1.1Neurodegenerazioneerigenerazione Introduzione

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(1)Introduzione Tutte le malattie pi` u acute, potenti e mortali, e quelle che sono pi` u difficili da essere comprese da gli inesperti, ricadono sul cervello. Ippocrate, 400 A.C.. 1.1. Neurodegenerazione e rigenerazione. Al giorno d’oggi sono conosciuti molteplici disturbi che affliggono il sistema nervoso, causati da una progressiva perdita di funzione che deriva dalla degenerazione e morte cellulare della popolazione neuronale. Tra di essi ricordiamo soprattutto, per diffusione e severità dei sintomi, il Morbo di Alzheimer, di Parkinson, la corea di Huntington e la Sclerosi Laterale Amiotrofica. Il famoso mito greco racconta che Prometeo, per aver aver rubato il sacro fuoco degli dèi, venne incatenato ad una roccia e costretto a subire il supplizio di un’aquila inviata a mangiare il suo fegato ogni giorno. Essendo il fegato in grado di rigenerarsi ogni notte, egli poteva però sopravvivere, patendo suo malgrado una pena perpetua. La storia del titano Prometeo testimonia che già dall’antichità si era a conoscienza del potenziale rigenerativo del fegato, e l’idea di poter riuscire a ricreare la struttura di organi danneggiati ha da sempre affascinato il genere umano, come è sottolineato dal gran numero di miti e leggende (non solo in.

(2) Introduzione. 2. ambito classico) che raccontano dell’esistenza di creature in grado di ricreare appendici del proprio corpo perse a seguito di ferite. La capacità della maggior parte dei tessuti di rigenerarsi deriva da una specifica popolazione di cellule staminali, ma esistono molte barriere all’utilizzo di questo strumento in terapie cliniche. Tuttavia questo approccio ha il potenziale di migliorare enormemente la salute umana, e le conoscenze acquisite dallo studio del differenziamento di cellule in coltura e dello sviluppo embrionale di organismi modello sta ora gettando le basi per una nuova era della medicina rigenerativa.. 1.2. Le cellule staminali embrionali. Come il nome suggerisce, le cellule staminali embrionali sono un tipo di cellule indifferenziate di mammifero che si ottengono dallo sviluppo di uno zigote. Dopo la fecondazione dell’oocita di topo da parte dello spermatozoo il nucleo diploide di nuova formazione inizia a replicarsi e l’uovo subisce ripetute divisioni, risultando in un aggregato di cellule in rapida crescita che genera due strutture riconoscibili, il trofoectoderma e la massa cellulare interna (Figura 1.1). Il trofoectoderma originerà gli annessi extraembrionali mentre la massa cellulare interna (ICM) dà luogo all’ipoblasto e all’epiblasto. L’ipoblasto a sua volta produce il sacco vitellino, che fornisce supporto nutrizionale per l’embrione, mentre l’epiblasto formerà l’embrione. A seguito della gastrulazione si vengono a distinguere i tre foglietti embrionali primari: ectoderma, mesoderma ed endoderma. Le cellule staminali embrionali (ESC) sono isolate dalla massa cellulare interna dell’embrione a stadio di blastocisti mediante blanda dissociazione e poi seminate su fibroblasti embrionali murini (MEF). Esse si dividono rapidamente e possono subire indefiniti passaggi in coltura mantenendo il loro stato indifferenziato, senza segni di senescenza quali l’accorciamento dei telomeri..

(3) Introduzione. 3.

