Manuale di laboratorio dell OMS per l esame e il trattamento del liquido seminale. Sesta edizione

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per l’esame e il trattamento del liquido seminale

Sesta edizione

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per l’esame e il trattamento del liquido seminale

Sesta edizione

Traduzione del WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen, Sixth Edition a cura della Società Italiana di Andrologia (SIA) e della Società Italiana di Riproduzione Umana (SIRU)

S.I.R.U.

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Questa traduzione non è stata curata dall’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS). L’OMS non è responsabile del contenuto o dell’accuratezza di questa traduzione. L’edizione originale inglese WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen, Sixth Edition. Geneva: World Health Organization; 2021. Licence: CC BY-NC-SA 3.0 IGO è l’edizione vincolante e autentica.

Alcuni diritti riservati. Questo lavoro è disponibile sotto la licenza Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 3.0 IGO (CC BY-NC-SA 3.0 IGO, https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/igo).

Design grafico di Lushomo

Finito di stampare nel maggio 2022 per i tipi di Lineagrafica srl, Città di Castello (PG)

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Premessa ... vii

Ringraziamenti ... viii

Acronimi e abbreviazioni usati in questo manuale ... xii

Capitolo 1: Introduzione ...1

1.1 Scopo del manuale ...1

1.2 Introduzione ...1

1.3 La sesta edizione ...2

1.4 Metodologia per la preparazione della sesta edizione del Manuale di laboratorio dell’OMS per l’esame e il trattamento del liquido seminale ...4

Capitolo 2: Esame di base ...9

2.1 Introduzione ...9

2.2 Sequenza temporale delle fasi dell’esame di base del liquido seminale ...12

2.3 Procedure pre-esame ...13

2.4 Procedure di esame e post-esame ...15

2.5 Informazioni e commenti aggiuntivi ...64

Capitolo 3: Esame esteso ...83

3.1 Indici di difetti multipli dello spermatozoo ...83

3.2 Frammentazione del DNA nemaspermico ...86

3.3 Test genetici e genomici ... 105

3.4 Test relativi all’immunologia e ai metodi immunologici ... 108

3.5 Valutazione delle interleuchine come marcatori di infiammazione del tratto genitale maschile ... 116

3.6 Valutazione delle cellule germinali immature nel liquido seminale ... 118

3.7 Analisi degli antigeni di superficie degli spermatozoi ... 119

3.8 Test biochimici per la funzione delle ghiandole accessorie ... 125

3.9 Valutazione della sequenza dell’eiaculazione ... 135

Capitolo 4: Esami avanzati ...139

4.1 Test dello stress ossidativo e delle specie reattive dell’ossigeno nel liquido seminale ... 140

4.2 Valutazione della reazione acrosomiale ... 144

4.3 Valutazione della cromatina nemaspermica ... 149

4.4 Flusso e trasporto degli ioni transmembrana negli spermatozoi ... 152

4.5 Analisi computerizzata del liquido seminale (CASA) ... 155

4.6 Tecnologie emergenti... 159

(5)

5.2 Principi generali ... 163

5.3 Lavaggio semplice ... 164

5.4 Swim-up diretto... 165

5.5 Gradienti di densità discontinui ... 166

5.6 Selezione magnetica delle cellule attivate (MACS) ... 166

5.7 Preparazione di campioni di liquido seminale con infezione da HIV ... 167

5.8 Preparazione di spermatozoi testicolari ed epididimali ... 168

5.9 Preparazione di campioni da eiaculazione retrograda ... 169

5.10 Preparazione di campioni da eiaculazione stimolata ... 170

Capitolo 6: Crioconservazione degli spermatozoi ...171

6.1 Introduzione ... 171

6.2 Indicazioni per la crioconservazione degli spermatozoi ... 172

6.3 Valutazione dei rischi della crioconservazione e dello stoccaggio degli spermatozoi umani ... 174

6.4 Protocolli di crioconservazione degli spermatozoi ... 177

6.5 Vitrificazione ... 182

Capitolo 7: Assicurazione di qualità e controllo di qualità ...185

7.1 Controllo di qualità nel laboratorio di andrologia ... 185

7.2 La natura degli errori nell’analisi del liquido seminale ... 188

7.3 Il programma di QA ... 190

7.4 Grafici QC per valori numerici ... 193

7.5 Grafici QC per valori percentuali... 197

7.6 Valutazione delle carte Xbar e S ... 197

7.7 Procedure statistiche di analisi e registrazione della variabilità tra operatori ... 199

7.8 Controllo di qualità esterno e assicurazione di qualità ... 204

7.9 Frequenza e priorità del controllo di qualità ... 205

7.10 Formazione ... 206

Capitolo 8: Appendici ...211

8.1 Interpretazione dei risultati dell’esame del liquido seminale ... 211

8.2 Strumentazione e sicurezza ... 214

8.3 Microscopia per l’esame di base del liquido seminale ... 221

8.4 Soluzioni stock e terreni di coltura ... 226

8.5 Modello di refertazione per l’esame del liquido seminale ... 233

8.6 Materiale QC ... 235

8.7 Programmi nazionali di controllo di qualità esterno per l’esame del liquido seminale ... 246

Capitolo 9: Bibliografia ...247

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Tabella 2.1 Volumi sufficienti di eiaculato e volumi finali di sospensioni spermatiche diluite

per una gestione adeguata ... 20

Tabella 2.2 Differenze accettabili (basate su un intervallo di confidenza del 95%) tra due percentuali per una data media determinata da conteggi replicati di 200 spermatozoi (conta totale: 400) ... 26

