Messa a punto dell’estrazione delle vitamine dal carciofo
Il passaggio successivo nella ricerca sperimentale è stato il tentativo di applicazione delle metodiche analitiche sviluppate all’analisi di una matrice complessa di tipo commerciale, costituita nella fattispecie da un campione di origine vegetale, il carciofo.
La valutazione del contenuto vitaminico di una matrice complessa, come quella costituita da un estrattovegetale, presuppone l’applicazione di alcuni passaggi estrattivi preliminari all’analisi; questi dipendono dalle caratteristiche organolettiche, strutturali e chimiche del campione, la localizzazione dei costituenti desiderati al suo interno, le loro caratteristiche chimico-fisiche e la loro concentrazione, etc. Le metodiche ufficiali di determinazione del contenuto delle vitamine idrosolubili e liposolubili da alimenti e cibi vegetali, adottate e proposte dagli enti regolatori preposti per il controllo delle loro caratteristiche nutrizionali e di conservazione (AOAC, EC, Istisan, etc.), sono procedure estrattive e analitiche che in massima parte consentono, ciascuna, la determinazione quantitativa di una singola vitamina; questoapproccio consente l’utilizzo di condizioni sperimentali specifiche per il composto considerato, che prevengano la degradazione dei composti labili (vitamina C, tiamina, riboflavina) e garantiscano il più possibile l’assenza di interferentiper la specificità dell’analisi. In generale, la letteratura riporta ben poche metodiche che consentono la determinazione simultanea di vitamine idrosolubili; per quanto riguarda la determinazione da matrice vegetale a foglia verde, non sono state riportate metodiche in HPLC o CE.Queste metodiche prevedono generalmente alcuni step fondamentali nella fase estrattiva:
triturazione/omogenizzazione del campione: la matrice naturale viene sminuzzata e resa omogenea per facilitare l’estrazione dei componenti dai tessuti;
estrazione con solventi/trattamento termico: l’aggiunta di un’adeguata miscela solvente e di fattori fisici (temperatura, pressione, ultrasuoni, etc.) consente l’estrazione dei componenti dai tessuti;
trattamento/purificazione dell’estratto: l’estratto viene reso omogeneo e purificato (centrifugazione, filtrazione, estrazione SPE), in modo da poter essere analizzato;
talvolta l’analisi viene preceduta da un passaggio di derivatizzazione chimica dei componenti desiderati, al fine di rendere l’analisi più sensibile e specifica.
Una procedura del genere riflette, nel suo insieme, una tipica estrazione con solvente da matrice vegetale, quali quelle adottate nell’ambito della chimica alimentare, della fitochimica, della fitoterapia e dell’etnofarmacologia, ma viene resa il più possibile specifica per il componente desiderato. Ad esempio, i componenti antiossidanti termolabili (come la vitamina C, che in soluzione accelera la propria ossidazione in acido deidroascorbico in presenza di calore) vengono protetti tramite l’aggiunta di molecole antiossidanti o di un atmosfera inerte (N2 gassoso).
Le metodiche ufficiali di questo tipo vengono utilizzate regolarmente per la determinazione delle caratteristiche nutrizionali dei cibi naturali e dei vari alimenti derivati. Tra le vitamine idrosolubili, la vitamina C è molto diffusa nella frutta e nella verdura che costituiscono la dieta umana, e diversi documenti ufficiali descrivono procedure di estrazione ed analisi della vitamina C in matrici naturali o in prodotti contenenti vitamina C naturale (proveniente da estratti naturali) o semplicemente addizionata come composto fortificante (bevande, alimenti fortificati, alimenti per bambini, integratori, multivitaminici, etc.).
Nella letteratura scientifica, la determinazione di singole vitamine idrosolubili da verdure edibili e vegetali in generale è stata riportata, per alcune specie erelative cultivar. Anche in questo caso, data l’ampia distribuzione della vitamina C tra la frutta e la verdura maggiormente consumate e l’interesse sempre crescente per l’attività antiossidante dei cibi naturali e le proprietà nutraceutiche che ne conseguono (prevenzione dell’invecchiamento, benefici a livello cardiocircolatorio, nervoso, metabolico, etc.), la determinazione della vitamina C nella frutta e nella verdura è stata descritta nella letteratura più recente. La determinazione della vitamina C è stata riportata anche nella bietola55, nel pomodoro56, nel cavolfiore57, negli spinaci58, negli agrumi59, nel frutto di acerola60, etc. Le procedure estrattive descritte nei lavori citati prevedono anch’esse, ovviamente, una fase di omogeneizzazione del campione, seguita dall’estrazione vera e propria con solvente e da eventuali passaggi di purificazione del campione. Anche il carciofo è stato e rimane oggetto di indagine per quanto riguarda in particolare il contenuto di vitamina C (acido ascorbico e deidroscorbico) e dei componenti antiossidanti. Gil-Izquierdo e colleghi hanno determinato il contenuto di vitamina C in campioni di carciofo provenienti da varie cultivar per valutare gli effetti delle condizioni di
conservazione33. Il campione (parte edibile, 10 g) viene addizionato di una miscela acqua/metanolo 95:5 contenente acido citrico ed EDTA (0.5 g/l) ed omogenizzato in Turrax per 30 sec, dopodichè l’estratto viene filtrato, centrifugato e purificato in SPE su silice C18, ed infine
filtrato su membrana prima dell’analisi HPLC. La determinazione quantitativa avviene tramite spettroscopia di fluorescenza dopo derivatizzazione post-colonna per reazione con fenilienediammina e conversione nel derivato fluoroforo chinossalinico.
La determinazione simultanea delle vitamine idrosolubili da matrice vegetale alimentare è stata descritta, anche se in misura molto minore. Aslam e colleghi hanno determinato Il contenuto di alcune vitamine del gruppo B in germogli di ceci (Cicer arietinum L.)32. Il campione omogenizzato (10 g) è stato estratto con una miscela di acetonitrile (5 %) e acido acetico (1 %) in acqua (25 ml), in agitazione a 70 °C per 40 min, dopodichè viene raffreddato, filtrato e portato a 50 ml con la miscela di estrazione. L’analisi HPLC-UV viene condotta per eluizione con gradiente lineare di metanolo in tampone fosfato su colonna in silice C18 (250 x 4.6 mm, 5 µm) e
lettura UV a 210 e 280 nm.
Come si evince dagli esempi riportati, l’acido ascorbico può essere facilmente estratto tramite omogeneizzazione in miscele acquose acide a temperatura ambiente, mentre la determinazione delle vitamine del gruppo B prevede spesso un trattamento a caldo, in ambiente acido e di durata maggiore. Questo è coerente con quanto descritto nelle procedure estrattive riportate nei metodi analitici ufficiali, e con quanto riportato nell’”Introduzione all’estrazione delle vitamine idrosolubili” a riguardo dell’estrazione delle vitamine del gruppo B da materiale vegetale: alcune vitamine idrosolubili presenti nella loro forma libera o no n coenzimatica (prive di gruppi fosfato, residui nucleotidici o nucleosidi) risultano spesso associate alle proteine strutturali e cellulari, tramite legami covalenti o interazioni dipolari. Questo rende necessaria l’applicazione di un trattamento termico in ambiente acido, che permette la rottura di questi legami e consente l’estrazione dei costituenti dai tessuti del campione.
L’estrazione dei componenti da un vegetale può essere sensibilmente complicata dalla consistenza del campione in questione e dal tipo di tessuti che lo compongono. La quantità di fibre ed il grado di lignificazione possono implicare tempi di estrazione più lunghi e/o condizioni più drastiche.Data la maggiore complessità della matrice rappresentata da diverse specie vegetali, e la mancanza di dati organici sull’estrazione di vitamine idrosolubili dai campioni di questo tipo, è auspicabile una semplificazione della matrice in esame attraverso estrazione in
fase solida (SPE). L’estrazione in fase solida è stata utilizzata per la determinazione di acido ascorbico e deidroascorbico da diverse verdure33, ma non esistono dati sufficienti sulla possibilità di estrazione simultanea di vitamine idrosolubili da matrice vegetale. Al contrario, la purificazione tramite SPE è stata largamente applicata alla determinazione simultanea di vitamine idrosolubili da matrici meno complesse quali multivitaminici, integratori, cibi sostitutivi o alimenti preparati28-31, 42-44.
