circa 1300 pb del gene 16S rRNA (Marchesi et al., 2005).
La verifica della qualità del DNA amplificato prodotto dalla PCR e la sua quantificazione sono state fatte mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio (1,5% in TAE) e successiva visualizzazione al transilluminatore per verificare la presenza della corretta banda e quantificare la quantità di DNA per confronto con il marker di riferimento (GelPilot 100 bp Plus Ladder (100), Qiagen, Hilden, Germania).
Gli amplificati sono stati inviati ad un laboratorio esterno (BMR Genomics, Padova) per il sequenziamento di Sanger. Le sequenze ottenute sono state utilizzate per l’identificazione per confronto con le sequenze più vicine nel database GenBank usando il software BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) del National Center of Biotechnology Information (NCBI).
4.2.4 STUDIO DELL’ATTIVITÀ PIGMENTANTE DEGLI
ISOLATI
La capacità di produrre pigmento a diverse temperature di sviluppo (25°C e 30°C) è stata verificata con metodo colturale sugli isolati 59, 60, 63, 70, 71, 231, 249, 251, 264, 282 e sul ceppo ATCC 13525 di Ps. fluorescens, quest’ultimo utilizzato come ceppo di referenza negativo, non pigmentante.
Gli isolati sono stati fatti sviluppare utilizzando un medium colturale minimo (Yeast Extraxt Glucose Broth, YEGB) contenente sali, ammonio come fonte di azoto (ammonio cloruro), una piccola quantità di estratto di lievito ed addizionato di glucosio come unico carboidrato. L'YEGB è stato preparato in laboratorio secondo la seguente ricetta:
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glucosio 1.5 g/L
potassio fosfato dibasico 5.2 g/L potassio fosfato monosodico 3.18 g/L magnesio solfato 0.12 g/L
estratto di lievito 0.5 g/L ammonio cloruro 0.54 g/L.
Sono stati utilizzati sia l'YEGB che la forma agarizzata, YEGA (agar 1,5%).
La stessa prova è stata inoltre eseguita su Agar Mascarpone (AM) prodotto secondo Decimo (2014), utilizzando 500 g di mascarpone, 15 g di agar e 5 g di estratto di lievito per 500 ml di acqua.
Il terreno colturale, sterilizzato a 121°C per 5 minuti, è stato seminato per strisciamento degli isolati dopo sviluppo sia in brodocoltura in YEGB che in piastra (Tryptone Soya Agar, Oxoid, TSA, vedi Tabella 10).
Tabella 10. Composizione del Tryptone Soya Agar
(http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM0131).
Formula gm/litre
Pancreatic digest of casein 15.0 Enzymatic* digest of soya bean 5.0 Sodium chloride 5.0
Agar 15.0
pH 7.3 ± 0.2 at 25°C
In tutti i casi l'incubazione è avvenuta a 25°C e a 30°C fino a 7 giorni, con controllo giornaliero.
4.2.5 STUDIO DELL'EFFETTO INIBENTE DI BICARBONATO DI
SODIO, EDTA SALE SODICO E LORO COMBINAZIONI
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Dopo un’attenta valutazione dei risultati ottenuti in laboratorio nel corso di una precedente fase di ricerca (tesi Giulia Meloni, 2015), si è deciso di approfondire lo studio di quelle, tra le sostanza saggiate, che avevano mostrato una più promettente capacità inibente sui batteri appartenenti al genere Pseudomonas.
Per queste prove sono stati impiegati gli Ps.fluorescens 59, 70, 71 e 249, oltre al ceppo ATCC 13525 della stessa specie.
Per il bicarbonato di sodio sono state utilizzate concentrazioni nel range da 12,5 a 50 mM, per l'EDTA concentrazioni nel range da 0,312 a 2,5 mg/ml. In particolare per quanto riguarda l'EDTA è stato utilizzato il sale sodico di-idrato (Na2-EDTA∙ 2 H2O).