Tabella 2.3 Confronto della differenza tra i conteggi dei replicati e relazione con l’incertezza del risultato ... 33

Tabella 2.4 Calcolo della concentrazione di spermatozoi dalla conta spermatica ... 35

Tabella 2.5 Fissazione e fasi della colorazione Papanicolaou ... 47

Tabella 2.6 Classificazione della morfologia nemaspermica ... 51

Tabella 2.7 Tavola di Papanicolaou 1 ... 56

Tabella 2.12 Probabilità di non rilevare spermatozoi durante la valutazione dei preparati a fresco ... 66

Tabella 2.13 Probabilità di non rilevare spermatozoi dopo la centrifugazione ... 66

Tabella 2.14 Tavola di Shorr ... 73

Tabella 2.15 Tavola DiffQuick ... 76

Tabella 2.16 Errori di campionamento approssimati (%) e limiti dell’intervallo di confidenza al 95% secondo il numero totale di spermatozoi contati ... 78

Tabella 3.1 Calcolo degli indici di difetti multipli dello spermatozoo ... 85

Tabella 3.2 Indici dei difetti dello spermatozoo in uomini di coppie fertili e infertili ... 86

Tabella 3.3 Livelli basali della disomia dei cromosomi spermatici di uomini fertili sani ... 107

Tabella 3.4 Quantità di liquido seminale da utilizzare per l’immunobead test ... 122

Tabella 3.5 Standard raccomandati per le valutazioni dello zinco ... 127

Tabella 3.6 Standard raccomandati per il dosaggio del fruttosio ... 130

Tabella 3.7 Standard raccomandati per la valutazione dell’attività dell’αα-glucosidasi ... 133

Tabella 7.1 Terminologia di garanzia e controllo della qualità ... 187

Tabella 7.2 Calcoli dei valori per una carta Xbar ... 194

Tabella 7.3 Fattori necessari per il calcolo dei limiti di allarme e di azione per la carta Xbar ... 195

Tabella 7.4 Calcolo dei limiti di allarme e di azione per la carta S ... 196

Tabella 7.5 Regole di controllo di base per le carte QC ... 198

Tabella 7.6 Concentrazioni di spermatozoi (x10⁶/ml) stimate da tre operatori su cinque campioni di QC ... 202

Tabella 7.7 Differenze dalla media del campione calcolate sottraendo la media del campione seminale da ogni osservazione ... 202

Tabella 7.8 Media, SD e media/errore standard di queste differenze calcolate per ogni operatore (n = numero di campioni) ... 202

Tabella 7.9 Media, SD e media/errore standard di queste differenze calcolate per ogni operatore (n = numero di campioni) ... 202

Tabella 7.10 Test F dall’ANOVA a due vie per gli operatori e i campioni QC ... 203

Tabella 7.11 Principali caratteristiche delle procedure di IQC ... 203

Tabella 7.12 Calendario per il QC ... 206

Tabella 7.13 Riassunto dei test di QC ... 206

Tabella 7.14 Fonti di variazione (errore) nella valutazione della concentrazione nemaspermica ... 208

Tabella 7.15 Fonti di variazione (errore) nella valutazione della morfologia nemaspermica ... 209

Tabella 7.16 Fonti di variazione (errore) nella valutazione della motilità nemaspermica ... 210

Tabella 7.17 Fonti di variazione (errore) nella valutazione della vitalità nemaspermica ... 210

Tabella 8.1 Definizione di popolazione di riferimento in Campbell et al. [5] ... 212

Tabella 8.2 Origine dei dati per la distribuzione dei risultati [5] ... 212

Tabella 8.3 Distribuzione dei risultati dell’esame del liquido seminale di uomini le cui partner hanno ottenuto una gravidanza spontanea da concepimento naturale entro un anno di rapporti sessuali non protetti. Da Campbell et al. [5] (5° percentile e intervallo di confidenza del 95%) ... 213

Tabella 8.4 Modello esemplificativo per la registrazione dell’esame del liquido seminale ... 233

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Figura 2.1 Aggregazione non specifica degli spermatozoi nel liquido seminale ... 21

Figura 2.2 Schema dei diversi gradi di agglutinazione nemaspermica ... 22

Figura 2.3 Supporti per valutare la motilità degli spermatozoi ... 25

Figura 2.4 Striscio di eosina-nigrosina osservato in campo chiaro ... 27

Figura 2.5 L’emocitometro di Neubauer modificato ... 30

Figura 2.6 Quali spermatozoi contare nei quadrati della griglia ... 31

Figura 2.7 Valutazione dell’intero vetrino coprioggetto per verificare la presenza di spermatozoi mobili ... 37

Figura 2.8 Spermatozoi morfologicamente “normali” ... 43

Figura 2.9 Preparazione di uno striscio di liquido seminale normale ... 44

Figura 2.10 Rappresentazione schematica di alcune forme anomale di spermatozoi umani ... 50