Il carciofo (Cynara Scolimus L.) è una verdura largamente consumata nella regione del Mediterraneo. La parte edibile della pianta, rappresentata dal fiore maturo, viene impiegata in cucina nella preparazione di diversi alimenti, e possiede proprietà benefiche e protettive per la salute umana. Gli studi in vitroedin vivo hanno dimostrato le funzioni epatoprotettive e l’inibizione della sintesi del colesterolo negli epatociti61. Inoltre, il carciofo possiede un alto potenziale antiossidante, grazie alla presenza della vitamina C e di un vasto pool di composti fenolici62. Tra questi, l’acido clorogenico e gli acidi caffeoilchinici (in particolare 1,3- e 1,5-dicaffeoilchinico, quest’ultimo detto anche ‘cinarina’) sono i principali componenti fenolici riportati, insieme ai flavonoidi apigenina e luteolina63. La vitamina C è stata riportata essere presente in quantità significative (100 mg/kg in media, variabile a seconda della cultivar), rendendo questa verdura una delle più ricche tra quelle abitualmente consumate nella nostra dieta64. Inoltre, il carciofo possiede uno dei quantitativi più alti di fibra alimentare tra le verdure della nostra dieta, dietro a cavolfiore e cicoria57.
Lo scopo della ricerca è stato la messa a punto di una metodica estrattiva ed analitica che permettesse la determinazione simultanea di alcune vitamine idrosolubili nella loro forma libera (tiamina, riboflavina, acido nicotinico, nicotinammide, acido ascorbico) nei capolini primari di alcune cultivar di piante di carciofo. La preparazione e omogeneizzazione del campione è stata effettuata con molteplici approcci (omogeneizzazione in Turrax, triturazione in blender, triturazione in azoto liquido). Sono state applicate e confrontate diverse procedure di estrazione con miscele solvente di tipo acquoso, valutando inizialmente condizioni sperimentali più blande e prive di trattamenti ad alta temperatura. E’ stato valutato l’utilizzo di condizioni neutre o acide (a diversa concentrazione e diversopH) nell’ambiente estrattivo.
Infine, è stato valutato l’effetto dei trattamenti post-estrattivi (centrifugazione, filtrazione, liofilizzazione) e della purificazione tramite SPE sul recupero degli analiti da miscele di sta ndard e dalla matrice naturale.
La prima estrazione è stata effettuata secondo quanto riportato da Aslam e colleghi per i germogli di ceci, con alcune modifiche32. Invece di un’estrazione a 70 °C, la stessa miscela estraente è stata messa in agitazione col campione,triturato in Turrax a temperatura ambiente e in atmosfera di N2, per prevenire i fenomeni di degradazione legati all’ossigeno ed al calore.
Inoltre, per aumentare la resa estrattiva e la visibilità alla spettroscopia UV nel detector, è stato utilizzato un quantitativo maggiore di campione in rapporto al volume di miscela di estrazione, e successivamente gli estratti sono stati concentrati 1 a 5 in centrifuga sottovuoto, secondo la procedura riportata nello schema 1.
Schema 1:
Triturazione: omogeneizzazione in Turrax (12.000 rpm, 5 min)
Estrazione con solvente:miscela di ACN (5 %) e AcOH (1 %) in H2O, agitazione per 40
min a temperatura ambiente sotto atmosfera di N2
Trattamento successivo: centrifugazione (12.000 g, 10 min a 4°C), concentrazione sottovuoto (1 a 5).
Le analisi sono state effettuate con la colonna a fase inversa alchilammidica (SUPELCO LC-ABZ), le condizioni cromatografiche indicate dal gradiente ‘b’ e lettura a 260 nm.
Tempo (min) Flusso (ml/min) %Organico % Tampone
0,00 1.0 0 100 5,00 1.0 0 100 8,00 1.0 20 80 15,00 1.0 20 80 18,00 1.0 0 100 30,00 1.0 0 100
Per quanto riguarda i risultati, le analisi non hanno dato esito positivo, probabilmente per una scarsa efficienza estrattiva, o perché la presenza degli analiti era al di sotto dei limiti di rilevabilità della metodica. Considerando come punto critico la sensibilità strumentale, il processo estrattivo è stato condotto utilizzando una minore quantità di solvente (60 ml per ca. 75 g di campione). In uno studio parallelo, per verificare la capacità di recupero di tali composti dopo il processo estrattivo, l'estrazione è stata effettuata su tre aliquote di carciofo: la prima contenente il solo campione, la seconda dopo aggiunta di acido ascorbico e la terza dopo aggiunta di riboflavina. Le modifiche apportate non hanno fornito risultati incoraggianti. Gli estratti sono stati concentrati 1a 5, in modo da rendere gli analiti più concentrati, negli estratti con aggiunte (tracciato rosso e blu) e senza aggiunte (tracciato verde). Quest’ultimo sembra non contenere, in quantità apprezzabile, alcuno dei composti di nostro interesse, eccezion fatta per la riboflavina. 5 10 15 20 0 100 200 300 400 500 mAU 0 100 200 300 400 500 mAU 0 100 200 300 400 500 mAU
Fig. 1: estrazione a tempera tura a mbiente, estratti senza aggiunte (tracciato verde) e con aggiunta di acido ascorbico o riboflavina effettuata in fase estra ttiva (tracciato blu e rosso, rispett.) analizzati dopo concen trazione 1 a 5 sottovuoto.
La mancata estrazione dei componenti vitaminici di nostro interesse è confermata dalle aggiunte effettuate, prima dell’analisi, sull’estratto concentrato 1 a 5. Le aggiunte seriali di acido nicotinico, nicotinammide e acido ascorbico (tracciato rosso, verde e blu, rispett.) all’estratto (tracciato marrone) mettono in luce l’avvenuta estrazione della sola nicotinammide, peraltro in quantità molto basse rispetto agli altri componenti dell’estratto.
Un risultato analogo è stato ottenuto anche dopo l'analisi CZE.
Fig. 2: estrazione a temperatura a mbien te, estratto senza aggiunte ( tra ccia to blu) e con aggiunta di acido nicotinico, nico tinammide e a cido ascorbico effettuata p rima dell’analisi (tracciato rosso, verde e marrone, rispett.) analizzati dopo concentrazione 1 a 5 sottovuoto.
5 1 0 1 5 2 0 2 5 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 mA U 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 mA U 0 1 0 2 0 3 0 mA U 0 2 5 5 0 7 5 10 0 12 5 mA U
Fig. 3: estrazione a tempera tura a mbiente, elettroferogramma in modalità CZE dell’estratto senza aggiunte concen trato 1 :5 [1] e dell'estratto con aggiunta di riboflavina in fase estra ttiva, concen tra to 1:5 [2].
Fig. 4: Nell’elettroferogramma *1+ sono riporta te le aggiunte (nico tinamide [1], a cido ascorbico [2], riboflavina [3], acido nicotinico [4], tia mina *5+) effettua te sull’estratto. Le analisi sono sta te svolte in modalità micella re. Detecto r UV: 260 nm. 1 2 4 3 5
Come si può vedere dagli elettroferogrammi relativi all’estratto, le analisi in modalità CZE e MEKC risultano complicate quando la matrice è molto complessa, e comportano un profilo elettroforetico che non consente l’individuazione di picchi definiti anche in seguito alle aggiunte dei composti di riferimento. Pertanto, nell’attesa di una mettere a punto una procedura più efficiente per l’estrazione e la purificazione, le analisi degli estratti di carciofo sono state condotte in HPLC.
Nella seconda metodica estrattiva è stata adottata una procedura di scottatura (“blanching”) del campione ad alta temperatura (80°C) in un tempo breve (5 min), al fine di bloccare le reazioni degradative di tipo enzimatico. La miscela estraente utilizzata è uguale a quella della prima estrazione (acetonitrile 5% e acido acetico 1% in H2O)ed il campione,
costituito da “cuori” di carciofi congelati, è stato successivamente triturato in un tritatutto domestico (“blender”) in atmosfera inerte di N2, secondo lo schema 2.