Le prove sono state effettuate utilizzando YEGB come medium colturale. Brodocolture di 24 ore in YEGB degli isolati in esame sono state inoculate ad una diluizione finale dell'ordine di 1x104 ufc/ml in YEGB contenente le diverse dosi di sali da saggiare. Dopo un'incubazione di 24 ore a 30°C è stata effettuata la determinazione quantitativa degli Pseudomonas previo allestimento delle opportune diluizioni scalari in base 10 in soluzione fisiologica con successiva semina su TSA ed incubazione a 30°C per 48 ore. Come controlli sono state utilizzate le brodocolture dei vari isolati in YEGB senza aggiunta dei sali saggiati. Sono stati predisposti in ogni caso controlli di sterilità dei terreni colturali utilizzati.
Infine, è stata studiata l'attività inibente delle stesse sostanze su Ps. fluorescens 70 alle combinazioni bicarbonato 12,5 Mm-EDTA 0,900 mg/ml, bicarbonato 50 mM-EDTA 0,312 mg/ml, oltre che in presenza del solo EDTA alla concentrazione di 0,900 mg/ml, direttamente su mozzarella con inoculo di partenza costituito da brodocoltura di 24 ore in YEGB dello Pseudomonas in esame, diluito in fisiologica ed inoculato nel liquido di governo di mozzarella di produzione industriale, ad acidificazione chimica (Santa Lucia Galbani), in modo da ottenere una carica iniziale dell'ordine di 1x104 ufc/ml.
Dopo 3 giorni a 9-10°C, è stata effettuata la determinazione quantitativa degli
Pseudomonas su TSA da liquido di governo, come descritto sopra. Il controllo positivo
era rappresentato da mozzarella inoculata con lo stesso isolato in assenza di bicarbonato ed EDTA.
Il pH dell'YEGB e del liquido di governo della mozzarella, tal quali e dopo aggiunta delle diverse concentrazioni di bicarbonato ed EDTA, è stato determinato con un
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pHmetro (XS Instruments, pH 7 Portable Meter, Bormac s.r.l., Carpi, Modena) equipaggiato con elettrodo Haminton Double Pore. Per la calibrazione della strumentazione sono state utilizzate soluzioni tampone di valore certificato 4,00 e 7,01 (alla temperatura di 20°C).
4.3 RISULTATI E DISCUSSIONE
4.3.1 RISULTATI DEL SEQUENZIAMENTO
L’isolato PiB è risultato afferire con la più alta probabilità alla specie Ps. mosselii, mentre l’isolato 264 alla specie Ps. fragi. In Tabella 11 sono riportate le prime cinque ipotesi identificative con la relativa percentuale di identificazione. Ps. mosselii fa parte del gruppo Ps. putida: la specie Ps. putida è in grado di dare alterazioni di prodotti alimentari, ed in particolare lattiero-caseari e può anche dar luogo a pigmentazione su di essi (Cantoni et al., 2006). Ps. fragi è a sua volta un importante alterante alimentare, fa parte del gruppo Ps. chlororaphis (Anzai et al., 2000) e può produrre in alcuni casi pigmenti fluorescenti (Ramirez-Bahena et al., 2015).
Tabella 11.Prime cinque sequenze con allineamenti significativi (blast.ncbi.nlm.nih.gov, accesso 23-06-2017).
Pseudomonas PiB Pseudomonas 264
Identità* % Identità* % Pseudomonas mosselii CFML 90-83 1249/1250 99,92 Pseudomonas fragi ATCC 4973 1261/1276 98,82 Pseudomonas entomophila L48 1246/1250 99,68 Pseudomonas psychrophila E3 1260/1276 98,75 Pseudomonas taiwanensis BCRC 17751 1246/1250 99,68 Pseudomonas fragi NBRC 3458 1259/1276 98,67 Pseudomonas plecoglossicida NBRC103162 1244/1250 99,52 Pseudomonas endophytica BSTT 44 1259/1276 98,67 Pseudomonas monteilii CIP 104883 1244/1250 99,52 Pseudomonas deceptionensis M1 1253/1272 98,51
*identità: numero di basi identiche tra sequenza dell’isolato in esame e sequenza del ceppo presente nel database.