Figura 2.11 Ordine strutturato per la valutazione della morfologia nemaspermica ... 53

Figura 2.12 Tavola di Papanicolaou 1 ... 55

Figura 2.17 Rappresentazione schematica dei tipici cambiamenti morfologici negli spermatozoi sottoposti a stress ipo-osmotico ... 70

Figura 2.18 Microfotografie al microscopio a contrasto di fase di spermatozoi sottoposti a stress ipo-osmotico .... 71

Figura 2.19 Tavola di Shorr ... 72

Figura 2.20 Tavola DiffQuick ... 75

Figura 3.1 TUNEL test su vetrino per l’analisi della frammentazione del DNA mediante fluorescenza ... 88

Figura 3.2 Citometria a flusso per l’analisi dello ioduro di propidio e della fluorescenza verde ... 90

Figura 3.3 Spermatozoi con alone (DNA intatto, frecce) e senza alone (DNA frammentato, punte di freccia) .... 98

Figura 3.4 Comet test su spermatozoi di un campione patologico con frammentazione estesa del DNA e di un campione normale senza danni visibili al DNA, colorati con bromuro di etidio………….. ... 102

Figura 3.5 Cometa vista al microscopio, dopo conteggio con il software CASP (coda DNA = 88%) ... 102

Figura 3.6 Cellule perossidasi-positive nel liquido seminale umano ... 110

Figura 3.7 Leucociti nel liquido seminale ... 115

Figura 3.8 Due esempi di dispositivi di raccolta dell’eiaculato diviso ... 136

Figura 3.9 Esempio di rappresentazione grafica dei risultati di un normale eiaculato diviso in quattro frazioni, che mostra la distribuzione del volume, degli spermatozoi, della motilità progressiva, dello zinco e del fruttosio ... 137

Figura 4.1 Esempi di spermatozoi vitali e non vitali, colorati con FITC-PNA, con acrosoma intatto e con acrosoma reatto ... 147

Figura 4.2 Esempio di spermatozoi AB-positivi (a) e AB-negativi (b) al microscopio ottico (1000×, immersione a olio) ... 150

Figura 4.3 Esempi di spermatozoi CMA3-positivi (a) e CMA3-negativi (b) (riquadro di sinistra) ... 152

Figura 4.4 Terminologia standard per le variabili misurate dai sistemi CASA... 157

Figura 4.5 Esempi di espressioni grafiche di diverse applicazioni CASA ... 160

Figura 7.1 Una carta Xbar basata sui dati della Tabella 7.1 ... 195

Figura 7.2 Carta S per la concentrazione di spermatozoi... 197

Figura 7.3 Grafico Bland-Altman delle stime manuali e con il sistema CASA della percentuale di motilità nemaspermica progressiva ... 200

Figura 7.4 Diagramma di Youden per la stima della concentrazione degli spermatozoi ... 201

Figura 8.1 Nomogramma per determinare la forza centrifuga a partire dal raggio del rotore e dalla velocità di rotazione ... 218

Figura 8.2 Sezione di un microscopio ... 222

Figura 8.3 Supporto alla valutazione della motilità degli spermatozoi ... 237

Figura 8.4 Vista attraverso un oculare con reticolo (reticolo rosso) ... 239

Figura 8.5 Immagine videoregistrata del vetrino micrometrico sul monitor e sovrapposizione dei tratti ... 239

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Premessa

L’accesso a servizi sanitari di alta qualità, convenienti a livello economico e basati sulle evidenze scientifiche, inclusi quelli riguardanti la salute sessuale e riproduttiva, è fondamentale per la copertura sanitaria universale. L’accesso universale ai servizi di laboratorio è essenziale per garantire che le popolazioni interessate pos- sano evitare le conseguenze negative sanitarie e socioeconomiche delle malattie sessuali e riproduttive.

Il Manuale di laboratorio per l’esame del liquido seminale e dell’interazione spermatozoi-muco cervicale è stato pubblicato per la prima volta nel 1980, in risposta a un crescente bisogno di standardizzazione delle procedure per l’esame del liquido seminale umano. Il manuale è stato successivamente rivisto quattro volte (negli anni 1987, 1992, 1999 e 2010) e tradotto in diverse lingue.

Il manuale è un documento di riferimento per le procedure e i metodi per l’esame di laboratorio e il trattamento del liquido seminale umano e ha lo scopo di man- tenere e sostenere la qualità dell’analisi e la comparabilità dei risultati ottenuti da diversi laboratori. Nel corso degli ultimi quaranta anni, è realmente diventato uno standard riconosciuto, ampiamente utilizzato dai laboratori clinici e di ricerca di tutto il mondo.

Si tratta di un manuale standard non solo per chi è alle prime armi con l’esame del liquido seminale, ma anche per tutti coloro che trattano ed esaminano il liquido seminale per definirne i parametri per la pratica clinica o per studi di ricerca. Il manuale fornisce informazioni importanti sull’esame del liquido seminale e sulla sua preparazione per la valutazione clinica, sui test specializzati, sulla crioconservazione, sul controllo di qualità nel laboratorio di analisi e sugli esami di laboratorio negli studi dell’infertilità maschile. Si tratta di dati fondamentali anche per monitorare la risposta al trattamento e ad altri interventi che mirano a migliorare la salute sessuale e riproduttiva maschile.