Schema 2:
Scottatura con solvente: miscela di ACN (5 %) e AcOH (1 %) in H2O, in agitazione per
5min a 80 °C in atmosfera di N2.
Triturazione-estrazione: omogeneizzazione in tritatutto (blender) in atmosfera di N2.
Trattamento successivo: centrifugazione (12000 g, 10 min a 4°C), concentrazione sottovuoto.
Analizzando gli estratti ottenuti, i risultati hanno evidenziato che la procedura non si è rivelata efficiente per il riconoscimento e la possibile quantificazione simultanea delle vitamine idrosolubili considerate.
I risultati ottenuti dagli studi condotti in HPLC attraverso le aggiunte dei composti standard all'estratto, sembravano mettere in evidenza l'avvenuta estrazione dell'acido nicotinico e dell'acido ascorbico (fig. 5).
Le stesse aggiunte effettuate sull'estratto concentrato (1 a 5) mostrano una situazione dubbia per entrambi i composti, in quanto l'acido nicotinico presenta un picco slargato, che probabilmente deriva da sovrapposizione con interferenti, mentre per l'acido ascorbico lo spettro UV non è sovrapponibile a quello dello standard di riferimento (fig. 6).
5 10 15 20 25 Minutes 0 25 50 75 100
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\marzo 2011\11-03\ex blanch int t.q. + ac.ascor.run
0 25 50 75 100
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\marzo 2011\11-03\ex blanch int t.q. + nicotinam.run
0 50 100 150
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\marzo 2011\11-03\ex blanch int t.q. + ac.nic.run
0 25 50 75
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\marzo 2011\11-03\ex blanch int t.q..run
10 20 30 40 50
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\marzo 2011\11-03\mix x5 iniz.run
Fig. 5: estrazione tramite “blanching”, estratto sen za aggiunte (tracciato ro sso) e con aggiunta di acido nicotinico, nicotina mmide e acido asco rbico effettuata prima dell’analisi (tra ccia to verde, ma rrone e rosa, rispett.); blu: miscela di standard di riferimento .
Per valutare la degradazione dei composti a causa del calore, una miscela di composti standards di riferimento (20 ppm cad.) è stata sottoposta al processo di blanching. Il trattamento causa una perdita di acido ascorbico pari a circail 20 %, mentre gli altri composti conservano Rt, area del picco e spettro UV (fig. 7). Questo dato conferma che l’uso di calore nella fase estrattiva con solvente non determina una degradazione significativa degli analiti.
Fig. 6: estrazion e tramite “blan ching”, estratto senza aggiunte (tra ccia to rosso) e con aggiunta di acido nicotinico, nico tinammid e e acido ascorbico effettuata prima dell’analisi (tracciato verde, marrone e rosa , rispett.) analizzati dopo concentrazione 1 a 5 sottovuoto.
5 10 15 20 25 Minutes 10 30 mAU 50 mAU 50 mAU 50 mAU 100 mAU
I risultati ottenuti finora con estrazione in ambiente leggermente acido (AcOH 1%) a temperatura ambiente o in seguito a trattamento di blanching ci hanno indotto a considerare l’opportunità di effettuare un estrazione basata su un trattamento termico più lungo (50 °C per 4 h) in condizioni di maggiore acidità (HCl 0.1 N) e successivo alla fase di omogeneizzazione. Inoltre, per ottenere una concentrazione maggiore dell’estratto ed aumentare la rilevabilità dei componenti, uno step di liofilizzazione è stato effettuato al posto della concentrazione sottovuoto. Quindi, la procedura risulta essere quella riportata nello schema 3.
Schema 3:
Triturazione: omogeneizzazione in blender (10 min) in atmosfera di N2.
Estrazione con solvente: soluzione acquosa di HCl (0.1 N), agitazione per 4 h a 50 °C in atmosfera di N2
Trattamento successivo: centrifugazione (12.000 g, 10’ a 4°C, ripetuta due volte), liofilizzazione, purificazione SPE e concentrazione sottovuoto.
Fig. 7: estrazione tra mite “blanching”, miscela di co mposti standard (20 ppm cad.) p rima e dopo il trattamento (80°C per 5 min, blu e rosso , risp ett.).
5 1 0 1 5 2 0 Minute s 0 2 5 5 0 7 5 10 0 12 5 mA U 0 2 5 5 0 7 5 10 0 mA U
Parallelamente, una miscela di standards è stata sottoposta all’intero trattamento descritto, per verificare eventuali effetti di degradazione delle vitamine considerate.
I picchi corrispondenti ad acido nicotinico, nicotinammide e acido ascorbico, che sono presenti nel cromatogramma dell’estratto tal quale (tracciato blu, fig. 8), sono confermati dai cromatogrammi relativi al campione arricchito degli standard di riferimento.
Dopo la liofilizzazione, l’estratto è stato ripreso con acqua o metanolo (soluzione 200 mg/1 ml).
Per quanto riguarda l’analisi dell’estratto solubilizzato in metanolo (fig. 9), dal confronto tra l’estratto tal quale ed in seguito alle aggiunte, è confermata l’estrazione di acido nicotinico, mentre per la nicotinammide e l’acido ascorbico il risultato non è chiaro.
Fig. 8: estra zione a 50 °C per 2 h, estratto senza aggiunte (tra ccia to blu) e con aggiunta di acido nicotinico, nicotinammide e a cido asco rbico effettuata prima dell’analisi (tra ccia to rosso , verde e marrone, rispett.).
5 10 15 20 25 Minutes 0 10 20 30 40
mAU c :\s tar\data \enric o\v ita minix \ marz o 2011\24-03 (c uori + s pe)\ex c uori hc l 0.1 x 2.run
0 10 20 30
mAU c :\s tar\data \enric o\v ita minix \ marz o 2011\24-03 (c uori + s pe)\ex c uori t.q . + ac .nic .run
0 10 20 30
mAU c :\s tar\data \enric o\v ita minix \ marz o 2011\24-03 (c uori + s pe)\ex c uori t.q . + nic otina mm .run
0 10 20 30 40 50 60
Per la soluzione acquosa, sono stati ottenuti risultati analoghi (fig. 10).
Fig. 9: estra zione a 50 °C per 2 h, estratto liofilizza to in soluzione metanolica senza aggiunte (tracciato blu) e con aggiunta di a cido nico tinico, nico tinammide e a cido asco rbico effettuata prima d ell’anal isi (tracciato rosso, verde e ma rrone, risp ett.).
5 1 0 1 5 2 0 2 5 Minute s 0 1 0 2 0 3 0 mA U 0 1 0 2 0 3 0 mA U 0 1 0 2 0 3 0 mA U 0 1 0 2 0 3 0 mA U
Fig. 10: estrazione a 50 °C per 2 h, estratto liofilizza to in soluzione acquosa senza aggiunte (tracciato blu) e con aggiunta di acido nico tinico, nico tinammide e acido ascorbico effettuata p rima dell’analisi (tracciato rosso, verde e ma rrone, risp ett.).
5 1 0 1 5 2 0 2 5 Minute s 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 mA U 0 1 0 2 0 3 0 4 0 mA U 0 1 0 2 0 3 0 4 0 mA U 0 1 0 2 0 3 0 mA U
Al fine di verificare che l’assenza degli analiti di interesse fosse dovuta alla presenza di sostanze interferenti causando un significativo effetto matrice, la soluzione acquosa dell’estratto liofilizzato è stato sottoposto a purificazione SPE su silice C18 (Sep-pak®). 100 μl
dell’estratto in acqua sono stati caricati ed eluiti secondo il protocollo riportato (tab. 2).
caricamento campione 1 - 2 ml
lavaggio con tampone ammonio formiato 25 mM, pH 3.5 A1 – A2 (1 ml cad.)
eluizionecon miscela tampone-metanolo 70:30 B1 – B2 (1 ml cad.)
eluizione con MeOH 100 % C1 – C2 (1 ml cad.)
L’analisi delle varie frazioni eluite hanno confermato la mancata estrazione degli analiti di interesse.
Tab. 2 : proto collo SPE
Fig. 11: estrazione a 50 °C per 2 h, estratto liofilizzato in soluzione acquosa sottoposto a purificazione SPE; blu: miscela di standard di riferimento.
