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3. RISULTATI E DISCUSSIONE
3.1 Analisi microbiologica dei batteri associati alle spore di G.
intraradices IMA 6
L’analisi microbiologica dei batteri associati alle spore del fungo micorrizico G. intraradices IMA 6 ha permesso di evidenziare lo sviluppo di colonie batteriche su tutti i mezzi microbiologici utilizzati. In particolare è stata riscontrata la presenza di batteri eterotrofi coltivabili sul TSA, di batteri termo tolleranti, precedentemente sottoposti ad un trattamento termico a 80°C, sul TSAT, di attinobatteri sul Waksman agar, di batteri e funghi azoto fissatori sull’N-free Winogradsky e di batteri e funghi chitinolitici sul mezzo minimo con chitina colloidale. Tali mezzi selettivi sono stati utilizzati al fine di isolare determinati gruppi batterici che, come riportato in letteratura, sono noti per i loro caratteri PGP.
La stima della popolazione batterica e fungina è stata eseguita sulla base del numero di colonie presenti sulle piastre (UFC). I risultati in termini di UFC/200 spore sono riportati in Tabella 12.
Tabella 12: Unità formanti colonia (UFC/200 spore). I valori sono la media di tre
replicati (A, B, C) ± ES Mezzo Setacciatura A B C TSA 4.57±0.15·103 1.58±0.32·103 1.09±0.12·103 TSAT 5.83±1.31·102 3.73±0.82·102 1.52±0.71·102 Waksman 4.60±0.30·103 1.23±0.11·103 7.35±0.81·102 N-free Winogradsky (Funghi) 4.82±0.14·10 3 2.40±0.27·103 6.42±1.72·102 N-free Winogradsky (Batteri) n.r. 1.98±1.11·10 2 1.40±1.07·102 Mezzo minimo con
chitina colloidale (Funghi)
4.26±0.22·103 1.69±0.14·103 6.07±0.65·102
Mezzo minimo con chitina colloidale
(Batteri)
n.r. 3.50±2.02·101 2.10±0.20·102
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Dai risultati ottenuti è stato possibile evidenziare che le repliche sono abbondanti e simili tra di loro.
Allo scopo di isolare i microrganismi in coltura pura, le colonie sono state prelevate in maniera casuale all’interno di ciascuna morfologia. In particolare sono stati isolati 189 batteri eterotrofi, 135 attinobatteri, 27 azoto fissatori e 23 chitinolitici per un totale di 374 ceppi (Figura 8). Ciascun isolato è stato siglato con l’acronimo del terreno utilizzato seguito da un numero progressivo come riportato in Tabella 13.
Figura 8: Rappresentazione grafica del numero degli isolati: batteri eterotrofi (isolati su
TSA e TSAT), attinobatteri, azoto fissatori e chitinolitici 189 135 27 23 Eterotrofi Attinobatteri Azoto fissatori Chitinolitici
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Tabella 13: Banca di germoplasma di batteri strettamente associati al fungo micorrizico
Mezzo Isolati
TSA (98 ceppi)
1-36, 37 bianca, 37 trasparente, 38, 39, 39 bianca, 40-62, 91-107, 108 bianca, 108 trasparente, 136-141, 142 gialla, 143 bianca, 143, 144-149
TSAT (91 ceppi)
1, 2, 5 grande bianca, 5 piccola bianca, 5 bianca trasparente, 6-40, 46-49, 50 trasparente, 50 bianca, 51-55, 57-68, 91-101, 102 lucida, 102 bianca, 103-108, 109 trasparente, 110-117
W (135 ceppi)
1-42, 43 rosa, 43 bianca, 43 nera, 44-59, 60 rosa, 60 bianca, 61-82, 84-108, 110-125, 127-135
N
(27 ceppi) 1, 3, 4-14, 16, 17, 18-29 Ch
(23 ceppi) 1-3, 4, 5, 6 gialla, 6 bianca, 7–15, 16 lucida, 16 bianca, 17-21
Gli isolati sono stati inseriti nella collezione del DiSAAA-a, Laboratori di Microbiologia, a costituire una banca di germoplasma finalizzata alla loro applicazione biotecnologica in agricoltura sostenibile. Le spore fungine rappresentano un’importante nicchia ecologica per i batteri. In letteratura sono riportati alcuni lavori riguardanti l’isolamento di batteri associati ai funghi micorrizici. In particolare, Bharadwaj et al. (2007) hanno isolato i batteri dalla superficie decontaminata di spore di G. intraradices e F.
mosseae estratte dalla rizosfera di Festuca ovina e Leucanthemum vulgare;
Lecomte et al. (2011) hanno isolati i batteri dalla superficie delle spore di
G. irregolare, raccolte dalla rizosfera di Agrostis stolonifera.
Nella presente tesi i batteri sono stati preliminarmente caratterizzati dal punto di vista morfologico sia mediante osservazione delle colonie su piastra che mediante osservazione al microscopio ottico. Sulla base di queste osservazioni i batteri sono stati suddivisi in 16 differenti morfologie riportate in Tabella 14.