Questa sesta edizione del manuale costituisce una fonte essenziale di aggiornamento sulle ultime informazioni basate sulle evidenze scientifiche per le procedure di laboratorio necessarie per la cura dell’infertilità. Questa edizione contiene se- zioni nuove e ampliate sulla preparazione dei campioni di liquido seminale, sulla determinazione dei marcatori di infezione, sull’analisi computerizzata del liquido seminale e sulle categorie di base estese e avanzate.

La sesta edizione del Manuale di laboratorio dell’OMS per l’esame e il trattamento del liquido seminale costituirà un contributo fondamentale ai programmi che cer- cano di migliorare la salute sessuale e riproduttiva, compresa la cura e l’accesso alla fertilità, soprattutto tra gli uomini, sostenendo così gli sforzi dei paesi per rag- giungere l’OSS 3.7 (accesso universale ai servizi di assistenza sanitaria sessuale e riproduttiva, compresa la pianificazione familiare). Il manuale sosterrà inoltre la realizzazione dell’OSS 3.8 (copertura sanitaria universale, compresa la protezione del rischio finanziario, e accesso a servizi sanitari essenziali di qualità).

L’OMS e l’HRP desiderano ringraziare i molti esperti tecnici di tutto il mondo che hanno contribuito alla revisione e al riesame di questo manuale.

Ian Askew, PhD

Director, Department of Sexual and Reproductive Health and Research, including the UNDP/UNFPA/UNICEF/WHO/World Bank Special Programme on Human Reproduction

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Questa pubblicazione è stata prodotta dal Dipartimento di salute e ricerca sessuale e riproduttiva dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (che include il Programma speciale di ricerca, sviluppo e formazione alla ricerca nella riproduzione umana - HRP di UNDP/UNFPA/UNICEF/OMS/Banca Mondiale). Per la partecipazione nella preparazione, redazione e revisione del presente manuale si ringraziano i seguenti professionisti.

Editor

Dr. Lars Björndahl, MD, PhD Laboratory medicine

Andrology Laboratory Director

ANOVA, Clinic for Endocrinology, Karolinska University Hospital and Department of Medicine, Huddinge, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden

Team editoriale

Professor Oleg Apolikhin, MD, PhD Andrology

Professor and Director, Research Institute of Urology and Interventional Radiology named after N.A. Lopatkin – branch of the National Medical Research Center of Radiology of the Ministry of Health of the Russian Federation

Mosca, Russia

Professor Elisabetta Baldi, Doctor in Biology Laboratory medicine

Associate Professor of Clinical Pathology, Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence

Responsible of the semen cryopreservation centre, Azienda Ospedaliero- Universitaria Careggi (AOUC)

Firenze, Italia

Professor Christopher L.R. Barratt PhD, DSc, FRSE

Head of Division Systems Medicine, Professor of Reproductive Medicine School of Medicine, University of Dundee

Dundee, United Kingdom

Professor Mario Philip R. Festin, MD, MSc, MHPEd

Obstetrics-gynaecology, clinical epidemiology, health professions education, family planning

Professor, Department of Obstetrics and Gynecology and Department of Clinical Epidemiology, College of Medicine, University of the Philippines Manila

Convenor, Philippine Study Group on Reproductive Health, National Institutes of Health, University of the Philippines

Manila, Filippine

WHO Secretariat Consultant

Dr. Jackson C. Kirkman-Brown, MBE, PhD

Reproductive science, andrology, health care science, fertility

University Reader and Director, Centre for Human Reproductive Science (ChRS), College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham

HFEA Person Responsible and Science Lead, Birmingham Women’s Fertility Centre, Birmingham Women’s and Children’s NHS Foundation Trust

Birmingham, United Kingdom

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Andrology/urology, clinical chemistry (National Registry of Clinical Chemistry) High Complexity Laboratory Director (HCLD, American Board of Bioanalysts) Dow Professor of Urology

Vice-Chairman for Research (Urology)

James Buchanan Brady Foundation Department of Urology, Director, Center for Reproductive Genomics, Englander Institute for Precision Medicine Weill Cornell Medical College

New York, United States of America

American Society for Reproductive Medicine Dr. Michael Mbizvo, PhD

Andrology and reproductive epidemiology

Professor, Reproductive Health Sciences, University of Zimbabwe Country Director/Senior Associate, Population Council

Lusaka, Zambia

Prof. Dr. Stefan Schlatt, PhD Reproductive biology, andrology

University Professor and Director, Centre for Reproductive Medicine and Andrology, University of Münster, Germany

WHO Collaborating Centre for Research in Male Reproduction Dr. Igor Toskin, MD, PhD, DSc

Public health, STI, HIV/AIDS, urology, dermatology, epidemiology, sexual and reproductive health

Scientist, Department of Sexual and Reproductive Health and Research World Health Organization

Geneva, Switzerland WHO Secretariat Dr. Christina Wang, MD

Endocrinology, andrology (male reproduction and contraception) Professor of Medicine, David Geffen School of Medicine, UCLA

Division of Endocrinology, Department of Medicine, Harbor-UCLA Medical Center and the Lundquist Institute

Torrance California, United States of America

Contributors

Karel Blondeel, MSc, MA

HIV/STI prevention and sexual health

Doctoral student, Department of Medicine and Health Sciences, Ghent University Ghent, Belgium

WHO Secretariat Consultant MUDr. Petr Houska Laboratory medicine

Doctoral student, ANOVA, Clinic for Endocrinology, Karolinska University Hospital and Department of Medicine, Huddinge, Karolinska Institutet

Stockholm, Sweden

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Research Institute of Urology and Interventional Radiology named after N.A.