A 1 A 2 B 1 Caricamento campione 5 10 15 20 25 Minutes 25 50 75 mAU 2.5 7.5 12.5 mAU 0.0 2.5 5.0 mAU 0 5 10 mAU 0 10 20 mAU
Aumentando la quantità caricata sulla cartuccia (300 µl), la situazione sostanzialmente non cambia (fig. 12).
Un ulteriore sviluppo della metodica estrattiva è stato l’aumento della temperatura di estrazione a 90°C per 4 h in ambiente acido per HCl 0.1 N, modificando la procedura secondo quanto riportato nello schema 4. L’estrazione è avvenuta in parallelo su due aliquote di campione, di cui una addizionata di una miscela di standard di riferimento.
Fig. 12: estrazione a 50 °C per 2 h, estratto liofilizzato in soluzione acquosa sottoposto a pu rificazione SPE (300 µl): frazioni A1 - A2. Acido Ascorbico
A 2
A 1
5 10 15 20 Minutes 10 20 30 40 mAU -3 -1 1 mAU 0 10 20 30 mAU 0 10 20 30 mAU Riboflavina Nicotinammide Acido Nicotinico TiaminaSchema 4:
Triturazione: omogeneizzazione in blender (10’) in atmosfera di N2.
Estrazione con solvente: soluzione acquosa di HCl (0.1 N), agitazione per 4 h a 90 °C in atmosfera di N2
Trattamento successivo: centrifugazione (16.000 g, 10’ a 4°C, ripetuta due volte), liofilizzazione, purificazione SPE
In questo caso, dall’analisi dei cromatogrammi degli estratti ottenuti, si evince che la procedura a 90°C ha portato all’estrazione degli analiti di interesse (tiamina, acido ascorbico, acido nicotinico; fig. 13), confermata dall’analisi del campione arricchito degli standard di riferimento prima dell’analisi (fig. 14).
5 10 15 20 25 Minutes 0 100 200 300 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\aprile\15-04\cuor90 no aggno dil.run 1 = 260.00 nm Results NA 0 50 100 150 200 250 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\aprile\15-04\cuor90 +agg no dil.run 1 = 260.00 nm Results NA 1 3 2 4
Fig. 13: estrazion e a 90 °C per 4 h (cuo ri di ca rciofo congelati). Blu: estratto sen za aggiunte in fase estrattiva; rosso : estratto con aggiunta di una miscela di standard in fase estra ttiva. 1: tiamina ; 2: acido ascorbico; 3: acido nicotinico ; 4: nicotinammide.
La fig. 15 mostra il cromatogramma dell’estratto liofilizzato, senza aggiunte in fase estrattiva ed in seguito alle aggiunte di acido nicotinico, nicotinammide, tiamina e riboflavina. La presenza dell’acido nicotinico sembra confermata dalle aggiunte, insieme a piccole quantità di nicotinammide, mentre la tiamina non si sovrappone esattamente al picco presente nell’estratto, e la riboflavina non mostra assorbanza all’altra lunghezza d’onda selezionata per la sua identificazione ( = 365 nm).
Fig. 14: estrazion e a 90 °C per 4 h (cuori di carciofo congelati). Blu: estratto senza aggiunte in fase estrattiva; rosso, verde e ma rrone (rispett.): estratto con aggiunte sequenziali di acido nico tinico , nicotina mmid e e acido ascorbico (indicate dalle frecce).
5 10 15 20 Minutes 0 10 20 30 40 50 60 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\aprile\19-04 (cuori 90 + agg)\idem vero.run 1 = 260.00 nm Results NA 0 10 20 30 40 50 60 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\aprile\19-04 (cuori 90 + agg)\vero + ac nic 20 pp.run 1 = 260.00 nm Results NA 0 10 20 30 40 50 60 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\aprile\19-04 (cuori 90 + agg)\idem +2ac nic + nic.run 1 = 260.00 nm Results NA 10 20 30 40 50 60 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\aprile\19-04 (cuori 90 + agg)\preced + ac asc 2ul.run 1 = 260.00 nm Results
La soluzione acquosa dell’estratto liofilizzato senza aggiunte è stata sottoposta a purificazione SPE: nei lavaggi con tampone ammonio formiato pH 3.5 si nota la presenza di un picco compatibile con l’acido nicotinico (fig. 16). Inoltre, i cromatogrammi mostrano, nella porzione iniziale, un profilo analogo all’estratto non frazionato (cfr. con fig. 15): questo significa che, per la determinazione dei composti più polari eventualmente presenti nell’estratto (tiamina, acido ascorbico, acido nicotinico e nicotinammide), la purificazione con SPE risulta essere un passaggio inutile, che non implica un miglioramento apprezzabile del profilo cromatografico nella corretta determinazione degli analiti di interesse.
Fig. 15: estrazione a 90 °C per 4 h (cuori di carciofo congela ti). Dall’alto, blu: estratto liofilizzato (soluz. in H2O, 1
g/5 ml); rosso, verde, blu, rosso: estra tto con aggiunte sequenziali di acido nicotinico, nicotinammide, tiamina, riboflavina (indicate dalle frecce).
5 10 15 20 25 0 25 50 75 100 125 mAU 25 50 75 100 125 150 mAU 25 50 75 100 125 150 mAU Minutes 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Minutes 0 50 100 150 200 mAU 0 50 100 150 mAU
Il protocollo di estrazione appena descritto è stato successivamente applicato ad un campione di carciofo fresco commerciale denominato ‘GRALEO’: il campione, acquistato presso un negozio locale di frutta e verdura, è stato privato del gambo e delle brattee esterne, e subito congelato a -80 °C per bloccare le degradazioni di tipo enzimatico. Prima dell’estrazione, il campione è stato trasferito a -20 °C, e dopo qualche minuto è stato triturato in blender con la miscela di estrazione (HCl 0.1 N) in atmosfera inerte (N2) fino ad ottenere una sospensione
omogenea che è stata poi sottoposta al trattamento termico (90 °C, 4 h).
L’estratto ottenuto viene mostrato in fig. 17; dal confronto con un aliquota addizionata di una miscela di standard, si può affermare l’avvenuta estrazione di nicotinammide e acido ascorbico. La tiamina e l’acido nicotinico non sono chiaramente identificabili poiché coeluiscono con altri composti.
5 10 15 20 25 Minutes 0 10 20 30 40
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\maggio\02-05\mix x5 20-04 tampfo.run
0 10 20 30 40 50
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\maggio\02-05\cuo90 spe tamp100-1.run
0 25 50 75 100 125 mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\maggio\02-05\cuo90-tamp100-2.run WI:32 WI:16 A 1 A 2 Miscela di riferimento T. + A.A. A. Nic.
Fig. 16: estrazione a 90 °C per 4 h (cuori di carciofo congela ti), purificazione tramite SPE dell’estratto liofilizzato. Verde e marrone: lavaggi SPE con ta mpone ammonio fo rmia to pH 3.5 (A 1 – A 2). Blu: miscela di standard di riferimento.
Nell’ipotesi in cui la triturazione iniziale in blender potesse avere un effetto negativo sulle vitamine termosensibili o ossidabili (tiamina e acido ascorbico), a causa del trasferimento di calore dovuto all’azione meccanica esercitata sul campione e alla presenza della lama metallica, tale passaggio è stato sostituito con una triturazione con azoto liquido effettuata con mortaio e pestello in vetro: il carciofo, prelevato da -80 °C, viene trasferito in mortaio e triturato con pestello, aggiungendo progressivamente piccole aliquote di azoto liquido fino ad ottenere una polvere omogenea, e successivamente sottoposto ad estrazione con solvente (HCl 0.1 N, 90°C per 4 h), come riportato nello schema 5. Tale procedura consente una maggiore frammentazione dei tessuti, e quindi una migliore omogeneizzazione del campione. Per verificare se l’estrazione modificata risultasse efficiente, dall’estratto tal quale (denominato “GRALEO N2”) sono state prelevate cinque aliquote, ognuna delle quali addizionata di una
vitamina standard (40 ppm cad. eccetto riboflavina 20 ppm) e successivamente analizzata.
Fig. 17: estrazione a 90 °C per 4 h (“GRALEO”). Blu : estra tto tal quale: Rosso: estratto con aggiunta di una miscela di standard di riferimento.