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(5) . . . . Figura 1.1: Segmentazione nei mammiferi Le cellule staminali embrionali sono isolate dalla massa cellulare interna (ICM) dell’embrione a stadio di blastocisti (E3.5-E4; adattata da Sanes et al., 2006 ). Quando le cellule ES sono coltivate in assenza di MEF e senza aggiunta di siero o di altri fattori di crescita esse iniziano un programma di differenziamento, segno che il mantenimento della staminalità e del self-renewal è controllato da fattori estrinseci. In particolare l’attività di inibizione del differenziamento esercitata dalle MEF può essere vicariata dal Leukemia Inhibitory Factor (LIF) (Smith et al., 1992) prodotto in notevole quantità dalle MEF (Rathjen et al., 1990). Le ESC deficienti per il gene LIF non sono in grado di mantenere la propria pluripotenza (Stewart et al., 1997); in condizioni fisiologiche questa citochina si lega al recettore tirosina-chinasi gp130, che viene espresso nelle cellule staminali embrionali murine, ed è noto attivare la via di segnalazione intracellulare di JAK/STAT3 (Burdon et al., 1999). Più recentemente è stato dimostrato che altri fattori oltre a LIF contribuiscono al mantenimento del self-renewal delle ESC: questi includono membri delle Bone Morphogenetic Proteins (Ying et al., 2003) e le famiglie Wnt (Sato et al., 2004). Le cellule staminali possiedono uno specifico assetto trascrizionale: i fattori Oct3/4 e Nanog sono necessari per mantenerne lo stato indifferenziato (Shimozaki et al, 2003): a dimostrazione di questo le ESC prive di una copia funzionale di Oct3/4 o Nanog non sono in grado di replicarsi e differenziano spontaneamente, anche in presenza di LIF. Si ritiene che le vie di segnale a valle di quest’ultimo, in concomitanza con Wnt e BMP, possano agire controllando direttamente l’e-.

(6) Introduzione. 4. spressione e l’attività dei fattori di trascrizione della staminalità come Oct3/4, Nanog e Sox2, i quali instaurano tra loro un loop autoregolatorio. Le cellule ES posseggono un potenziale differenziativo notevole: quando sono reintrodotte nella blastocisti murina esse contribuiscono alla formazione dei tessuti di tutte e tre i foglietti embrionali primari, incluso il lineage delle cellule germinali delle chimere. Pertanto sono in grado di generare gameti fertili con lo stesso assetto genetico delle ESC trapiantate (Bradley et al, 1984). Questa caratteristica delle cellule ES, in combinazione con la manipolazione genetica, ha reso possibile la produzione di topi transgenici, per esempio con delezioni in geni specifici (Capecchi, 1989). Sulla base di questi studi, le cellule ES sono definite pluripotenti, in quanto in grado di contribuire a tutti i tipi di cellule dell’embrione.. 1.3. L’induzione neurale. Il sistema nervoso centrale origina dal neuroectoderma, che è indotto prima della gastrulazione. Secondo il modello classico di attivazione/trasformazione proposto da Nieuwkoop (Nieuwkoop, 1952) il destino neurale è in realtà uno stato di default dell’ectoderma, che viene soppresso dalla segnalazione di Bone Morphogenetic Proteins (BMP) presente tra le cellule di questo tessuto. Durante la gastrulazione il destino neurale è completamente de-represso e sostenuto da molteplici inibitori di BMP (Activina, Noggin e Follistatin) secreti dalla parte anteriore del mesoderma che involve più precocemente, chiamato nodo nel topo, o organizzatore di Spemann negli anfibi (Spemann & Mangold , 2001). In questo modo si genera la piastra neurale, con caratteristiche anteriori. Successivamente altri fattori diffusibili come Wnts, Fibroblast Growth Factors (FGF) e acido retinoico (RA), secreti dal mesoderma che involve più tardivamente (la notocorda presuntiva), posteriorizzano la parte caudale della piastra neurale..