Lopatkin – branch of the National Medical Research Center of Radiology of the Ministry of Health of the Russian Federation

Moscow, Russian Federation

Il team desidera ringraziare Ian Askew, James Kiarie e Thabo Matsaseng per il loro sostegno durante le riunioni e le discussioni nel dipartimento.

Un ringraziamento speciale alla signora Natalie Narkie Maurer, assistente e segre- taria presso il Dipartimento di salute e ricerca sessuale e riproduttiva, Organizza- zione Mondiale della Sanità, Ginevra, Svizzera.

Il sostegno, i consigli e l’assistenza di Susan Norris, Rebekah Thomas e Ian David Coltart dell’OMS sono stati molto apprezzati.

Un ringraziamento speciale all’ex membro dello staff dell’OMS, dottor Kirsten Vo- gelsong, per la sua eccellente registrazione delle precedenti edizioni del manuale, che ha facilitato la revisione per l’ultima edizione, e all’editore della quinta edizione del manuale, dottor Trevor Cooper, per l’aiuto con i dati e altri elementi che sono stati importanti nella continuità di questa nuova edizione.

Il Dipartimento di Salute Sessuale e Riproduttiva e di Ricerca dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (che include il Programma Speciale di Ricerca, Sviluppo e Formazione alla Ricerca nella Riproduzione Umana - HRP di UNDP/UNFPA/UNI- CEF/OMS/Banca Mondiale) desidera ringraziare tutti i partecipanti alla revisione per i loro contributi.

Ulteriori ringraziamenti a:

•

Dr. Christoph Brenker, Postdoctoral Scientist, Centre for Reproductive Medicine and Andrology, University of Münster (for assistance with staining protocols, ta- king micrographs and plates for documentation of spermatozoal pathologies)

•

Dr. Meurig Gallagher, Research Fellow, Centre for Systems Modelling and Quan-

titative Biomedicine, University of Birmingham (for help in writing the sperm motility and CASA sections)

•

Dr. Monica Muratori, Research Assistant, Department of Experimental and Clini-

cal Medicine, University of Florence (for assistance in writing the Tunel protocol for sperm DNA fragmentation)

•

Dr. Sara Marchiani, Research Assistant, Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence (for help in writing the protocol for sperm chro- matin status evaluation).

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trattamento del liquido seminale. Il manuale è stato uno dei documenti più scari- cati sul sito dell’OMS negli anni passati.

La dottoressa Christina Wang è stata impegnata nel lavoro sul manuale fin dalla sua prima edizione nel 1980 (quando era il Manuale di laboratorio per l’esame del liqui- do seminale e dell’interazione spermatozoi-muco cervicale) e continua a far parte dell’attuale sesta edizione, come membro attivo del comitato editoriale del manuale.

La dottoressa Wang insegna medicina alla David Geffen School of Medicine dell’U- niversità della California a Los Angeles. Fa parte della Divisione di Endocrinologia, del Dipartimento di Medicina, ed è direttore del Clinical and Translational Science Institute presso il Lundquist Institute dell’Harbor-UCLA Medical Center.

La dottoressa Wang è una ricercatrice riconosciuta a livello internazionale nella medicina e biologia riproduttiva maschile, e per molti anni ha continuato a guida- re gli sforzi per sviluppare un contraccettivo ormonale maschile sicuro, efficace e reversibile, metodi ottimali di terapia ormonale sostitutiva maschile e nuovi an- drogeni sostitutivi per gli uomini ipogonadici. Oltre a tutto ciò, la dottoressa Wang ha condotto molti altri progetti e iniziative di ricerca d’impatto – dalla ricerca di base agli studi clinici – che mirano a migliorare i risultati della salute riproduttiva.

L’Organizzazione Mondiale della Sanità desidera riconoscere l’eccezionale contri- buto della dottoressa Wang allo sviluppo di tutte e sei le edizioni del Manuale di laboratorio dell’OMS per l’esame e il trattamento del liquido seminale. Il suo contri- buto ha garantito sia un alto livello di competenza tecnica nello sviluppo del manuale sia la continuità istituzionale in tutte le edizioni di questo importante documento.

L’edizione italiana è stata curata da:

SIA

Luca Boeri

Urologo, Fondazione IRCCS Ca’ Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, Milano.

Ilaria Ortensi

PhD Biotecnologie della Riproduzione umana, Sapienza Università di Roma.

Paolo Turchi

Andrologo, Referente per l’Andrologia Azienda USL Toscana Centro, Prato.

SIRU

Filippo Giacone

PhD, Biologo della Riproduzione, Centro HERA, Unità di Medicina della Riproduzione, Sant’Agata Li Battiati, Catania.