5 10 15 20 Minutes 0 25 50 75 100
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\10-06\gral int noagg.run
0 25 50 75 100
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\10-06\gral int +agg.run
Ac. Nic. Tiamina
Nicotinammide Ac. Asc.
Schema 5:
Triturazione: triturazione in mortaio e pestello con N2 liquido
Estrazione con solvente: soluzione acquosa di HCl (0.1 N), agitazione per 4 h a 90 °C in atmosfera di N2
Trattamento successivo: centrifugazione (16.000 g, 10’ a 4°C, ripetuta due volte), liofilizzazione
La fig. 18 mostra l’estratto tal quale ed in seguito alle aggiunte dei 5 standard di riferimento: dal confronto dei cromatogrammi si può apprezzare l’avvenuta estrazione di tiamina, acido ascorbico, acido nicotinico e nicotinammide. La riboflavina non risulta visibile poiché coeluisce con altri composti: l’aggiunta dello standard, infatti, si sovrappone ad un grosso picco già esistente.
Fig. 18: estrazione a 90 °C per 4 h dopo tritu razione del campione in N2 liquido (“GRALEO N2”). Blu: estratto tal
quale; verde: estratto con aggiunta di nicotinammide; rosso, verd e, marrone, rosa, nero : estratto con aggiunte di, tiamina, acido nicotinico, nico tinammid e acido ascorbico e riboflavina (rispett.).
5 10 15 20 25 Minutes 0 10 20 30 40 50 60 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\16-06 (graleo n2 no agg - spe)\graleo n2 int .run 1 = 260.00 nm Results NA 0 10 20 30 40 50 60 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\16-06 (graleo n2 no agg - spe)\idem + tiam 40 ppm.run 1 = 260.00 nm Results NA 0 10 20 30 40 50 60 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\16-06 (graleo n2 no agg - spe)\idem + ac.nic.40ppm.run 1 = 260.00 nm Results NA 5 10 15 20 Minutes 0 10 20 30 40 50 60 70 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\16-06 (graleo n2 no agg - spe)\idem + nicotinam40p.run 1 = 260.00 nm Results NA 0 10 20 30 40 50 60 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\16-06 (graleo n2 no agg - spe)\idem + ascor40ppm.run 1 = 260.00 nm Results NA 0 10 20 30 40 50 60 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\16-06 (graleo n2 no agg - spe)\idem + ribofl20ppm.run 1 = 260.00 nm Results NA + Tiamina + Ac. Nicotin + Nicotinammide + Ac. Ascorbico + Riboflavina .
L’estrazione dopo triturazione con N2 è stata condotta anche sul campione addizionato
di una miscela di standard prima del trattamento con acido a caldo, per valutare l’eventuale degradazione dei composti in esame. Le analisi relative all’estratto con e senza l’aggiunta della miscela di vitamine standard è illustrata in fig. 19. Le aggiunte effettuate sono multipli dei quantitativi attesi dal processo estrattivo, sulla base dei dati nutrizionali e di composizione chimica degli alimenti riportati dagli enti regolatori. Si possono vedere chiaramente le aggiunte di acido ascorbico, acido nicotinico e nicotinammide, mentre le aggiunte di tiamina e riboflavina si fondono con picchi pre-esistenti. Le quantità di composti di riferimento individuate nell’estratto addizionato sono coerenti con la miscela di composti utilizzata per l’aggiunta e opportunamente diluita (ad eccezione dell’acido ascorbico, che viene degradato per ca. il 20%), dimostrando che la procedura di trattamento a 90°C in HCl 0.1 N in atmosfera di azoto è compatibile con il recupero quantitativo degli analiti.
Fig. 19: estrazione a 90 °C per 4 h dopo tritu razione del campione in N2 liquido (“GRAL EO N2”). Blu: estratto con
aggiunte effettuate in fase estrattiva; ro sso: miscela di standard aggiunta al ca mpione in fase post-estra ttiva.
5 10 15 20 Minutes -39 0 100 200 300 400
mAUc:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\15-06 (gral n2 + agg - spe)\gral n2 int oo.run
c:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\15-06 (gral n2 + agg - spe)\gral n2 int xx.run
Acido ascorbico Acido nicotinico Nicotinammide Riboflavina Tiamina
Dopo questi risultati, è stato verificato un eventuale “effetto sequestro”degli analiti in fase post-estrattiva, tramite l’aggiunta di una miscela di standard alla sospensione proveniente dal trattamento termico. Quest’ultima è stata divisa in due aliquote, ad una delle quali è stata addizionata una miscela di standard, e successivamente sottoposte alle fasi di centrifugazione (fig. 20). Come si vede nei cromatogrammi ottenuti, i picchi relativi alle aggiunte nel campione non subiscono variazioni consistenti rispetto alla miscela di riferimento opportunamente diluita, dimostrando che gli eventuali fenomeni di sottrazione degli analiti dovuti alla matrice ed al suo residuo solido (pellet) sono trascurabili.
L’analisi degli estratti ottenuti effettuata con la colonna Supelco LC -ABZ mostra la presenza di acido ascorbico, acido nicotinico e nicotinammide, facendo ipotizzare un miglioramento nell’estrazione degli analiti rispetto alle altre procedure sperimentate; pertanto, per verificare la visibilità degli analiti estratti in matrice complessa tramite elettroforesi capillare, tali estratti sono stati analizzati sia in modalità CZE che in modalità MEKC (fig. 21).
5 10 15 20 25 Minutes -40 0 100 200 300 400 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\16-06 (graleo n2 no agg - spe)\mix di graleo cfr.run 1 = 260.00 nm Results
NA
Fig. 20: estrazione a 90 °C per 4 h dopo triturazione d el ca mpione in N2 liquido (“GRALEO N2”). Blu: estratto
con aggiunte effettuate in fase estrattiva; rosso: miscela di standard aggiunta al campione in fase post-estrattiva .
Le due soluzioni, in acqua ed in metanolo, dell’estratto liofilizzato di Graleo N2 sono
state analizzate anche in CE. Anche in questo caso, gli elettroferogrammi ottenuti non permettono il riconoscimento dei componenti vitaminici (fig. 22).
Fig. 21: estrazione a 90 °C per 4 h dopo triturazione del campione in N2 liquido (“GRALEO N2”),
elettroferogra mmi d ell’estratto ottenuti in modalità CZE (a) e MEKC (b).
Minutes 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 AU 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 PDA - 260nm Minutes 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 AU 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 PDA - 260nm
a
b
L’analisi CE degli estratti di carciofo non si è rivelata idonea alla determinazione delle vitamine idrosolubili, poiché la complessità degli estratti, sia liofilizzati che non, produce elettroferogrammi complessi e poco intelligibili, su cui non è possibile riconoscere i costituenti vitaminici. Gli estratti di carciofo costituiscono, evidentemente, una matrice molto complessa che necessita di ulteriori passaggi di purificazione prima di poter essere analizzati in modo efficace con la tecnica CE. Pertanto, l’ottimizazione delle procedure inerenti l’uso dell’elettroforesi capillare sarà oggetto di studi futuri.
Per verificare la maggiore efficienza estrattiva di questa procedura, gli estratti ottenuti sono stati analizzati in HPLC anche con altre colonne cromatografiche in fase inversa, la Mediterranea SEA C18 e la Gemini C18.
Fig. 22: estra zione a 90 °C p er 4 h dopo triturazione del campione in N2 liquido (“GRAL EO N2”),
elettroferogra mmi ottenuti in modalità CZE (a) e MEKC (b) dell’estra tto liofilizzato in soluzione acquosa (I) e metanolica (II). Minutes 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 AU 0.00 0.01 0.02 0.03 PDA - 260nm Minutes 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 AU 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 PDA - 260nm Minutes 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 AU 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 PDA - 260nm Minutes 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 AU 0.00 0.01 0.02 0.03 PDA - 260nm
a
b
I
II
L’estratto senza aggiunte è stato analizzato con la colonna C18 Teknokroma utilizzando le
condizioni del gradiente ‘d’ ed il tampone formiato a pH 3.5; in questo caso, il campione è stato addizionato delle diverse vitamine standard in modo sequenziale, e le soluzioni ottenute vengono confrontate in fig. 23. Nonostante le aggiunte, non siamo in grado di confermare la presenza della nicotinammide, mentre è plausibile l’estrazione di piccole quantità di acido nicotinico e la stessa cosa si può dire di tiamina ed acido ascorbico (le frecce nere indicano le aggiunte rispetto al cromatogramma sottostante); il picco della riboflavina, se presente, si confonde con l’andamento irregolare della linea di base in quell’intorno.