70
4.3.2
RISULTATI
DELL’ATTIVITÀ
PIGMENTANTE
E
INFLUENZA DELLA TEMPERATURA DI SVILUPPO
Come illustrato in Figura 20, su YEGA sono risultati produttori di pigmento dopo 48 ore di incubazione a 25°C tutti gli isolati in esame, ad eccezione di 63 e 282, che già in prove precedenti effettuate presso il Laboratorio di Microbiologia degli Alimenti con inoculo diretto su mozzarella, erano risultati non pigmentanti. Evidentemente, pur essendo stati isolati da “mozzarelle blu” del commercio, su tali campioni erano presenti ceppi diversi, non tutti pigmentanti. Anche il ceppo ATCC ha dato esito negativo, come atteso, essendo un ceppo di referenza non pigmentante.
Tutti i produttori di pigmento hanno dato luogo a colorazione grigio-azzurra di varia intensità sulla piastra (molto scura per i ceppi 71, 70, 231, 249, 251 ed invece meno intensa per 59 e 60), ad eccezione del 264 che ha prodotto una pigmentazione arancio, analoga a quella precedentemente sviluppata in mozzarella.
Figura 20. Attività pigmentante degli Pseudomonas in esame, in YEGA incubato per 48 ore a 25°C.
Sullo stesso terreno agarizzato a 30°C, mantenuto in incubazione fino a 7 giorni ed osservato giornalmente, non è stato possibile ottenere pigmentazione per nessuno degli isolati in esame, a dimostrazione che tale produzione risulterebbe temperatura-dipendente (Chierici et al., 2016) (Figura 21 e 22).
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Figura 22. Confronto dell’attività pigmentante degli Pseudomonas in esame, in YEGA incubato per 48 ore a 25°C (in alto) e 30°C (in basso).
Analoghi risultati sono stati ottenuti in YEGB. A 48 ore di incubazione a 25°C (Figura 23) tutti gli isolati in esame mostravano evidente sviluppo di pigmentazione (azzurro-blu per 70 e 71, grigio-azzurra più o meno intensa per 59, 60, 231, 249, 251, arancio per 264), eccetto per i non pigmentanti 63, 282 e ATCC 13525.
Figura 23. Attività pigmentante degli Pseudomonas in esame, in YEGB incubato per 48 ore a 25°C.
A 30°C gli isolati pigmentanti mostravano debole (231, 249, 251, 264) o assente (59, 60, 70, 71) pigmentazione, dimostrando che sviluppando in brodo permane ancora
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l'ostacolo alla produzione di pigmentazione a 30°C, ma in maniera meno netta rispetto a quanto verificatosi in agar (Figura 24 e 25). Era confermata anche in questo caso l'assenza di pigmento nel caso di 63, 282 e ATCC.
Figura 24. Attività pigmentante degli Pseudomonas in esame, in YEGB incubato per 48 ore a 30°C.
Figura 25. Confronto dell’attività pigmentante degli Pseudomonas in esame, in YEGB incubato per 48 ore a 25°C (in alto) e 30°C (in basso).
A 3 giorni dall’inoculo risultavano essere ancora più intense e di un evidente colore grigio-blu scuro (ad eccezione del ceppo 264, che dava un arancio ancora più vivo) le pigmentazioni sviluppate a 25°C, mentre risultavano ancora privi di colorazione anomala gli isolati non pigmentanti (63, 282 e ATCC) (Figura 26).
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Figura 26. Attività pigmentante degli Pseudomonas in esame, in YEGB incubato per 72 ore a 25°C.