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Tabella 14: Caratterizzazione morfologica dei batteri isolati utilizzando i mezzi
microbiologici TSA e TSAT
Aspetto morfologico delle colonie Numero degli isolati batterici 1° Mucoide 38 2° Fluorescente 2 3° Colore arancione 1 4° Cremosi giallini 7 5° Cremosi bianchi 16 6° Grande bianca 2 7° Simile alla 6°morfologia ma più uniforme 2 8° Contorni irregolari (pallini) 33 9° Trasparente con cerchio interno 2 10°
Cerchio interno come 9°morfologia ma non trasparente 19 11° Piccola trasparente 1 12° Nebbiosa 32 13° Trasparente normale 32 14° Particolare N°1 2 15° Particolare N°2 3 16° Nebbiosa ma lucida 1
Dai risultati ottenuti è stato possibile evidenziare che le morfologie più abbondanti sono: la 1°, rappresentante il 19%, l’8° rappresentante il 17%, la 12° e la 13° che rappresentano entrambe il 16%.
In figura 9, 10, 11 e 12 sono riportate le morfologie delle colonie più numerose.
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Figura 12: Isolato batterico con
colonie aventi aspetto trasparente normale (13° morfologia)
Per quanto riguarda gli attinobatteri la preliminare caratterizzazione dal punto di vista morfologico ha permesso di evidenziare 13 diverse morfologie riportate in Tabella 15.
Figura 9: Isolato batterico con colonie
aventi aspetto mucoide (1° morfologia)
Figura 10: Isolato batterico con
colonie aventi contorni irregolari (8° morfologia)
Figura 11: Isolato batterico con
colonie aventi aspetto nebbioso (12° morfologia)
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Tabella 15: Caratterizzazione morfologica degli attinobatteri isolati utilizzando il
mezzo microbiologico Waksman agar
Aspetto morfologico delle colonie Numero degli isolati attinobatterici
1° Sotto nera sopra grigia 43
2° Sotto gialla sopra giallo
bianca 38
3° Sotto verde sopra verde
bianca 9
4° Sotto porpora sopra
porpora bianca 1
5° Sotto rosa sopra rosa 1
6° Sotto piccola marrone
sopra bianca 1
7° Sotto porpora sopra giallo
grigia 13
8° Sotto grigia verde sopra
grigia bianca 5
9° Sotto gialla marrone sopra
marrone bianca 2
10° Sotto gialla sopra gialla 2
11°
Sotto giallo scuro interno contorno bianco sopra
bianca gialla
5
12°
Sotto esterno grigio interno bianco sopra
bianco candido
1
13° Sotto nera sopra nera 4
Dai risultati ottenuti le morfologie più abbondanti sono risultate: la 1° rappresentante il 34% e la 2° rappresentante il 30%.
In figura 13, 14 e 15 sono riportate le morfologie delle colonie più numerose.
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Figura 15: Attinobatterio con colonie
aventi pigmentazione sotto porpora e sopra giallo grigia (7° morfologia)
Figura 13: Attinobatterio con colonie
aventi pigmentazione sotto nera e sopra grigia (1° morfologia)
Figura 14: Attinobatterio con colonie
aventi pigmentazione sotto gialla sopra giallo bianca (2° morfologia)
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Dai risultati ottenuti con la caratterizzazione morfologica è stata evidenziata una grande biodiversità rispetto alla piccola nicchia ecologica, in particolare per gli attinobatteri.
Nonostante alcuni attinobatteri siano stati isolati da habitat acquatici e da ambienti estremi, essi sono considerati principalmente batteri del suolo in cui costituiscono una componente significativa della popolazione microbica del terreno. In particolare il genere Streptomyces costituisce circa il 10% del totale della flora microbica nel suolo (Janssen, 2006). Gli attinobatteri sono batteri Gram positivi e filamentosi. Alcuni ceppi sono in grado di degradare polimeri biologici ma anche molecole recalcitranti la degradazione come i composti xenobiotici.. Gli attinobatteri sono microrganismi particolarmente utili per le loro possibili applicazioni nell’ambito biotecnologico in quanto sono i maggiori produttori di metaboliti secondari che hanno trovato numerose applicazioni industriali in agricoltura come erbicidi, fungicidi e insetticidi, in medicina veterinaria e umana come agenti antibatterici, antimicotici, antielmintici, immunosoppressori e antitumorali (Donadio e Marino, 2008) grazie alle caratteristiche suddette. Inoltre determinano un’importante azione di biocontrollo: ad esempio, nella difesa della pianta di pomodoro da Rhizoctonia solani e Pseudomonas solanacearum (Sabaratnam e Traquair, 2002) e nella difesa da Colletotrichum musae nelle banane (Taechowisan et al., 2003).
Nell’ambito della presente tesi a partire dai 374 isolati ne sono stati selezionati 122. In particolare sono stati scelti 38 batteri eterotrofi, 34 attinobatteri, 23 chitinolitici e 27 azoto-fissatori. Per quanto riguarda i batteri eterotrofi e gli attinobatteri la selezione è stata effettuata tenendo in considerazione i risultati della caratterizzazione morfologica. All’interno di ciascuna morfologia, la scelta è stata fatta in maniera casuale ma al tempo stesso cercando di scegliere un numero di rappresentanti che tenesse in considerazione la quantità di isolati di ciascuna morfologia.
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Successivamente i microrganismi selezionati sono stati analizzati per le loro caratteristiche PGP.