Fig. 23: estrazione a 90 °C per 4 h dopo triturazione d el ca mpione in N2 liquido (“GRALEO N2”), analisi con
colonna Teknokroma C18, gradient e ‘d’, pH 3.5. Blu: estra tto senza aggiunte; rosso, verde, nero, fu csia,
marrone: estratto con aggiunte sequenziali.
5 10 15 20 25 0 50 100 150 mAU 0 50 100 150 mAU + Nicotinammide + Ac. Nicotinico 5 10 15 20 25 Minutes 0 25 50 75 100
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\24-06 (graleo n2+ agg. seq.)\graln2 noagg + asco.run
-25 0 25 50 75 100
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\24-06 (graleo n2+ agg. seq.)\graln2 no agg+ ribofl.run
0 25 50 75 100
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\24-06 (graleo n2+ agg. seq.)\graln2 no agg +tiam.run
+ Riboflavina + Ac. Ascorbico
Le analisi dell’estratto di “GRALEO N2” sono state effettuate anche utilizzando il
tampone ammonio formiato a pH 3 (fig. 24) ed eluizione con il gradiente ‘d’; in queste condizioni si osserva la maggiore ritenzione dell’acido ascorbico rispetto alla tiamina, e i due composti si invertono nell’ordine di uscita e nel profilo cromatografico (si veda la sez. “Messa a punto del metodo cromatografico HPLC”). A conferma di ciò, è stato analizzato il campione addizionato di una miscela di standard di riferimento. Anche in questo caso, sembra confermata la presenza di piccole quantità di acido ascorbico e acido nicotinico, mentre le aggiunte di nicotinammide e tiamina non possono essere identificate chiaramente nell’estratto addizionato, pertanto la loro presenza nell’estratto non può essere confermata. La riboflavina, anche tramite lettura a 365 nm, non è presente a livelli determinabili. Pertanto, rispetto all’uso del tampone formiato a pH 3.5, l’efficacia cromatografica migliora per l’acido ascorbico e l’acido nicotinico ma non per le altre vitamine in esame.
Fig. 24: estrazion e a 90 °C per 4 h dopo triturazione del campione in N2 liquido (“GRALEO N2”), analisi con colonna
Teknokroma C18, gradiente ‘d’, pH 3. Verde: estra tto con aggiunte; rosso : estratto senza aggiunte; blu: miscela
standard di riferimento . 5 10 15 20 25 Minutes 0 50 100 150 200
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\30-06 (ph=3 - supelco, teknokr.)\graln2 +agg int.run
0 50 100 150 200
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\30-06 (ph=3 - supelco, teknokr.)\gral n2 noagg int.run
0 25 50 75 100
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\30-06 (ph=3 - supelco, teknokr.)\mix x5 tek repeat.run
? ?
Tiamina Ac. ascorbi co
Ac. ni cotini co Ni cotinammide
Ri bofla vina
Infine, la valutazione della presenza delle vitamine negli estratti ottenuti è stata effettuata anche sulla colonna GEMINI C18: per l’analisi dell’estratto di Graleo N2, con e senza
aggiunte,sono state utilizzate le condizioni previste dal gradiente ‘d’ con tampone a pH 3, che si sono rivelate le migliori quando applicate sulla colonna Mediterranea SEA C18. Si nota
chiaramente come il profilo cromatografico ottenuto sia molto più chiaro rispetto all’uso di quest’ultima, e nell’estratto addizionato le aggiunte effettuate sono ben visibili rispetto ai picchi pre-esistenti relativi ai componenti dell’estratto (con la sola eccezione della tiamina), a differenza di quanto osservato con le altre colonne (fig. 25). Si può apprezzare l’avvenuta estrazione di acido ascorbico e acido nicotinico, mentre tiamina e nicotinammide sembran o totalmente assenti o al di sotto del limite di rilevabilità. Ma soprattutto, per la prima volta dall’inizio dello studio cromatografico, l’analisi ci consente di individuare la riboflavina nell’estratto addizionato senza dover ricorrere alla lettura a differenti lunghezze d’onda: a 260 nm, il composto sembra presente in piccole quantità nell’estratto non addizionato, ma la lettura a 365 nm smentisce tale osservazione.
Fig. 25: estrazione a 90 °C per 4 h dopo tritu razione del ca mpione in N2 liquido (“GRAL EO N2”), analisi con colonna
GEMIN I C18, metodo ‘d’, pH 3 . Verde: estratto con aggiunte; rosso: estratto senza aggiunte; blu: miscela standard
di riferimento 40 ppm (tranne riboflavina 30 ppm).
Tiamina Ac. ascorbi co
Ac. ni cotini co Ni cotinammide
Ri bofla vina 5 10 15 20 25 Minutes 0 25 50 75 100
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\luglio\01-07\graln2 +agg intgemi.run
0 25 50 75 100
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\luglio\01-07\graln2 no agg intge.run
0 25 50 75 100
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\luglio\01-07\idem + ascorb50ul.run
WI:32 WI:16 Tiamina Acido Ni cotini co Acido As corbico Ni cotinammide Ri bofla vina
L’estratto di Graleo N2 è stato analizzato anche dopo liofilizzazione: le fig. 26 e 27
mostrano il cromatogramma relativo alla soluzione dell’estratto liofilizzato in H2O ed in
metanolo (soluzioni 200 mg/1 ml, diluite 1:5). Dal confronto tra le soluzioni acquose degli estratti liofilizzati con e senza aggiunte, è visibile l’estrazione di acido nicotinico, nicotinammide e quantità minori di tiamina ed acido ascorbico. Il confronto tra le soluzioni metanoliche degli estratti liofilizzati conferma solo in parte tale osservazione, poiché i tempi di ritenzione risultano meno riproducibili.
Fig. 26: estra zione a 90 °C per 4 h dopo tritu razione del ca mpione in N2 liquido (“GRALEO N2”), analisi con
colonna GEMINI C18, gradiente ‘d’, pH 3. Blu: estratto liofilizzato (soluz. H2O, diluito 1 a 50 con H2O); rosso:
estratto liofilizzato (soluz. H2O, diluito 1 a 5 con H2O).
5 10 15 20 25 Minutes 0 25 50 75
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\luglio\05-07 (gral n2 liof - soluz h2o)\graln2 lio int 1 a 50 repeat.run
0 25 50 75
Anche l’estratto di GRALEO ottenuto con l’uso del blender (invece che per triturazione con N2) è stato analizzato con la colonna Mediterranea SEA C18 ed il tampone a pH 3, per avere
ulteriore conferma dell’estrazione degli analiti considerati (fig. 28). Anche in questo caso, le aggiunte effettuate sembrano confermare la presenza di acido ascorbico e acido nicotinico, mentre tiamina e nicotinammide continuano a non essere visibili come aggiunte e non confermabili nell’estratto; la riboflavina risulta ancora invisibile anche a 365 nm.
Fig. 27: estrazione a 90 °C per 4 h dopo tritu razione del ca mpione in N2 liquido (“GRAL EO N2”), analisi con
colonna GEMINI C18, gradiente ‘d’, pH 3. Blu : estratto liofilizzato (soluz. MeOH, diluito 1 a 50 con H2O);
rosso: estratto liofilizzato (soluz. MeO H, diluito 1 a 5 con H2O); verde: miscela di standard di riferimento.
5 10 15 20 25 Minutes 0 25 50 75 100
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\luglio\06-07 (no agg. in meoh - spe)\graln2 liomeoh 1a50.run
0 25 50 75
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\luglio\06-07 (no agg. in meoh - spe)\graln2 liomeoh 1 a5.run
0 25 50 75
Tale estratto è stato analizzato con il tampone formiato a pH 3 anche con colonna Gemini C18; si apprezza la presenza di acido ascorbico, acido nicotinico,nicotinammide e
riboflavina, anche se per quest’ultima la lettura a 365 nm non fornisce una conferma univoca (fig. 29). Questo risultato è coerente con quanto osservato per il Graleo N2 (infatti, l’acido
nicotinico, la nicotinammide e la riboflavina non subiscono degradazione termica), e conferma la migliore performance della metodica ottimizzata sulla colonna Gemini rispetto alle altre colonne, dato che tutte le aggiunte all’estratto risultano visibili.