(7) Introduzione. 5. A questo punto dello sviluppo la piastra neurale dell’embrione dei vertebrati assomiglia ancora in gran parte al resto dell’ectoderma; tuttavia, poco dopo la sua formazione, essa inizia a ripiegarsi su se stessa a formare una struttura tubolare, detta appunto tubo neurale, che originerà posteriormente il futuro midollo spinale e anteriormente l’encefalo, mentre la cavità interna costituirà il sistema ventricolare. Nel topo il tubo neurale anteriore forma tre vescicole (prosencefalica, mesencefalica e rombencefalica), ed il prosencefalo successivamente si suddivide per formare le vescicole di telencefalo e diencefalo (Figura 1.2).. Figura 1.2: Sviluppo del tubo neurale Dopo la chiusura della piastra neurale, il tubo neurale subisce delle strozzature che lo suddividono prima in 3 vescicole (sx) poi in 5 compartimenti (dx) che differenzieranno nelle strutture del sistema nervoso centrale (adattata da Purves et al., 2008 ).. 1.4. La corticogenesi. Il numero enorme di cellule neuronali e gliali che costituisce la corteccia dei mammiferi deriva da un unico epitelio pseudostratificato, composto dalle cellule progenitrici neuroepiteliali che rivestono la parete ventricolare del tubo neurale dopo la sua chiusura. Prima dell’inizio della neurogenesi i precursori neurali subiscono vari cicli di divisioni cellulari simmetriche che espandono il pool iniziale di cellule progenitrici multipotenti (Götz & Hüttner, 2005). I nuclei di queste cellule si muovono durante il ciclo cellulare venendosi a trovare in posizioni diverse: le.

(8) Introduzione. 6. mitosi avvengono normalmente in prossimità del lume, quindi il progenitore perde contatto con la lamina basale; nelle fasi G1 ed S esso oscilla verso l’esterno, per tornare presso il lume in G2 (Sauer, 1935). E’ proprio la presenza di una popolazione eterogenea di cellule in fasi diverse del ciclo replicativo a conferire al tessuto la morfologia pseudostratificata (Figura 1.3).. Figura 1.3: Le mitosi nel neuroepitelio Le cellule progenitrici attraversano lo spessore del tubo neurale, e loro nuclei si spostano alla zona mantellare durante la fase S del ciclo cellulare, ritornando verso la superficie ventricolare in fase G2 per una nuova mitosi (adattata da Sanes et al., 2006 ).. La prima parte dell’istogenesi corticale è quindi segnata principalmente da una forte proliferazione che porta all’espansione tangenziale della superficie ventricolare (Caviness & Takahashi, 1995), mentre le divisioni neurogeniche ampliano radialmente lo spessore corticale (Rakic, 1972). In questa fase iniziale solo una parte molto piccola di cellule si divide asimmetricamente per generare i neuroni che formano il preplate. Successivamente i progenitori della zona ventricolare generano delle cellule, anche esse progenitrici, che si collocano nella zona subventricolare, dalle quali si originano i neuroni che andranno ad occupare la cortical plate: si tratta di uno strato di neuroni che si intercalano in preplate e la suddividono in zona marginale, popolata dalle cellule di Cajal-Retzius, e subplate, che si trova al di sotto della cortical plate (Götz & Barde, 2005; McConnell, 1995)..

(9) Introduzione. 7. Figura 1.4: Meccanismo della corticogenesi La corteccia dei mammiferi si forma per apposizione di strati di neuroni che differenziano dai precursori nella zona ventricolare (ZV; adattata da Sanes et al., 2006 ).. Tramite esperimenti di iniezione di bromo-deossiuridina (BrdU) o di 3 H-timidina a specifici stadi dello sviluppo di topo è stato dimostrato che il “birthdate” dei neuroni varia in modo dipendente dalla posizione finale della cellula: i neuroni che si trovano negli strati più profondi vengono generati prima rispetto a quelli degli stati più superficiali. L’accumulo di neuroni all’interno della cortical plate ha come risultato un marcato aumento dello spessore corticale, e di conseguenza i processi delle cellule progenitrici non sono più in grado di estendersi verso la superficie esterna della corteccia: pertanto i neuroni corticali generati più tardivamente migrano verso le loro destinazioni spostandosi sulla glia radiale, che funge da guida in virtù della forma allungata (Rakic, 1971)..