3.2. Screening delle caratteristiche PGP
Un gran numero di ceppi PGP, appartenenti a diverse classi e generi batterici, presentano caratteristiche multifunzionali che possono essere applicate per stimolare la crescita vegetale: resistenza ai metalli pesanti, produzione di fitormoni, di siderofori, azoto fissazione e capacità di solubilizzare il fosforo. Tutte queste capacità batteriche rappresentano un potenziale contributo all’adattamento della pianta (Glick, 2003).
I batteri rizosferici PGP appartengono ai generi Agrobacterium,
Arthrobacter, Azotobacter, Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Caulobacter, Chromobacterium, Erwinia, Flavobacterium, Micrococcus, Pseudomonas e Serratia (Gray e Smith, 2005). I batteri PGP comprendono
anche gli endofiti e il genere Frankia (Verma et al., 2010). Questo gruppo di batteri è costituito principalmente da Gram negativi, di forma bastoncellare e in misura minore da Gram positivi. Come riportato in letteratura, il trattamento dei semi di patate (Solanum tuberosum L.) con le sospensioni dei ceppi di P. fluorescens e P. putida ha permesso di ottenere un significativo aumento della resa dal 14 al 33%, in cinque dei nove appezzamenti di campo in California e Idaho. Allo stesso modo l’inoculazione di ceppi di Bradyrhizobium japonicum nel ravanello secco ha determinato un aumento della resa del 60% rispetto al controllo non inoculato (Haghighi et al., 2011).
I microrganismi selezionati sono stati sottoposti ad uno screening per valutare le loro caratteristiche PGP, in particolare è stata analizzata la capacità di produrre siderofori, fitormoni (IAA), di solubilizzare il fosforo e mineralizzare i fitati.
Preliminarmente, è stata necessaria la messa a punto dei protocolli di screening. A tal scopo sono stati utilizzati i ceppi Pseudomonas fluorescens
53 19/5 e Pseudomonas synxanta 3/2, isolati e caratterizzati nell’ambito di un
precedente lavoro, unitamente ai ceppi TSA 3, TSA 49, TSAT 101. Quest’ultimi sono stati selezionati in quanto in base alla loro morfologia potevano essere ascrivibili al genere Pseudomonas (TSA 49 e TSAT 101) e al genere Rhizobium (TSA 3). Per quanto riguarda gli attinobatteri sono stati utilizzati anche i ceppi W 105, W 54, W 60 e W 40 appartenenti alle quattro morfologie più numerose (rispettivamente 1°, 2°, 3° e 7°).
3.2.1. Produzione di siderofori
Il ferro è essenziale per la crescita cellulare e per il metabolismo; è presente nell’ambiente in quantità molto elevate ma è scarsamente disponibile a causa della presenza di ossigeno e condizioni di pH neutre. La rapida ossidazione del ferro ferroso (Fe2+) a ferro ferrico (Fe3+) e la successiva formazione di ossidi insolubili rendono difficile per i microrganismi e per le piante l’assunzione di tale elemento. Per questa ragione i batteri hanno acquisito la capacità di produrre i siderofori (Neilands, 1995), strutture a basso peso molecolare in grado di legare in maniera specifica il ferro trivalente. La produzione di siderofori conferisce dei vantaggi ai PGPR che possono colonizzare le radici ed escludere da questa nicchia ecologica altri microrganismi (Haas e Défago, 2005).
Nell’ambito della presente tesi la produzione di siderofori da parte dei batteri è stata evidenziata dalla formazione di un alone fluorescente, giallo-arancio, intorno le colonie cresciute, in carenza di ferro, sul mezzo microbiologico TSA al quale è stato aggiunto il colorante Chrome Asurol S (CAS). Ciò accade perché i siderofori sono costituiti da un cromoforo, che determina la fluorescenza della molecola e da una catena peptidica formata da un numero di aminoacidi variabile da 6 a 12 (Cornelis e Matthijs, 2002). Le piastre sono state osservate dopo 30 minuti, 24 e 48 ore dall’inizio della prova (Figura 16, 17). I batteri precoci hanno iniziato a produrre l’alone attorno le colonie dopo soli 30 minuti d’incubazione.
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Figura 17: Screening su piastra della produzione di siderofori da parte degli
attinobatteri dopo 30 minuti, 24h e 48 h
Figura 16: Screening su piastra della produzione di siderofori da parte dei batteri
55
I risultati ottenuti dallo screening degli isolati riguardo la loro capacità di produrre siderofori sono riportati rispettivamente in Tabella 16, 17 ,18.