Luigi Montano

UroAndrologo, Responsabile Medicina dello Stile di Vita in UroAndrologia, Ospedale S. Francesco d’Assisi, Oliveto Citra (SA), ASL Salerno.

Tiziana Notari

Biologa della Riproduzione, Responsabile Laboratorio PMA Centro Donna Salerno, Centri MIR Napoli e Salerno.

Christina Wang, MD

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usati in questo manuale

ART tecniche di riproduzione assistita BSA albumina sierica bovina

BWW Biggers, Whitten e Whittingham CASA computer-aided sperm analysis

CASMA computer-aided sperm morphometric assessment CD45 cluster di determinazione 45 (marker pan-leucocitario) CD46 cluster di determinazione 46 (antigene acrosomiale) CMA3 cromomicina A3

DGC centrifugazione in gradiente di densità DNA acido desossiribonucleico

DNasi desossiribonucleasi

DPBS soluzione salina bilanciata a base di fosfato di Dulbecco DTT ditiotreitolo

EBSS soluzione salina bilanciata di Earle EDTA acido etilendiamminotetraacetico EQA garanzia di qualità esterna EQC controllo di qualità esterno FITC isotiocianato di fluoresceina FIVET fecondazione in vitro

GEYC glicerolo-tuorlo d’uovo-citrato HIV virus dell’immunodeficienza umana HPF campo ad alta potenza

HSA albumina serica umana HTF fluido tubarico umano

ICSI iniezione intracitoplasmatica dello spermatozoo Ig immunoglobulina

IQC controllo di qualità interno IU unità internazionale IUI inseminazione intrauterina NA apertura numerica

OMS Organizzazione Mondiale della Sanità QC controllo qualità

sEBSS soluzione salina bilanciata di Earle integrata SD deviazione standard

sDF frammentazione del DNA nemaspermico SOP procedura operativa standard

TZI indice di teratozoospermia

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2. Esame di base 3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi

Capitolo 1:

Introduzione

1.1 Scopo del manuale ... 1 1.2 Introduzione ... 1 1.3 La sesta edizione ... 2 1.4 Metodologia per la preparazione della sesta edizione del Manuale di laboratorio dell’OMS per l’esame

e il trattamento del liquido seminale ... 4

1.1 Scopo del manuale

L’obiettivo generale del manuale è quello di descrivere i metodi di laboratorio per l’esame dell’eiaculato al fine di fornire standard globali per migliorare la valutazione della funzione riproduttiva maschile e il trattamento della subfertilità maschile.

I metodi qui riportati possono essere utilizzati come procedure operative standard non solo dai laboratori di andrologia ma da ogni laboratorio che esegua l’esame del liquido seminale. I metodi di base descritti nel Capitolo 2, se adottati e praticati in laboratorio, potranno migliorare la qualità dell’esame del liquido seminale e la com- parabilità dei risultati ottenuti in diversi laboratori. I metodi estesi di valutazione del liquido seminale e i test di ricerca descritti nei capitoli successivi sono stati inclusi per i tecnici, gli scienziati e i medici clinici che richiedono maggiori informazioni sulla capacità funzionale degli spermatozoi e degli organi riproduttivi maschili. Queste informazioni possono essere utili per indagare la subfertilità maschile, così come per monitorare i parametri del liquido seminale durante l’uso di metodi contraccettivi maschili, e negli studi epidemiologici sulla salute riproduttiva maschile.

1.2 Introduzione

Il Manuale di laboratorio per l’esame del liquido seminale e dell’interazione sper- matozoi-muco cervicale è stato pubblicato per la prima volta nel 1980 [1], in risposta a un crescente bisogno di standardizzazione delle procedure per l’esame del liquido seminale. Il manuale è stato rivisto quattro volte [2-5], ampiamente letto e tradotto in diverse lingue. Nel corso degli ultimi quaranta anni, è realmente diventato uno standard riconosciuto, utilizzato ampiamente dai laboratori clinici e di ricerca di tutto il mondo. Si tratta non solo di una guida procedurale per chi è alle prime armi con l’analisi del liquido seminale, ma di un testo di riferimento per tutti coloro che trattano il liquido seminale e hanno bisogno di analizzarne e definirne i parametri per la pratica clinica o per gli studi di ricerca clinica ed epidemiologica.

L’esame del liquido seminale è importante per diverse ragioni:

•

valutazione della funzione riproduttiva maschile e della pervietà del tratto genitale per consentire un trattamento appropriato per la subfertilità maschile e per monitorare la risposta a un trattamento;

•

valutazione del potenziale di fertilità e scelta della tipologia di trattamento adatta per una coppia infertile;

ne

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2. Esame di base 3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografine

•

misurazione dell’efficacia della contraccezione maschile (per esempio, ostruzione dei vasi deferenti e interventi che includono la contraccezione ormonale maschile e altri metodi potenziali).

La valutazione clinica del maschio, assieme all’analisi del liquido seminale, può gui- dare il medico nella scelta su come procedere con le indagini successive e come gestire la coppia subfertile. L’edizione precedente di questo manuale forniva intervalli di riferimento per le variabili spermatiche comunemente misurati sulla base di dati che riguardavano i parametri seminali di uomini le cui partner avevano un tempo di attesa per il concepimento di 12 mesi o meno. Queste distribuzioni di valori sono state definite secondo i metodi standard utilizzati in chimica clinica per la definizione di intervalli di riferimento, ma è importante ricordare che non possono essere utilizzate come limiti netti tra uomini fertili e subfertili [6]. Anche se i parametri del liquido seminale provenivano da un numero limitato di aree geografiche, il che non permetteva a uomini della maggior parte delle popolazioni di essere rappresentati, queste distribuzioni di valori sono state utilizzate a livello globale.