A 30°C dopo 3 giorni, anche gli isolati 70 e 71 iniziavano a dare una lieve pigmentazione caratteristica, mentre non ci riuscivano il 59 ed il 60, pigmentanti, ed i restanti non pigmentanti (Figura 27 e 28).
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Figura 28. Confronto dell’attività pigmentante degli Pseudomonas in esame, in YEGB incubato per 72 ore a 25°C (in alto) e 30°C (in basso).
Gli inoculi in YEGB incubato a 25°C per 7 giorni, risultavano aver sviluppato una pigmentazione grigio scura (in particolare il 70 ed il 71) per tutti gli isolati pigmentanti, eccezion fatta per il 264 che sviluppava un colore arancio-rosso. Gli isolati non pigmentanti non dimostravano alcuna variazione di colore, come atteso (Figura 29).
Figura 29. Attività pigmentante in YEGB, incubato per 7 giorni a 25°C.
Gli isolati conservati a 30°C per 7 giorni, dimostravano uno sviluppo di pigmento, seppur lieve, esclusivamente nel caso di 231, 249, 251 e 264 (Figura 30 e 31). In tutti
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i casi di incubazione a 30°C questi isolati risultavano essere i più attivi sotto questo punto di vista.
Figura 30. Attività pigmentante degli Pseudomonas in esame, in YEGB incubato per 7 giorni a 30°C.
Figura 31. Confronto dell’attività pigmentante degli Pseudomonas in esame, in YEGB incubato per 144 ore a 25°C (in alto) e 30°C (in basso).
Tutti gli isolati in esame sono stati incubati anche in agar mascarpone a 25°C e 30°C. I risultati (Figura 32) dimostravano uno sviluppo di pigmento grigio-azzurro più o meno intenso per gli isolati 249, 251, 70 e 71, e tendente al rosso-arancio per il 264. I restanti Pseudomonas pigmentanti (60, 59 e 231), dimostravano delle difficoltà nello
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sviluppo di pigmentazione su questo substrato. Gli isolati non pigmentanti invece non deviavano dalle aspettative.
Figura 32. Attività pigmentante degli Pseudomonas in esame, in AM incubato per 96 ore a 25°C.
A 30°C i risultati (Figura 33) motrano come solo l’isolato 251 abbia iniziato a sviluppare pigmentazione. I restanti Pseudomonas, pigmentanti e non, non hanno mostrato alcuna variazione di colore.
Figura 33. Attività pigmentante degli Pseudomonas in esame, in AM incubato per 96 ore a 30°C.
4.3.3 ATTIVITÀ INIBENTE ESRCITATA DA BICARBONATO DI
SODIO ED EDTA SALE SODICO
L’attività inibente dei sali di bicarbonato di sodio ed EDTA èstata saggiata sugli isolati 59, 70, 71, 249 e sul ceppo ATCC 13525.
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Per quanto riguarda il bicarbonato di sodio, i test sono stati effettuati utilizzando diverse diluizioni del sale: 50 mM, 40 mM, 25 mM e 12,5 mM. I risultati, come riportato in Tabella 12, dimostrano che la miglior attività inibente sia stata esercitata dal bicarbonato di sodio, indubbiamente quando usato alle più alte concentrazioni (50 mM), mentre non risultano distanti i valori rinvenuti tra le altre concentrazioni ed i controlli (il batterio sviluppa fino a 10⁷ ufc/ml). I ceppi maggiormente sensibili risultano essere il 59 ed 249. In ogni caso però l’attività inibente a 50 mM è risultata buona ma non ottima. Contemporaneamente è stato anche misurato il pH del brodo YEGB, e si è visto come alte concentrazioni di bicarbonato comportino una notevole alcalinizzazione del liquido, per cui questa risulterebbe essere l’azione principale dela sale, sebbene in letteratura si riferisca anche di un’azione a livello di permeabilità della membrana batterica (Sears e Eisenberg, 1961; Jones e Greenfield, 1982).