Tabella 16: Risultati dello screening di produzione di siderofori di batteri eterotrofi Ceppi isolati Produzione siderofori
Attività Precocità TSA 2 - No TSA3 - No TSA 10 + No TSA 13 - No TSA 20 +++ Si W 25 - No TSA 26 - No TSA 32 - No TSA 39 bianca - No TSA 39 gialla ++ Si TSA 41 - No W 43 bianca - No W 44 +++ Si TSA 46 + Si TSA 47 - No TSA 49 +++ Si W 50 - No TSA 58 + No TSA 60 - No TSA 108 bianca +++ Si W 113 - No TSA 136 - No TSA 142 - No
TSAT 5 grande bianca - No
TSAT 7 - No TSAT 11 - No TSAT 14 + No TSAT 28 - No TSAT 38 - No TSAT 50 bianca - No TSAT 50 trasparente - No TSAT 51 - No TSAT 60 - No TSAT 92 - No TSAT 101 - No TSAT 102 bianca +++ Si TSAT 113 - No TSAT 115 - No
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Tabella 17: Risultati dello screening di produzione di siderofori degli attinobatteri Ceppi isolati Produzione siderofori
Attività Precocità W 1 ++ Si W 2 +++ Si W 19 ++ Si W 22 ++ Si W 27 ++ Si W 31 - No W 39 ++ Si W 40 - No TSAT 41 ++ No W 43 nera ++ Si W 47 ++ Si W 49 +/- No W 54 ++ Si W 56 ++ Si W 58 ++ Si W 64 ++ Si W 65 - No W 66 - No W 68 ++ Si W 69 + No W 60 rosa +/- No W 60 bianca +++ Si W 71 ++ Si W 77 ++ Si W 85 - No W 87 ++ No W 90 ++ No W 92 - No W 94 + No W 105 ++ Si W 115 ++ Si W 129 - No W 132 + No W 133 ++ Si
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Tabella 18: Risultati dello screening di produzione di siderofori di batteri chitinoliti ed
azoto fissatori
Ceppi isolati Produzione siderofori Ceppi isolati
Produzione siderofori
Attività Precocità Attività Precocità
Ch 1 + No N 1 + No Ch 2 + No N 3 + No Ch 3 - No N 4 + No Ch 4 + No N 5 + No Ch 5 + No N 6 + No Ch 6 bianco + No N 7 + No Ch 6 giallo + No N 8 + No Ch 7 - No N 9 + No Ch 8 + No N 10 + No Ch 9 - No N 11 + No Ch 10 + No N 12 + No Ch 11 + No N 13 ++ No Ch 12 + No N 14 + No Ch 13 + No N 16 +/- No Ch 14 + No N 17 ++ No Ch 15 + No N 18 + No Ch 16 lucido - No N 19 + No Ch 16 bianco - No N 20 + No Ch 17 + No N 21 + No Ch 18 + No N 22 + No Ch 19 - No N 23 + No Ch 20 + No N 24 + No Ch 21 - No N 25 + No N 26 + No N 27 + No N 28 + No N 29 + No
Dai risultati ottenuti è stato possibile evidenziare che la precocità, ossia la capacità di produrre l’alone attorno le colonie dopo soli 30 minuti di incubazione, è stata riscontrata nei batteri eterotrofi in 7 isolati su 38 totali e negli attinobatteri in 19 ceppi su 34 totali. Tale capacità non è stata evidenziata in nessun ceppo isolato di batteri chitinolitici ed azoto fissatori. La produzione di siderofori è stata valutata sulla base della grandezza dell’alone di fluorescenza attorno alle colonie (cm), considerando:
-: assenza
+/-: debole produzione (x ≤ 0,2)
58 ++: moderata produzione (0,8 < x ≤ 1,4)
+++: elevata produzione (x ≥ 1,5)
Dai risultati ottenuti è stato possibile affermare che i maggiori produttori di siderofori sono gli azoto fissatori e gli attinobatteri. Negli azoto fissatori tale produzione è stata riscontrata in tutti e 27 i ceppi isolati; in particolare i ceppi N 13 e N 17 hanno prodotto i maggiori aloni di fluorescenza mentre il ceppo N 16 ha prodotto l’alone di dimensioni minori.
Per quanto riguarda gli attinobatteri la produzione di siderofori è stata osservata in 27 ceppi su 34 totali, con una percentuale del 79%. In particolare i ceppi W 2 e W 60 bianca hanno prodotto i maggiori aloni di fluorescenza mentre i ceppi W 49 e W 60 rosa hanno prodotto gli aloni di dimensioni minori.
Nei chitinolitici tale produzione è stata osservata in 16 ceppi su 23 totale, con una percentuale del 69%. All’interno di questo gruppo microbico tutti i produttori di siderofori hanno formato degli aloni di fluorescenza di dimensioni costanti tra di loro.
Nei batteri eterotrofi la produzione di siderofori è stata riscontrata in 10 ceppi su 39 totali, con una percentuale di produzione del 25%. Nonostante la bassa percentuale di produzione, alcuni batteri eterotrofi hanno prodotto i maggiori aloni di fluorescenza, in particolare i ceppi TSA 20, W 44, TSA 49, TSA 108 bianca e il TSA 102 bianca.
In letteratura è riportato che i principali microrganismi produttori di siderofori, aventi attività PGP, appartengono ai generi: Bradyrhizobium (Khandelwal et al., 2002), Pseudomonas (Boopathi e Rao, 1999),
Rhizobium (Roy e Chakrabartty, 2000), Serratia (Kuffner et al., 2008) e Streptomyces (Kuffner et al., 2008). In particolare il batterio Pseudomonas fluorescens e il fungo Rhizopus arrhizus possono fornire ferro alle piante
per mezzo dei siderofori definiti, rispettivamente, pioverdine e rizoferrine (Vansuyt. et al., 2007).