5 10 15 20 25 Minutes 0 25 50 75 100 125
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\30-06 (ph=3 - supelco, teknokr.)\gralblen +agg int.run
0 25 50 75 100 125
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\30-06 (ph=3 - supelco, teknokr.)\gralblen noagg int.run
0 25 50 75 100
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\giugno\30-06 (ph=3 - supelco, teknokr.)\mix x5 tek repeat.run
WI:32 WI:16 ? ? Ri bofla vina Ni cotinammide Ac. ni cotini co Ac. ascorbi co Tiamina
Fig. 28: estrazione a 90 °C per 4 h (“ GRALEO”), analisi con colonna Teknokroma C18, gradiente ‘d’, pH 3.
Ad ogni modo, l’uso della colonna Gemini C18 e del tampone a pH 3.0 ha mostrato una
selettività maggiore verso i composti presenti negli estratti di carciofo ottenuti con la procedura estrattiva n°5, ed ha permesso la determinazione delle cinque vitamine idrosolubili considerate in tali campioni, un risultato che non era stato possibile ottenere con la colonna Supelco LC -ABX alchilammidica, a pH 3.5, e con la Mediterranea SEA C18, sia a pH3.5 che a pH 3.0. Inoltre, il
confronto tra le analisi relative agli estratti del campione “Graleo” ottenuti in seguito a triturazione in blender ed a triturazione con azoto liquido in mortaio e pestello ha dimostrato come la triturazione con azoto liquido, associata alla procedura estrattiva n°5, comporti una maggiore efficienza estrattiva per i composti molto polari tra cui le vitamine idrosolubili in oggetto; inoltre, la successiva liofilizzazione dell’estratto è associata ad una migliore intelligibilità degli analiti di interesse rispetto agli estratti non liofilizzati.
Fig. 29: estrazione a 90 °C per 4 h (“ GRALEO”), analisi con colonna GEMIN I C18, metodo ‘d’, pH 3. Verde: estratto
con aggiunte; rosso: estratto senza aggiunte; blu: miscela standard di riferimento .
5 10 15 20 25 Minutes 0 25 50 75 100
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\luglio\01-07\gralblen +agg int.run
0 25 50 75 100
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\luglio\01-07\gralblen noagg int.run
0 25 50 75 100
mAU c:\star\data\enrico\vitaminix\luglio\01-07\idem + ascorb50ul.run
WI:32 WI:16 Ri bofla vina Ni cotinammide Ac. ni cotini co Ac. ascorbi co Tiamina
Il protocollo di estrazione così costituito (triturazione in N2 liquido – estrazione a 90 °C
per 4 h – liofilizzazione) ha fornito, fino ad ora, i risultati migliori in termini di efficienza estrattiva degli analiti di nostro interesse; le fasi principali che costituiscono il protocollo vengono riunite nello schema 5, che riproponiamo qui di seguito:
Schema 5:
Triturazione: triturazione in mortaio e pestello con N2 liquido
Estrazione con solvente: soluzione acquosa di HCl (0.1 N), agitazione per 4 h a 90 °C in atmosfera di N2
Trattamento successivo: centrifugazione (16.000 g, 10’ a 4°C, ripetuta due volte), liofilizzazione
Nelle fasi successive della nostra indagine, tale procedura è stata applicata a campioni di carciofi provenienti da un’azienda locale che effettuaagricoltura sperimentale. Qui di seguito viene mostrati i risultati relativi all’estrattonon liofilizzato del campione “Empolese”, dopo estrazione effettuata con e senza aggiunta di una miscela di standard in fase estrattiva, allo scopo di avere una ulteriore indicazione sulla degradazione dei composti durante e dopo il trattamento termico in ambiente acido.
il campione, dopo la raccolta, è stato privato del gambo e delle brattee esterne, e subito congelato a -80 °C per bloccare le degradazioni di tipo enzimatico. Prima dell’estrazione, il campione è stato trasferito a -20 °C, e dopo qualche minuto è stato triturato in blender con la miscela di estrazione (HCl 0.1 N) in atmosfera inerte (N2) fino ad ottenere una sospensione
omogenea che è stata poi sottoposta al trattamento termico (90 °C, 4 h). Le analisi sono state effettuate con la colonna Gemini C18 e le condizioni relative al gradiente ‘d’.
L’estratto con aggiunte a 2 h filtrato è stato addizionato della stessa miscela di vitamine (diluita 1 a 10: 90 ul di estratto + 10 ul di miscela) addizionata prima dell’estrazione, per confermare la posizione dei picchi nell’estratto. Dal confronto dei Rt con una miscela di
standard a concentrazione pari all’aggiunta (la miscela stessa delle aggiunte diluita 1 a 10) e con il campione addizionato, e dal confronto degli spettri UV si ottiene l’assegnazione dei picchi dei composti nel cromatogramma (fig. 30).
Se vengono paragonati gli estratti a 2 ore e a 4 ore con aggiunte in fase estrattiva, filtrati su membrana in PVDF 0.45 µm prima dell’analisi, si può vedere come i picchi corrispondenti alle aggiunte effettuate non subiscono variazioni sostanziali (a parte la riboflavina che non è determinabile); pertanto, il tempo di estrazione pari a 2 ore risulta sufficiente per l’estrazione delle vitamine suddette (addirittura la nicotinammide risulta maggiore a 4 h, forse per errata integrazione). Si nota come l’estrazione a 4 ore comporta un maggior recupero di alcuni composti con tempo di ritenzione compreso tra 15 e 20 min (fig. 31).
Fig. 30: estrazione a 90 °C per 2 h dopo triturazione del campione in N2 liquido (“EMPOLESE N2”), analisi con
colonna GEMIN I C18, metodo ‘d’, pH 3. Verde: estra tto con aggiunte in fase estrattiva ; rosso: come il verde più
aggiunte di conferma; blu : miscela standard di riferimento.
5 10 15 20 25 Minute s 0 100 200 300 mAU 0 100 200 300 mAU 0 100 200 300 mAU
Dal confronto tra l’estratto a 2 h con aggiunte filtrato e non filtrato, si può apprezzare come il profilo sia praticamente identico, pertanto il campione può essere filtrato direttamente su membrana senza interporre la fase di centrifugazione in Eppendorf precedente all’analisi (fig. 32). 5 10 15 20 25 Minutes 0 25 50 75 100 125 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\novembre 2011\04-11\empl agg 2h filt.run 1 = 260.00 nm Results NA 0 25 50 75 100 125 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\novembre 2011\04-11\emp agg 4h filt.run 1 = 260.00 nm Results
NA
Fig. 31: estrazione a 90 °C dopo triturazione del campione in N2 liquido (“EMPOLESE N2”), analisi con colonna
GEMIN I C18, metodo ‘d’, pH 3. Verd e: estrazione a 2 h con aggiunte in fase estrattiva; rosso : estrazione a 4 h
Come per gli altri estratti dei carciofi provenienti da agricoltura sperimentale oggetto del nostro studio, l’estratto ottenuto è stato liofilizzato, e del residuo solido ottenuto sono state preparate soluzioni in MeOH, H2O e nel tampone di corsa (200 mg/1.0 ml). Quest’ultima
mostra una maggiore separazione dei picchi presenti nella porzione iniziale del cromatogramma (da 0 a 15 min), pertanto gli estratti liofilizzati verranno successivamente disciolti nel tampone di corsa per l’analisi cromatografia (fig. 33).