Inoltre, molti fattori femminili noti e non noti ostacolano il valore di utilizzo dei soli parametri dell’esame del liquido seminale per predire la prognosi per la coppia di fecondazione spontanea o assistita. Un migliore valore prognostico dell’esame del liquido seminale può essere ottenuto utilizzando una combinazione di diversi parametri [7-9]. Le metodiche attuali per l’esame del liquido seminale possono fornire molte informazioni, ma ci sono ancora molte domande che richiedono altre indagini [10]. Per un singolo paziente, un esame del liquido seminale non è mai prognostico di fertilità, poiché è il potenziale di fertilità della coppia a definirlo fertile o subfertile.

Nonostante il successo delle precedenti edizioni, è diventato evidente che l’ultima non forniva a un tecnico di laboratorio o a uno scienziato la procedura ottimale per eseguire in laboratorio passo dopo passo un esame del liquido seminale. Inoltre, negli ultimi dieci anni, sono stati convalidati molti nuovi test sul liquido seminale per scopi clinici e di ricerca che non potevano non essere discussi nel manuale. Spinta da queste considerazioni l’OMS, con il sostegno del Segretariato dell’OMS, ha istituito un comitato editoriale per rivedere tutti i metodi descritti nel manuale al fine di confer- marli, cambiarli o aggiornarli. Quando venivano ottenuti dati insufficienti utilizzando i metodi descritti nel manuale o i dati non erano convalidati in più di un laboratorio, il comitato editoriale elaborava una posizione di consenso dopo aver valutato la letteratura pertinente. Inoltre, è stata condotta una revisione aggiornata della distribuzione dei risultati per i parametri del liquido seminale e degli spermatozoi di presunti uomini fertili per includere i dati di tutte le popolazioni, quando possibile.

La mancanza di istruzioni chiare sull’ordine in cui le analisi devono essere eseguite quando un campione di liquido seminale viene consegnato al laboratorio ha portato alcuni laboratori a utilizzare metodologie descritte in altre fonti, mentre altri hanno sviluppato una propria versione di questi metodi, pur sostenendo di eseguire l’analisi del liquido seminale secondo il manuale dell’OMS [11]. Per facilitare i confronti globali, questa nuova edizione del manuale include quindi procedure passo dopo passo e checklist per garantire la facilità d’uso per i tecnici di laboratorio e gli scienziati.

1.3 La sesta edizione

La sesta edizione comprende tre parti: esame del liquido seminale (Capitoli 2, 3 e 4), preparazione e crioconservazione del liquido seminale (Capitoli 5 e 6) e valutazione e controllo della qualità (Capitolo 7). Le procedure per l’esame del liquido seminale sono divise in tre capitoli: esami di base, che consistono in consolidate procedure di routine per determinare le variabili seminali eseguite non solo dai laboratori di andrologia ma da qualsiasi laboratorio effettui esami del liquido seminale; analisi

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estese, che possono essere usate in determinate situazioni per scelta del laboratorio o per specifica richiesta del clinico; esami avanzati, che non sono attualmente considerati di routine nella valutazione iniziale di un maschio subfertile. Dato che la coltura del liquido seminale non viene eseguita in un laboratorio di andrologia, questa viene menzionata solo nella sezione sulla raccolta sterile del liquido seminale.

La sezione sulla preparazione del liquido seminale si estende oltre l’eiaculato per includere spermatozoi ottenuti dal testicolo e dall’epididimo. Da notare come il test del muco cervicale umano sia stato eliminato da questa nuova edizione perché non più utilizzati nella pratica clinica. Questa nuova edizione è scritta come un manuale procedurale facile da seguire per coloro che effettuano l’esame del liquido seminale, con informazioni di base e il razionale dei test separati dalla descrizione della procedura.

Le caratteristiche principali di questa sesta edizione sono descritte qui di seguito.

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I capitoli sull’esame del liquido seminale includono dettagli su come procedere passo dopo passo con le procedure, i calcoli e l’interpretazione, in modo che qualsiasi metodologia data sia essenzialmente completa, con un minimo riferimento incrociato ad altre parti del manuale.

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Esami di base

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Valutazione del numero di spermatozoi:

 Le diluizioni del liquido seminale sono state semplificate, ma devono essere contati 200 spermatozoi per replicato.

 È importante che il laboratorio non smetta di valutare il numero di spermatozoi a basse concentrazioni (2 milioni/ml), come suggerito nella precedente edizione, ma riporti concentrazioni inferiori, notando che gli errori associati al conteggio di un piccolo numero di spermatozoi possono essere molto alti.

Ulteriori metodi descritti in questo capitolo possono essere necessari per migliorare l’accuratezza e la precisione nel caso di numeri di spermatozoi molto bassi.