59 3.2.2. Attività fosfatasica e fitasica
Il fosforo (P) è uno dei nutrienti minerali essenziali per la crescita e lo sviluppo delle piante (costituisce fino allo 0,2% del peso secco della cellula vegetale). Svolge ruoli importanti nella regolamentazione dei processi, a livello strutturale e nel trasferimento di energia, di conseguenza è necessario in quantità significative (Schachtman et al., 1998). Le piante possiedono molte classi di proteine in grado di trasportare il fosfato, comprese quelle che vengono espresse solo in simbiosi con i funghi micorrizici arbuscolari (AMF) (Javot et al., 2007). La presenza nella pianta di un trasportatore di fosforo rappresenta un segnale che permette un continuo sviluppo arbuscolare e la persistenza fungina all’interno della radice (Bonfante et al., 2009). Il fosforo esiste in due forme nel terreno: come fosfato organico ed inorganico. La concentrazione di fosforo solubile presente nel suolo è generalmente molto bassa; le piante assorbono il fosforo soprattutto nella forma dibasica HPO4-2 o monobasica HPO4-1. Il
fenomeno di fissazione del fosforo e precipitazione nel suolo è dipendente dal pH e dal tipo di terreno. I ceppi batterici appartenenti ai generi
Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Burkholderia, Achromobacter, Agrobacterium, Micrococcus, Aerobacter, Flavobacterium e Erwinia hanno
la capacità di solubilizzare i fosfati inorganici insolubili (fosfato minerale) rappresentati da composti come il fosfato tricalcico, il fosfato bicalcico e l’idrossiapatite (Rodrìguez et al., 2006). I ceppi del genere Pseudomonas,
Bacillus e Rhizobium sono tra i più efficienti solubilizzatori del fosfato,
mentre il fosfato tricalcico e l’idrossiapatite sembrano essere i substrati più facilmente degradabili del fosfato (Banerjee et al., 2006). Il meccanismo più comune utilizzato dai microrganismi per solubilizzare il fosfato tricalcico sembra essere quello di acidificare il mezzo tramite il rilascio di una vasta gamma di acidi organici (Delvasto et al., 2008). I maggiori componenti del fosforo organico nel suolo sono i fitati che consistono principalmente nell’inositol penta- e esa- fosfati (IHP, Dalal, 1977). Per
60
diventare disponibile per le piante, il fitato deve essere defosforilato (Richardson, 2001). La defosforilazione avviene ad opera di enzimi come la fosfatasi (fosfoidrolasi) e la fitasi. È stato visto che l’attività fitasica derivante dai microrganismi del suolo come Pseudomonas sp. (Richardson
et al.,2000) e Bacillus amyloliquefaciens (Idriss et al., 2002) può
contribuire alla nutrizione della pianta.
Nella presente tesi lo screening dei batteri in grado di solubilizzare il fosfato ha previsto l’utilizzo di un mezzo microbiologico specifico (NBRIP) sul quale si attendeva la formazione di un alone visibile (Figura 18). Per quanto riguarda l’analisi dell’attività fitasica è stata svolta utilizzando tre mezzi differenti: MPSM, PSM e PSMG. Nei primi due terreni colturali l’Na-IHP (Na-inositolo esa-fosfato) rappresentava l’unica fonte di carbonio e fosforo in quanto l’acido fitico (IHP) è formato da uno zucchero (simile al glucosio) chiamato mio-inositolo a cui sono legati covalentemente i gruppi fosfato (PO4). Nel PSMG oltre all’ Na-fitato è stato addizionato anche il
glucosio; solamente su quest’ultimo mezzo è stata riscontrata la formazione di aloni di chiarificazione attorno le colonie, grazie alla capacità microbica di utilizzare il glucosio come fonte di carbonio e, successivamente, degradare il Na-fitato (Figura 19).
61
Figura 18: Screening su piastra della solubilizzazione del fosfato inorganico da parte
62
Per quanto riguarda la capacità microbica di mineralizzare il Na-fitato e solubilizzare il fosfato di calcio, presenti rispettivamente nei mezzi PSMG e NBRIP, è stata evidenziata con lo sviluppo di un alone chiaro attorno le colonie, in seguito ad un’incubazione per una settimana a 28°C. Dopo 14 giorni in entrambi i mezzi è stato misurato il diametro della colonia, il diametro dell’alone e l’halo zone, ossia la differenza tra il diametro totale (alone e colonia) e il diametro della colonia. Per quanto riguarda l’attività fosfatasica è stata valutata l’efficienza di solubilizzazione del fosfato (SE) con la seguente formula (Rokhbakhsh-Zamin et al., 2011):
SE = [Halo zone (z)/ Diametro della colonia (n)] x 100
Oltre all’efficienza di solubilizzazione è stato calcolato anche l’indice di solubilizzazione del fosfato attraverso la formula (Tofazzal et al., 2007):
63
PSI = Diametro totale (colonia + alone)/ Diametro della colonia I risultati ottenuti dallo screening dell’attività fosfatasica e fitasica degli isolati sono riportati di seguito nelle Tabelle 19, 20, 21, 22.