(10) Introduzione. 8. McConnell e Kaznowski (1991) hanno dimostrato che la determinazione dell’identità laminare viene effettuata durante l’ultima divisione cellulare. Precursori neurali eterocronici trapiantati in un cervello durante lo sviluppo tendono a collocarsi nello strato per il quale erano destinate nell’embrione donatore; se invece il trapianto avviene prima dell’ultima divisione (metà della fase S) allora le cellule migrano nello strato che si sta formando in quel momento nella corteccia del ricevente, segno che non è stata ancora impartita un’istruzione sul destino posizionale del neurone differenziato. La zona ventricolare rappresenta la sorgente primaria di neuroni corticali; tuttavia una parte degli interneuroni del primo strato proviene da altre aree quali il prosencefalo anteriore e cortical hem; gli interneuroni GABAergici presenti nella corteccia provengono da formazioni basali del telencefalo quali l’eminenza gangliare laterale e mediale (Anderson et al., 1997).. 1.5. Patterning della corteccia nei mammiferi. La neocorteccia di mammifero adulto comprende un numero molto elevato di aree anatomicamente e funzionalmente distinte, più di 50 nell’uomo. Una difficoltà nell’affrontare il problema di come possa svilupparsi il complesso pattern di connessioni che caratterizzano la corteccia è la sua struttura e citoarchitettura praticamente uniforme. Inoltre sono pochi i geni espressi in tempo sufficientemente precoce da poter essere considerati determinanti nel patterning di una specifica zona, e nessuno di questi è unicamente acceso nella singola area. Cos`ı si è a lungo pensato che il patterning della neocorteccia fosse imposto da elementi estrinseci, principalmente attraverso le afferenze talamiche che penetrano la corteccia in modo dipendente dalla regione palliale che ne è bersaglio. Tuttavia ad oggi sembra più plausibile che il neuroepitelio corticale acquisisca.

(11) Introduzione. 9. una regionalizzazione prima dell’arrivo dell’innervazione afferente ed in modo non dissimile da altre regioni del tubo neurale, con fattori di trascrizione espressi in maniera variabile in risposta ad un gradiente di concentrazione di morfogeni diffusibili. Un centro di segnalazione è l’Anterior Neural Ridge (ANR), che secerne FGF, e la regione del cortical hem, che secerne Wnt e BMP. In assenza di altri specifici fattori di trascrizione area-specifici, è probabile che le regioni corticali siano determinate da livelli soglia di geni come Emx2 e Pax6, che sono espressi in opposti gradienti lungo l’asse AP della corteccia, o come Lef1 (a valle della via di segnalazione Wnt) che mostra espressione decrescente in senso mediale-laterale, come mostrato dai morfogeni presi in esame in Figura 1.5.. Figura 1.5: Determinanti molecolari del patterning corticale In-situ hybridization su cervelli di topo a stadio E10.5 (a, c) ed E12.5 (b, d) che mostrano l’espressione di Fgf8 (a), di Wnt3b (b), di Wnt3a (c) e di Shh (d). (t: telencefalo; hem: cortical hem; mge: eminenza gangliare mediale; adattata da Ragsdale & Grove, 2001 ).. A sostegno di questa ipotesi, la perdita della funzione di Emx2 restringe la corteccia visiva, più posteriore, ed espande quella sensoriale (mediana) e motoria (anteriore), mentre la perdita di Pax6 risulta in un patterning opposto. Pertanto,.