5 10 15 20 25 Minutes 0 25 50 75 100 125 150 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\novembre 2011\04-11\empl agg 2h filt.run 1 = 260.00 nm Results NA 0 25 50 75 100 125 150 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\novembre 2011\04-11\empol 2h +agg nofil.run 1 = 260.00 nm Results
NA
Fig. 32: estrazione a 90 °C per 2 h dopo triturazione del campione in N2 liquido (“EMPOLESE N2”), analisi con
colonna GEMINI C18, metodo ‘d’, pH 3. Verde: estratto con aggiunte filtrato; rosso: estratto con aggiunte non
All’estratto a 2 h liofilizzato e ripreso in tampone (blu) sono state fatte aggiunte sequenziali dei composti di riferimento (indicati dalle frecce nere), per verificare l’estrazione di questi ultimi. I cromatogrammi relativi alla singola aggiunta sono ordinati dal basso verso l’alto (fig. 34). Confrontando il cromatogramma di un estratto (con aggiunta) con il precedente (senza aggiunta), si nota la presenza della nicotinammide, in quantità visibili, e dell’acido nicotinico, che risulta molto abbondante rispetto alle altre vitamine estratte; si nota anche la presenza di piccole quantità di acido ascorbico e tiamina, mentre la determinazione della riboflavina non risulta possibile a questa lunghezza d’onda: l’aggiunta è visibile a 365 nm, ma in tali condizioni la presenza nell’estratto non risulta comunque possibile.
Fig. 33: estrazione a 90 °C p er 2 h dopo tritu razione del ca mpione in N2 liquido (“EMPOLESE N2”), analisi con
colonna GEMINI C18, metodo ‘d’, pH 3. Verde: estratto liofilizzato, solu zione in tampone ammonio formia to
25 mM, pH 3; rosso : estra tto liofilizzato, soluzion e in acqua; blu: estratto liofilizzato, soluzione in MeOH.
5 10 15 20 25 Minutes 0 25 50 75 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\novembre 2011\10-11\empol no agg repeat.run 1 = 260.00 nm Results NA 0 25 50 75 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\novembre 2011\09-11\empol n2 lio h2o 1a5.run 1 = 260.00 nm Results NA 0 25 50 75 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\novembre 2011\09-11\empol n2 lio meoh 1a5.run 1 = 260.00 nm Results NA WI:32 WI:16 WI:3 2 WI:3 2 WI:1 6
5 10 15 20 25 Minutes 0 25 50 75 mAU File: Channel: Last recalc: c:\star\data\enrico\vitaminix\novembre 2011\10-11\idem+ac.nic+nic.amm.run 1 = 260.00 nm Results NA 0 25 50 75 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\novembre 2011\10-11\idem + nic.amm 5ppm.run 1 = 260.00 nm Results NA 0 25 50 75 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\novembre 2011\10-11\empoln2 lio tamp1a5.run 1 = 260.00 nm Results
NA
WI:32
WI:32 WI:16
Fig. 34: estrazione a 90 °C per 2 h dopo tritu razione del campione in N2 liquido (“EMPOLESE N2”), analisi con
colonna GEMINI C18, metodo ‘d’, pH 3. Blu: estra tto liofilizzato , soluzione in tampone a mmonio fo rmia to 25
mM, pH 3 . Rosso-nero: id em + aggiunte sequenziali degli standard di riferimento .
5 10 15 20 25 Minutes 0 25 50 75 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\novembre 2011\11-11\empoln2lio +agg+rib.run 1 = 260.00 nm Results NA 0 25 50 75 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\novembre 2011\11-11\empoln2lio +agg +ti.run 1 = 260.00 nm Results NA 0 25 50 75 mAU File: Channel: Last recalc:
c:\star\data\enrico\vitaminix\novembre 2011\11-11\empoln2lio +agg +as.run 1 = 260.00 nm Results
NA
WI:32 WI:16
Conclusioni
Per quanto riguarda la messa a punto delle metodiche analitiche in HPLC, le prove effettuate con le diverse fasi stazionarie in nostro possesso (HILIC, RP-amide, RP-C18) hanno
permesso di sviluppare un protocollo cromatografico per la separazione delle vitamine idrosolubili considerate. Per la cromatografia HILIC, una separazione soddisfacente è stata ottenuta tramite eluizione isocratica con miscela acetonitrile – tampone ammonio acetato (50 mM, pH 5.8); la fase inversa di tipo alchilammidico ci ha consentito una buona separazione tramite l’applicazione dei gradienti ‘a’ e ‘b’ utilizzando acetonitrile e tampone ammonio formiato 25 mM a pH 3.5, mentre le fasi inverse C18 hanno mostrato una buona capacità
separativa tramite eluizione con i gradienti ‘c’ e ‘d’ utilizzando acetonitrile (o acetonitrile/metanolo 80:20) e tampone ammonio formiato 25 mM a pH 3.5 e 3.0. In particolare, la colonna Gemini C18 ha mostrato un ottima separazione con l’utilizzo del tampone
a pH 3.0, dimostrando una selettività verso gli analiti in questione maggiore rispetto a lle altre colonne a fase inversa che sono state studiate.
Riguardo invece alla tecnica di elettroforesi capillare, le prove effettuate sulle miscele di standard hanno consentito una separazione efficiente delle vitamine idrosolubili considerate, sia in modalità CZE, utilizzando tampone borato 100 mM a pH 8.2 come elettrolita di sfondo, sia in modalità MECK, utilizzando tampone borato 40 mM pH 8.2 e SDS 60 mM.
L’applicabilità delle metodiche sviluppate a miscele di vitamine idrosolubili in matrice semplice è stata verificata dalle analisi HPLC e CE di preparati multivitaminici (SUSTENIUM PLUS® e Berocca Plus®). Entrambe le tecniche analitiche hanno consentito la determinazione di tutti i componenti vitaminici riportati nella composizione dei preparati. In particolare, entrambe le metodiche sviluppate in elettroforesi capillare (CZE e MEKC) permettono di ottenere ottima risoluzione dei componenti in tempi di analisi più contenuti rispetto alla tecnica HPLC.
Una parte importante del lavoro svolto ha riguardato il tentativo di messa a punto di una procedura efficace per l’estrazione simultanea delle vitamine idrosolubili considerate da matrice vegetale complessa, rappresentata dal carciofo. In particolare, la triturazione del campione con azoto liquido e l’estrazione a caldo con acido cloridrico 0.1 N (90°C per 2 o 4 h) si sono rivelati passaggi fondamentali per l’estrazione delle vitamine idrosolubili dal carciofo. Gli
estratti ottenuti sono stati trattati con procedure di concentrazione sottovuoto, purificazione SPE e la liofilizzazione. Nessuna di queste procedure ha prodotto miglioramenti significativi nella visibilità dei componenti vitaminici presenti negli estratti.
L’analisi degli estratti in HPLC è stata effettuata su materiali adsorbenti in fase inversa di tipo alchilammidico (RP-amide) e RP-C18, entrambe di tipo “end-capped”. Le colonne di
quest’ultimo tipo, ed in particolare la Gemini C18, hanno consentito la determinazione di tutte
le vitamine idrosolubili considerate presenti negli estratti, utilizzando eluizione in gradiente ‘d’ con tampone ammonio formiato 25 mM a pH 3.0. E’ stato visto come l’aumento di sole 0.5 unità di pH (fino a 3.5) del tampone comporta la differente ritenzione dell’acido ascorbico nelle colonne C18, e risulta in una separazione meno efficiente delle vitamine rispetto agli altri
componenti, con una performance analitica generale inferiore. Al contrario, le prove effettuate in CE hanno mostrato una complessità degli elettroferogrammi, ottenuti in entrambe le modalità, che non consente la determinazione delle vitamine presenti, pertanto l’ottimizzazione dell’analisi degli estratti in CE sarà oggetto di studi futuri.
Un aspetto particolarmente interessante sulla procedura di estrazione risiede nel fatto che, nonostante la letteratura riporti quantità significative di vitamina C nel carciofo (100 ppmca.), le nostre analisi non hanno rivelato la presenza di simili quantità; per comprendere il risultato, una controprova con test enzimatico (basato sull’attività dell’ascorbato deidrogenasi ) è stata effettuata su un altro campione di carciofo “Graleo”, che ha fornito risultati analoghi ai nostri confermando la validità estrattiva ed analitica delle nostre procedure; pertanto, si è ipotizzato che, in risposta alla raccolta, si attivino alcuni processi enzimatici di stress veloce che portano alla degradazione della percentuale maggiore di acido ascorbico nel periodo immediatamente successivo alla raccolta.