Tabella 19: Risultati dello screening dell’attività fosfatasica e fitasica dei batteri
eterotrofi. SE=Efficienza di solubilizzazione, PSI=Indice di solubilizzazione Ceppi isolati Attività fosfatasica Attività fitasica
SE PSI Halo zone (cm)
TSA 2 - - - TSA3 115,38 2,15 0,85 TSA 10 35,71 1,36 0,85 TSA 13 - - - TSA 20 - - 0,40 W 25 - - 0,20 TSA 26 81,82 1,82 0,90 TSA 32 - - - TSA 39 bianca - - - TSA 39 gialla - - 0,40 TSA 41 150 2,50 0,70 W 43 bianca - - 0,45 W 44 - - 0,35 TSA 46 11,76 1,12 0,25 TSA 47 - - - TSA 49 - - 0,40 W 50 - - - TSA 58 - - - TSA 60 - - - TSA 108 bianca - - 0,65 W 113 - - - TSA 136 - - - TSA 142 - - 0,35
TSAT 5 grande bianca - - -
TSAT 7 - - - TSAT 11 - - 0,15 TSAT 14 - - - TSAT 28 - - - TSAT 38 - - - TSAT 50 bianca - - - TSAT 50 trasparente - - - TSAT 51 - - 0,25 TSAT 60 - - - TSAT 92 - - 0,30 TSAT 101 - - 0,20 TSAT 102 bianca 16,67 1,17 0,35 TSAT 113 - - - TSAT 115 - - -
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Tabella 20: Risultati dello screening dell’attività fosfatasica e fitasica degli
attinobatteri. SE=Efficienza di solubilizzazione, PSI=Indice di solubilizzazione Ceppi isolati Attività fosfatasica Attività fitasica
SE PSI Halo zone (cm)
W 1 14,29 1,14 0,60 W 2 10,53 1,11 0,50 W 19 11,11 1,11 0,20 W 22 20 1,2 0,85 W 27 - - 1,10 W 31 16,67 1,17 0,15 W 39 28,57 1,29 0,75 W 40 - - 0,50 TSAT 41 - - 0,05 W 43 nera 63,64 1,64 0,80 W 47 17,65 1,18 1,50 W 49 - - 0,45 W 54 13,64 1,14 0,25 W 56 18,18 1,18 0,25 W 58 11,11 1,11 0,75 W 64 45,45 1,45 1,20 W 65 23,53 1,24 0,95 W 66 23,08 1,23 0,15 W 68 13,33 1,13 0,70 W 69 - - 1,15 W 60 rosa 57,14 1,57 0,35 W 60 bianca 11,11 1,11 0,85 W 71 25 1,25 0,90 W 77 36,36 1,36 0,90 W 85 - - 1,80 W 87 - - 0,35 W 90 20 1,2 0,80 W 92 15,38 1,15 1,00 W 94 54,55 1,55 1,15 W 105 - - 1,05 W 115 38,46 1,38 0,50 W 129 33,33 1,33 0,75 W 132 35,71 1,36 0,80 W 133 - - 0,95
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Tabella 21: Risultati dello screening dell’ attività fosfatasica e fitasica dei
chitinolitici. SE=Efficienza di solubilizzazione, PSI=Indice di solubilizzazione Ceppi isolati Attività fosfatasica Attività fitasica
SE PSI Halo zone (cm)
Ch 1 - - - Ch 2 - - - Ch 3 63,16 1,63 0,50 Ch 4 - - 0,20 Ch 5 31,25 1,31 0,25 Ch 6 bianco 30,77 1,31 0,30 Ch 6 giallo 25 1,25 0,30 Ch 7 21,43 1,21 0,62 Ch 8 - - 0,15 Ch 9 15,38 1,15 0,15 Ch 10 69,23 1,69 0,25 Ch 11 63,64 1,64 0,35 Ch 12 36,36 1,36 0,25 Ch 13 46,15 1,46 0,20 Ch 14 50 1,5 0,35 Ch 15 44,44 1,44 0,30 Ch 16 lucido 50 1,5 0,35 Ch 16 bianco 20,83 1,21 - Ch 17 50 1,5 0,30 Ch 18 - - 0,70 Ch 19 86,67 1,87 0,45 Ch 20 30 1,3 0,35 Ch 21 - - -
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Tabella 22: Risultati dello screening dell’ attività fosfatasica e fitasica degli azoto
fissatori. SE=Efficienza di solubilizzazione, PSI=Indice di solubilizzazione Ceppi isolati Attività fosfatasica Attività fitasica
SE PSI Halo zone (cm)
N 1 - - - N 3 - - - N 4 - - - N 5 - - - N 6 - - - N 7 - - - N 8 - - - N 9 - - - N 10 - - - N 11 - - - N 12 10 1,1 - N 13 - - 0,10 N 14 - - 0,10 N 16 - - - N 17 - - - N 18 - - 0,45 N 19 41,67 1,42 0,50 N 20 61,54 1,62 0,60 N 21 81,25 1,81 0,55 N 22 30,77 1,31 0,55 N 23 71,43 1,71 0,65 N 24 33,33 1,33 0,65 N 25 58,33 1,58 0,70 N 26 72,73 1,73 0,50 N 27 64,29 1,64 0,60 N 28 91,67 1,92 0,10 N 29 84,62 1,85 0,60
Sulla base della capacità dei microrganismi di utilizzare il fosfato presente nei diversi terreni colturali (NBRIP e PSMG), è stato possibile distinguere tre diversi gruppi:
1. Batteri coltivabili che mineralizzano i fitati ma non solubilizzano il fosfato (PMB);
2. Batteri coltivabili che solubilizzano il fosfato ma non mineralizzano i fitati (PSB);
3. Batteri coltivabili che mineralizzano i fitati e solubilizzano il fosfato (PMPSB).
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Dai risultati ottenuti è stato possibile evidenziare che tra i vari isolati gli attinobatteri e i chitinolitici sono quelli con la maggiore attività fosfatasica e fitasica. In particolare tutti i ceppi attinobatterici isolati hanno mostrato attività fitasica mentre l’attività fosfatasica è stata riscontrata in 25 ceppi su 34 totali, determinando la più alta percentuale di batteri PMPSB, del 73%. Per quanto riguarda l’efficienza di solubilizzazione (SE) e l’indice di solubilizzazione del fosfato (PSI), i valori più alti sono stati evidenziati nei ceppi: W 43 nera, W 60 rosa e W 94 mentre la più alta attività fitasica è stata riscontrata nei ceppi W 85 e W 47.
Per quanto riguarda i ceppi chitinolitici l’attività fosfatasica e fitasica è stata evidenziata rispettivamente in 17 ceppi e in 19 ceppi su 23 totali. In questo caso la percentuale di batteri PMPSB è del 69%. I valori più alti di SE e PSI sono stati riscontrati nel ceppo Ch 19 mentre la più alta attività fitasica nei ceppi Ch 18 e Ch 7.
Negli azoto fissatori l’attività fosfatasica è stata evidenziata in 12 ceppi mentre l’attività fitasica in 14 ceppi su 27 totali; la percentuale di batteri PMPSB è del 40%. I ceppi N 28 e N 29 e N 21 hanno mostrato la maggiore SE e PSI mentre nel ceppo N 25 è stata evidenziata la più alta attività fitasica.
Nei batteri eterotrofi è stata riscontrata la più bassa attività fosfatasica, in 7 ceppi su 38 totali mentre l’attività fitasica in 19 ceppi; la percentuale di batteri PSPSB è del 18%. Tuttavia nei batteri sono stati evidenziati i valori di SE e PSI più alti rispetto a tutti gli altri isolati, in particolare nei ceppi TSA 41 e TSA 3 mentre la maggiore attività fitasica è stata riscontrata nei ceppi TSA 26, TSA 3 e TSA 10.
Sia negli attinobatteri che nei batteri eterotrofi tutti i ceppi con attività fosfatasica hanno manifestato anche attività fitasica, ma non si può affermare il contrario. Tale correlazione tra le due attività non è stata riscontrata nei ceppi chitinolitici e azoto fissatori.
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Reyes et al. (2006) hanno trovato differenze significative nel numero di PSB tra specie di piante coltivate nello stesso tipo di suolo, suggerendo che le differenze riscontrate tra i fosfobatteri potrebbero essere correlate alla diversa essudazione delle radici.
Nella rizosfera sono presenti numerosi batteri in grado di esercitare un effetto benefico sulla crescita della pianta, tra questi abbiamo i batteri PMB e i batteri PSB. Considerando gli effetti negativi dei fertilizzanti chimici, i PSB potrebbero essere utilizzati nello sviluppo dell’agricoltura sostenibile in particolare, per migliorare l’assorbimento del fosforo da parte delle piante e, di conseguenza, la resa delle colture.
3.2.3. Produzione di fitormoni
I fitormoni sono molecole segnale che svolgono un ruolo fondamentale nella regolamentazione della crescita e dello sviluppo della pianta; basse concentrazioni di fitormoni sono in grado di influenzare i processi biochimici, fisiologici e morfologici delle piante e la loro sintesi è finemente regolata (Fuentes-Ramìrez e Caballero-Mellado, 2006). La capacità di produrre fitormoni è ampiamente diffusa tra i batteri associati con il suolo e le piante. I batteri PGP possono stimolare la crescita della pianta attraverso la produzione di auxine (acido indolacetico) (Spaepen et
al., 2008), di gibberelline (Bottini et al., 2004), di citochine (Timmusk et al., 1999) o regolando gli elevati livelli di etilene endogeno nella pianta
(Glick et al., 1998). L’acido indol-3-acetico (IAA), la principale auxina per le piante, è responsabile della divisione, espansione e differenziazione delle cellule vegetali e dei tessuti e stimola l’allungamento delle radici. La possibilità di sintetizzare IAA è stata rilevata in molti rizobatteri nonché in patogeni, in simbiotici e in batteri liberi nel suolo (Tsavkelova et al., 2006). I rizobatteri sintetizzano IAA o dal triptofano attraverso differenti percorsi o attraverso meccanismi triptofano-indipendenti, anche se in quantità
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minore (Spaepen et al., 2007). È stato stimato che l’80% dei batteri isolati dalla rizosfera possono produrre il regolatore di crescita IAA (Pattern e Glick, 1996). Batteri produttori di IAA appartengono ai generi Azospirillum (Dobbelaere et al., 1999), Aeromonas (Halda-Alija, 2003), Azotobacter (Ahmad et al., 2008), Bacillus (Swain et al., 2007), Burkholderia (Halda-Alija, 2003), Enterobacter (Shoebitz et al, 2009), Pseudomonas (Hariprasad e Niranjana, 2009) e Rhizobium (Ghosh et al., 2008).