(12) Introduzione. 10. contrariamente a quanto si pensava in precedenza, si ritiene che in effetti il patterning corticale sia stabilito precocemente già nel neuroepitelio progenitore e che l’innervazione talamica in un secondo tempo rafforzi e rifinisca questo modello iniziale (Ragsdale & Grove, 2001).. 1.6. ESC e differenziamento neurale. Negli ultimi anni molti lavori hanno descritto diversi metodi per la generazione in vitro di cellule neurali a partire da cellule staminali embrionali di topo (Eiraku et al., 2008; Gaspard et al., 2009; K. Watanabe et al., 2005; Wataya et al., 2008). Il differenziamento di ESC murine in cultura è un versatile strumento in vitro per la comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari della neurogenesi dei mammiferi. L’utilizzo di mezzi di crescita chimicamente definiti ha reso possibile indagare i fattori diffusibili che influenzano l’identità antero-posteriore (A/P) e dorso-ventrale (D/V) dei neuroni ottenuti dal differenziamento in vitro di cellule staminali embrionali. Tra questi fattori sono stati descritti l’acido retinoico, BMPs, Wnt, FGFs e Sonic Hedgehog (SHH) (Chatzi et al., 2011; Eiraku et al., 2008; Gaspard & Vanderhaeghen, 2010; Hendrick et al., 2009; Li et al., 2009; Watanabe et al., 2005) L’utilizzo di mezzi chimicamente definiti privi di fattori diffusibili ha anche permesso di indagare la sorte di differenziamento delle ESC in assenza di segnali esogeni. In queste condizioni di cultura le cellule staminali murine sono sottoposte ad un programma differenziativo di tipo neurale, senza la necessità di aggregazione multicellulare o di cocoltura (Gaspard et al., 2009). Il programma predefinito di differenziamento delle ESC è stato studiato mettendo le cellule in coltura a bassa densità: esse generano neuroni del prosencefalo come destino di default. Ci sono prove indirette che le ESC in questa condizione producano SHH.

(13) Introduzione. 11. che agisce in modo autocrino, dal momento che l’inibizione di questo segnale per mezzo dell’antagonista ciclopammina indirizza i neuroni che vengono differenziati ad un destino corticale dorsale (Gaspard et al., 2009). Gli effetti autocrini di fattori endogeni prodotti dalle cellule staminali embrionali sono suggeriti anche da altre osservazioni. Noggin e SB431542 sono inibitori della segnalazione specifica di BMP e TGF-β/Activina rispettivamente. Questi due fattori in vitro sostengono il differenziamento neuronale delle ESC di mammifero coltivate in mezzi di crescita chimicamente definiti (Chambers et al., 2009), suggerendo cos`ı che esse possono produrre BMP e TGF-β/Activina, e che questi fattori ne inibiscono il differenziamento neuronale.. 1.7. Via di segnale di BMP e induzione neurale. Le Bone Morphogenetic Proteins sono piccole citochine (da 10 a 30 kD) della superfamiglia del TGFβ (Tissue Growth Factor β), un raggruppamento che nei mammiferi contiene più di 30 proteine dalla struttura fortemente conservata, conosciuta come cystine knot. Oltre alle BMP ed alle TGFβ, a questa superfamiglia appartengono l’Activina e l’Inibina, Nodal, la miostatina, i Growth/Differentiation Factors (GDFs) e l’ormone anti-mülleriano (AMH). Sono state caratterizzate molteplici proteine TGFβ-like in diverse specie di vertebrati tra cui lo Xenopus, come abbiamo già ricordato, e il topo, ma diversi membri della superfamiglia si ritrovano anche in organismi più distanti evolutivamente come Caenorhabditis elegans e Drosophila melanogaster. I membri della superfamiglia TGFβ esercitano la loro attività legandosi a due distinti tipi di recettori, detti di tipo I e di tipo II (Wrana et al., 1994). Per la trasduzione del segnale sono necessari entrambi i recettori: ciascuno di essi contiene un dominio serina/treonina chinasi nella propria porzione intracellulare.