Tabella 12. Risultati (ufc/ml) delle prove di sviluppo in YEGB degli Pseudomonas fluorescens in esame in presenza di diverse concentrazioni di bicarbonato di sodio.
Ps.
fluorescens
Bic 50mM Bic 40mM Bic 25mM Bic12,5mM Controllo
59 1,50·10⁴ 2,80·10⁷ 3,75·10⁷ 3,75·10⁷ 5,30·10⁷ 70 8,45·10⁵ 3,75·10⁷ 4,05·10⁷ 3,15·10⁷ 5,12·10⁷ 71 4,00·10⁵ 3,50·10⁷ 2,95·10⁷ 3,45·10⁷ 6,07·10⁷ 249 1,90·10⁵ 5.90·10⁷ 7,65·10⁷ 2,92·10⁷ 6,52·10⁷ ATCC 13525 4,00·10⁴ 5,70·10⁷ 1,25·10⁸ 3,71·10⁷ 5,77·10⁷ pH YEGB 8.95 8.50 7.94 7.53 6.97
Analogalmente sono state svolte prove per verificare l’attività inibente dell’EDTA sale sodico nei confronti dei ceppi di Pseudomonas 59, 70, 71, 249, e ATCC 13525. L’EDTA sale sodico è stato saggiato alle concentrazioni di: 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml, 0,9 mg/ml, 0,625 mg/ml. I risultati, come riportato in Tabella 13, dimostrano una notevole attività inibente dell’EDTA sale sodico a tutte le concentrazioni, con decrementi di 3-5 logaritmi rispetto al controllo (il batterio sviluppa fino a 10⁷ ufc/ml). Gli Pseudomonas maggiormente sensibili sono risultati essere il 59 e l’ATCC 13525. Contemporaneamente è stato anche misurato il pH del brodo YEGB, non si sono rilevati importanti variazioni del pH rispetto al controllo: l’YEGB con la più alta concentrazione saggiata (2,5 mg/ml) di EDTA sale sodico ha dimostrato infatti solo
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un modesto decremento del pH, confermando che la sua azione antibatterica segue meccanismi diversi dall’acidificazione (Sinigaglia et al., 2008; Conte et al., 2009).
Tabella 13. Risultati (ufc/ml) delle prove di sviluppo in YEGB degli Pseudomonas fluorescens in esame in presenza di diverse concentrazioni di EDTA sale sodico.
Ps. fluorescens 2,5mg/ml EDTA 1,25mg/ml EDTA 0,9mg/ml EDTA 0,625mg/ml EDTA Controllo 59 1,00·10¹ 2,75·10² 3,75·10² 5,00·10² 5,15·10⁷ 70 2,50·10² 3,50·10² 2,20·10³ 5,00·10³ 4,62·10⁷ 71 3,50·10² 1,00·10³ 1,35·10³ 1,45·10⁴ 5,87·10⁷ 249 2,40·10³ 1,22·10⁴ 1,31·10⁴ 6,00·10³ 5,45·10⁷ ATCC 13525 1,00·10¹ 3,55·10³ 2,10·10³ 5,00·10² 4,05·10⁷ pH YEGB 6.86 7.03 7.04 7.04 7.03
Infine le due sostanze sono state testate in combinazione a diverse concentrazioni, approfondendo lo studio dell’azione del bicarbonato a dosi intermedie: 25 mM+0,9 mg/ml; 12,5 mM+2,5 mg/ml; 12,5 mM+1,25 mg/ml; 12,5 mM+0,9 mg/ml; 12,5 mM+0,625 mg/ml. La prova è stata allestita come nei passaggi precedenti. I risultati, come riportato in Tabella 14, dimostrano che le combinazioni migliori sono quelle 12,5 mM+1,25 mg/ml e 12,5 mM+2,5 mg/ml, che hanno dato luogo a decrementi dai 4 ai 5 logaritmi rispetto al controllo. L’isolato maggiormente sensibile risulta essere il 71. Contemporaneamente è stato anche misurato il pH del brodo YEGB, e non si sono rilevate importanti variazioni del pH rispetto al controllo.