Nella presente tesi lo screening dei batteri produttori dell’acido indolacetico è stato effettuato in piastre da 24 pozzetti inoculate con i ceppi da testare cresciuti sul mezzo microbiologico LBB addizionato con triptofano. Dopo l’aggiunta del reagente di Salkowski e un’incubazione al buio di 30 minuti, in alcuni ceppi è stato rilevato un viraggio di colore dal giallo al rosso, indicando la presenza dell’acido indolacetico (IAA) (Figura 20).
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I risultati ottenuti dallo screening della produzione di IAA da parte dei degli isolati sono riportati di seguito nelle Tabelle 23 e 24.
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Tabella 23: Risultati dello screening della produzione di IAA di batteri eterotrofi e degli
attinobatteri
Ceppi isolati Produzione di IAA Ceppi isolati Produzione di IAA
TSA 2 + W 1 ++ TSA3 ++ W 2 - TSA 10 - W 19 - TSA 13 - W 22 ++ TSA 20 - W 27 ++ W 25 - W 31 ++ TSA 26 + W 39 ++ TSA 32 - W 40 -
TSA 39 bianca - TSAT 41 -
TSA 39 gialla - W 43 nera ++
TSA 41 ++ W 47 ++ W 43 bianca - W 49 ++ W 44 - W 54 ++ TSA 46 - W 56 ++ TSA 47 - W 58 + TSA 49 - W 64 ++ W 50 +++ W 65 - TSA 58 - W 66 - TSA 60 + W 68 ++ TSA 108 bianca - W 69 - W 113 - W 60 rosa + TSA 136 - W 60 bianca + TSA 142 - W 71 - TSAT 5 grande bianca - W 77 ++ TSAT 7 - W 85 - TSAT 11 - W 87 - TSAT 14 - W 90 + TSAT 28 - W 92 ++ TSAT 38 + W 94 ++ TSAT 50 bianca + W 105 ++ TSAT 50 trasparente + W 115 ++ TSAT 51 - W 129 ++ TSAT 60 - W 132 ++ TSAT 92 + W 133 ++ TSAT 101 + TSAT 102 bianca - TSAT 113 - TSAT 115 +
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Tabella 24: Risultati dello screening della produzione di IAA degli azoto fissatori e dei
chitinolitici
Ceppi isolati Produzione di IAA Ceppi isolati Produzione di IAA
N 1 - Ch 1 - N 3 - Ch 2 - N 4 - Ch 3 - N 5 - Ch 4 - N 6 - Ch 5 ++ N 7 +/- Ch 6 bianco - N 8 - Ch 6 giallo + N 9 - Ch 7 ++ N 10 - Ch 8 +++ N 11 - Ch 9 - N 12 - Ch 10 + N 13 - Ch 11 +/- N 14 +/- Ch 12 - N 16 - Ch 13 - N 17 - Ch 14 + N 18 + Ch 15 + N 19 - Ch 16 lucido ++ N 20 - Ch 16 bianco - N 21 - Ch 17 +++ N 22 - Ch 18 - N 23 - Ch 19 + N 24 +/- Ch 20 + N 25 - Ch 21 - N 26 - N 27 - N 28 - N 29 -
La produzione dell’acido indolacetico è stata valutata sulla base dell’intensità di viraggio del colore, tenendo conto dei controlli presenti nelle piastre: -: assenza +/-: debole produzione +: produzione ++: moderata produzione +++: elevata produzione
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Dai risultati ottenuti è stato possibile evidenziare che i batteri chitinolitici e gli attinobatteri sono i maggiori produttori di acido indolacetico. In particolare nei chitinolitici la percentuale di produzione è dell’80% in quanto è stata riscontrata in 17 ceppi su 21 totali. I maggiori produttori di IAA sono i ceppi Ch 8 e Ch 17.
Negli attinobatteri la capacità produttiva è stata evidenziata in 26 ceppi su 34 totali, con una percentuale del 76%; tale capacità è variabile all’interno delle diverse morfologie.
Per quanto riguarda i batteri eterotrofi la sintesi di IAA è stata riscontrata in 12 ceppi su 38 totali, con una percentuale di produzione del 31%, e il maggior produttore è risultato essere il ceppo W 50.
I batteri azoto fissatori hanno mostrato la più bassa percentuale di produzione di IAA (14%) con soli 4 ceppi produttori, N 7, N 14, N18 e N 24, su 27 totali.
La presenza dei caratteri PGP evidenziati nei diversi gruppi funzionali isolati è riassunta in Tabella 25.
Tabella 25: Presenza dei caratteri PGP nei diversi gruppi funzionali isolati Gruppi funzionali isolati Produzione siderofori Attività fosfatasica Attività fitasica Produzione IAA Attinobatteri 79% 73% 100% 76% Chitinolitici 69% 74% 83% 81% Azoto fissatori 100% 44% 52% 14% Batteri eterotrofi 25% 18% 50% 32%
Dai risultati ottenuti riportati in Tabella 25 è possibile osservare che il maggior numero di isolati con caratteri PGP erano ascrivibili ai gruppi funzionali: attinobatteri, chitinolitici e azoto fissatori.