(14) Introduzione. 12. e nel caso del recettore di tipo II esso è costruttivamente attivo; grazie al legame con la citochina si viene a costituire un complesso eterotetramerico formato da due molecole di tipo II e due di tipo I (Qin et al., 2002). In questo complesso la chinasi del recettore di tipo II fosforila il dominio GS del recettore di tipo I che si trova tra il dominio transmembrana e il dominio chinasi di questa proteina: a seguito della fosforilazione le chinasi del recettore di tipo I sono attivate e possono fosforilare dei substrati intracellulari (vedere Figura 1.6). Tra i recettori di tipo I ricordiamo l’Activin receptor-like 2 (Alk2), BMPRIA (Alk3) e BMPRIB (Alk6); come recettori di tipo II occorre far menzione dell’Activin receptor II (ActRII) e IIB (ActRIIB) e del recettore di BMP (BMPRII). Le molecole responsabili della segnalazione a valle dei recettori di TGFβ sono le proteine Smad, che vengono da essi fosforilate (Moustakas et al., 2001). Queste vengono classificate in tre sottoclassi, cioè Smad regolate da recettore (RSmads), Smad comuni (Co-Smads), e Smads inibitorie (I-Smads). Le R-Smads sono ulteriormente divise in due sottoclassi, a seconda che vengano attivate da TGFβ/Activina (Smad2 e Smad3) o da BMP (Smad1, Smad5 e Smad8). A discapito dei molti R-Smads, nei mammiferi esiste un unico co-Smad, Smad4. Le Smads sono composte da un dominio N-terminale omologo alla proteina Mad di Drosophila (MH), seguito da una regione linker e da un altro dominio MH2 al C-terminale. Senza l’attivazione del recettore i domini MH1 e MH2 sono associati tra loro, e le R-Smads sono ancorate sotto forma di omodimeri alla membrana plasmatica (Qin et al. 2002). Tramite la fosforilazione il contatto tra i due domini viene rotto, e queste molecole possono eterodimerizzare con una Co-Smad: questi complessi binari possono essere traslocati nel nucleo, dove si legano ai promotori di molteplici geni regolandone la trascrizione come co-attivatori o come co-repressori. Nell’ectoderma le Smad fosforilate regolano la trascrizione di geni come Gata4 e.

(15) Introduzione. 13. Msx: i prodotti di questi geni inibiscono la trascrizione di SoxD (Sox2), fattore sufficiente e necessario per l’induzione dell’ectoderma a neuroepitelio, pertanto il tessuto diventa epidermide. Viceversa se il segnale di BMP è bloccato da uno dei suoi inibitori, la via di Smad è inattivata, e Sox può attivare direttamente la trascrizione di geni proneurali indirizzando lo sviluppo del sistema nervoso.. . . . . . . . . . . .

(16) . . . . Figura 1.6: Via di segnale di BMP La presenza di BMP consente la formazione di un complesso di recettori che trasduce intracellularmente il segnale mediante la fosforilazione delle Smad, che dopo essere state traslocate nel nulceo agiscono da regolatori trascrizionali (adattata da Sanes et al., 2006 ).. Un altro importante bersaglio delle Smad è rappresentato dalla famiglia dei geni Id (Inhibitors of differentiation), che risultano fortemente upregolati dall’azione di BMP: si tratta di fattori di trascrizione di tipo dominante negativo che eterodimerizzano con fattori helix-loop-helix impedendone il legame con il DNA..

(17) Introduzione. 14. E’ stato dimostrato che l’attivazione dei geni Id causa l’inibizione del differenziamento neurale, mentre non colpisce il commitment verso lineages differenti (Ying et al., 2003).. 1.8. Noggin. Uno dei più importanti inibitori di BMP è Noggin. Si tratta di una piccola glicoproteina (32 kDa) espressa nell’organizzatore dell’embrione in fase di gastrula e secreta come molecola solubile in forma dimerica. Il gene Noggin è stato scoperto nel laboratorio di Richard M. Harland per la sua capacità di indurre la formazione di assi secondari in embrioni di rospo (Smith & Harland, 1992). Questo fattore imita l’attività dell’organizzatore nell’induzione di marker muscolari in espianti di gastrula (zona ventrale marginale) che sarebbero altrimenti destinati a formare mesoderma ventrale (Smith et al., 1993), mentre induce marcatori neurali anteriori nell’ectoderma degli animal caps di Xenopus, che di default originerebbe epidermide (Lamb et al., 1993), in assenza di mesoderma. Noggin lega BMP2/4/7 con affinità picomolare, (Figura 1.7), con una marcata preferenza per BMP2 e BMP4, e questo forte legame impedisce l’attivazione del recettore da parte di tali ligandi (Zimmerman et al. 1996). Nei mammiferi (Mus musculus) Noggin viene espresso nel nodo di Hensen allo stadio di gastrula (a partire da E7.5), mentre successivamente nello sviluppo (E8.5) è acceso nella notocorda (similmente a quanto si osserva in Xenopus) e nel tubo neurale dorsale a livello della roof plate (E9.5), estendendosi fino all’estremità anteriore per quasi tutta la lunghezza del tubo stesso (McMahon et al., 1998). Benchè il ruolo di questo morfogeno sia ben conservato, la mutazione di Noggin in omozigosi nel topo comporta l’assenza del SNC anteriore solo se in concomitanza con l’inattivazione di Chordin, altro inibitore di BMP: il risultato,.