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Tabella 14. Risultati (ufc/ml) delle prove di sviluppo in YEGB degli Pseudomonas fluorescens in esame in presenza di diverse concentrazioni di bicarbonato di sodio ed EDTA sale sodico.
Ps. fluorescens 25mM+ 0,9mg/ml BE 12,5mM+ 2,5mg/ml BE 12,5mM+ 1,25mg/ml BE 12,5mM+ 0,9mg/ml BE 12,5mM+ 0.625mg/ml BE Controllo 59 1,00·10¹ 5,35·10³ 1,00·10¹ 2,50·10² 5,00·10² 4,48·10⁷ 70 1,50·10³ 1,00·10² 1,00·10² 2,00·10³ 8,00·10³ 3,68·10⁷ 71 4,00·10³ 2,00·10² 5,00·10¹ 1,05·10³ 5,50·10³ 5,08·10⁷ 249 3,50·10³ 1,90·10³ 1,10·10⁴ 8,85·10³ 2,50·10³ 4,75·10⁷ ATCC 13525 2,50·10³ 1,00·10¹ 1,25·10³ 7,00·10² 1,00·10² 3,70·10⁷ pH YEGB 7.76 7.27 7.34 7.39 7.45 7.02
Infine per l’isolato 70, sulla base sia delle evidenze ottenute nel corso di questa tesi che di quelle ottenute nelle prove precedentemente svolte presso il Laboratorio di Microbiologia degli Alimenti, si sono testate direttamente sul substrato mozzarella le seguenti combinazioni saline: EDTA 12,5 mM+0,9 mg/ml; bicarbonato-EDTA 50 mM+0,312 mg/ml; oltre al solo bicarbonato-EDTA alla dose di 0,9 mg/ml. Il controllo è stato allestito con mozzarella ed inoculo del microrganismo, senza sali. Le mozzarelle sono state poi incubate 3 giorni a 9-10°C. I risultati, come riportato in Tabella 15, dimostrano che la miglior attività inibente è stata esercitata dalla combinazione 50 mM+0,312 mg/ml, con valori di conteggio delle colonie inferiori di due logaritmi rispetto al controllo (il batterio sviluppa fino a 10⁷ ufc/ml).
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Tabella 15. Risultati (ufc/ml) delle prove di sviluppo di Pseudomonas fluorescens 70 in liquido di governo di mozzarella in presenza di diverse concentrazioni di bicarbonato di sodio/EDTA sale sodico.
Ps. fluorescens 50mM+ 0,312mg/ml BE 12,5mM+ 0,9mg/ml BE 0,9mg/ml Controllo 70 2,00·10⁵ 1,85·10⁷ 1,85·10⁷ 3,60·10⁷ pH 7.35 6.98 6.00 - *pH liquido di governo: 6.54
Come si può vedere dalla Tabella 15, il livello di alcalinizzazione ottenuto in liquido di governo in presenza di bicarbonato 50 mM è più contenuto, in virtù del suo contenuto salino e del relativo potere tampone. Non conoscendone l'esatta composizione non è possibile dire di più, ma sicuramente il bilanciamento tra quantità di bicarbonato-EDTA e gli altri sali diventa un elemento cruciale per far sì che il bicarbonato possa esplicare nella mozzarella il proprio effetto inibente sugli
Pseudomonas senza determinare uno squilibrio eccessivo della componente minerale,
che potrebbe avere ripercussioni negative sul prodotto, ad esempio sfaldamenti superficiali o perdita di sostanza con eccessivo intorbidimento del liquido di governo.