(18) Introduzione. 15. apparentemente contraddittorio, si spiega verosimilmente con la ridondanza del ruolo molecolare di questi due scavengers (Bachiller et al., 2000). La forma umana di Noggin è composta da 205 aminoacidi (residui 28-232) dopo la rimozione del peptide segnale (residui 1-27), e viene secreta come proteina omodimerica covalentemente legata da due ponti disolfuro e glicosilata (mediante l’aggiunta di due residui di N-acetilglucosammina). La forma murina differisce da quella umana per due sole sostituzioni amminoacidiche, di cui una nel peptide segnale.. Figura 1.7: Struttura del dimero Noggin-BMP Ricostruzione tridimensionale del complesso tra la forma umana di Noggin (verde) e BMP7 (rosa). La trasparenza mostra la superficie molecolare mentre lo scheletro polipeptidico è rappresentato sotto forma di cartoon. (Immagine realizzata con il programma di visualizzazione PyMol a partire dalle coordinate cristallografiche del file 1M4U depositato in Protein Data Bank da Groppe et al., 2003 ; http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)..

(19) Introduzione. 1.9. 16. Scopo della tesi. Come già detto precedentemente, le BMP agiscono in combinazione con il LIF per sostenere la replicazione e prevenire il differenziamento (anche in senso neurale) delle cellule staminali embrionali di topo attivando l’espressione dei geni Id attraverso la via di SMAD. Esistono diverse evidenze che l’attività inibitoria del destino neurale esercitata da BMP sia evolutivamente conservata, dal momento che Noggin promuove il differenziamento neuronale in vitro sia delle ESC (Chambers et al., 2009) che delle cellule pluripotenti degli animal caps di Xenopus (Lan et al., 2009). Tuttavia il trattamento con Noggin di cellule pluripotenti di Xenopus a basse dosi supporta la neuralizzazione e l’espressione di marcatori prosencefalici, mentre ad alte dosi induce esclusivamente marcatori diencefalici (Lan et al., 2009; Viczian et al., 2009). Questo fenomeno suggerisce che BMP endogene, a dosi diverse, potrebbero indirizzare il destino regionale dei neuroni che si vanno formando. In linea teorica è stato proposto un ruolo delle BMPs durante lo sviluppo del telencefalo dorsale di topo nella morfogenesi regionale, nel controllo dell’espressione dei geni specifici e nella regolazione di proliferazione cellulare ed apoptosi localizzate (Furuta et al., 1997). Tuttavia in letteratura non vi è alcuna prova diretta che le ESC producano BMP endogeni durante la differenziazione, né che questi fattori vengano rilasciati nel terreno di coltura e possano influenzare il tipo di neuroni generati da queste cellule. Scopo della tesi è in primis la caratterizzazione del differenziamento di cellule staminali embrionali murine in un terreno di crescita minimo, quindi lo studio del ruolo di BMP e Noggin nel determinare il pattern A/P di differenziazione neurale delle ESC, dipendente dall’attività di segnale trasdotta dalla via di Smad..

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