 Il numero totale di spermatozoi per eiaculato (spermatozoi eiaculati) ha più valore diagnostico della concentrazione di spermatozoi, ma per questo il volume del liquido seminale deve essere misurato accuratamente.

 La sezione per la valutazione dell’azoospermia è mantenuta, e contiene anche le procedure per la centrifugazione e l’uso di coloranti per gli spermatozoi vitali, utilizzati come metodi per la rilevazione di spermatozoi in campioni non fissati e nel liquido seminale post-vasectomia oppure quando la produzione di liquido seminale è marcatamente soppressa da agenti contraccettivi.

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Valutazione della motilità degli spermatozoi. La categorizzazione della motilità degli spermatozoi è tornata a essere: motilità progressiva rapida, motilità progressiva lenta, motilità non progressiva e assenza di motilità (grado a, b, c, d) perché la presenza (o assenza) di spermatozoi progressivi rapidi è clinicamente importante [12].

•

Valutazione della morfologia nemaspermica. La procedura per valutare la morfologia degli spermatozoi utilizzando un approccio sistematico è descritta e dovrebbe essere seguita. In questa edizione sono incluse più microfotografie e di migliore qualità di spermatozoi ottenuti da campioni di liquido seminale non trattati considerati normali, borderline o anormali, accompagnate da spie- gazioni sul perché ogni spermatozoo è stato classificato in quel modo. Questo dovrebbe aiutare a formare gli operatori in modo che siano in grado di definire in modo coerente le sottili caratteristiche della morfologia degli spermatozoi.

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Esami estesi. Questo capitolo è stato ampiamente rivisto e ora descrive non solo procedure per rilevare leucociti, cellule germinali immature, anticorpi nel liquido seminale, indici di difetti multipli degli spermatozoi e saggi biochimici per la funzione delle ghiandole accessorie, ma anche metodi per rilevare le aneuploidie nema- spermiche e la genetica degli spermatozoi, nonché la frammentazione del DNA.

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Esami avanzati. Questa sezione include sia esami che sono classificati come fo- calizzati su metodi molto specializzati sia metodi principalmente di ricerca e altre tecnologie emergenti. Questo capitolo è stato ampiamente rivisto. I test obsoleti, come il legame dell’ovocita umano e della zona pellucida umana, e i test di pene- trazione dell’ovocita di criceto sono stati rimossi. Le descrizioni di questi test sono disponibili nella quinta edizione. I test di ricerca in questa edizione includono la valutazione delle specie reattive dell’ossigeno e dello stress ossidativo, dei canali ionici di membrana, della reazione acrosomiale e della cromatina spermatica. La sezione sull’analisi computerizzata del liquido seminale (CASA, Computer-aided sperm analysis) è stata riscritta per descrivere i principi di quest’ultima e il suo uso come tecnologia di ricerca. Inoltre, i nuovi metodi emergenti che utilizzano il movimento degli spermatozoi o i cambiamenti alla luce possono costituire la base per misurare la motilità degli spermatozoi senza bisogno di un microscopio.

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I capitoli sulla preparazione del liquido seminale e la crioconservazione degli spermatozoi sono stati aggiornati.

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Controllo di qualità. Questo capitolo è stato rivisto per fornire un più agevole approccio per i non esperti in statistica. Un rigoroso mantenimento della qualità per l’esame del liquido seminale è necessario affinché i metodi analitici siano di forte evidenza; devono essere adottate procedure di qualità tanto interne quanto ester- ne. Vengono inoltre dati consigli e suggerimenti su come migliorare le prestazioni del laboratorio quando i risultati del controllo qualità sono insoddisfacenti.

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Limiti di decisione più accurati degli intervalli e dei limiti di riferimento. La distribuzione dei risultati da uomini presunti fertili non è sufficiente per stabilire limiti decisionali clinicamente utili. I dati che caratterizzano le caratteristiche del liquido seminale di una popolazione di riferimento (uomini le cui partner hanno avuto un tempo di attesa per il concepimento di 12 mesi o meno) sono stati rivisti (Sezione 8.1, p. 211); i dati non riportati in precedenza e provenienti da popolazioni maggiormente diversificate sono stati riportati e queste analisi hanno convalidato la distribuzione dei risultati definita nella quinta edizione del manuale. La distribuzione dei dati della popolazione è presentata con intervalli unilaterali (estremi dei dati della popolazione di riferimento) anche se questi percentili non rappresenta- no limiti netti tra uomini fertili e subfertili.

1.4 Metodologia per la preparazione della sesta edizione del Manuale di laboratorio dell’OMS per l’esame e il trattamento del liquido seminale

Di Mario Philip R. Festin e Igor Toskin

Il Manuale di laboratorio dell’OMS per l’esame e il trattamento del liquido seminale è giunto alla sua sesta edizione. La quinta edizione è stata una delle pubblicazioni OMS più popolari da quando il manuale è uscito nel 2010, con download in costante aumento anche negli ultimi anni (95.975 nel 2018, 120.803 nel 2019 e 132.765 nel 2020).

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È stato il manuale standard utilizzato dai laboratori di andrologia, ma anche da altri laboratori di analisi del liquido seminale, analisi cliniche e istituti di ricerca in tutto il mondo. Fino al 2021 è stato citato in più di 3.000 articoli e recensioni peer-review e diffuso in congressi internazionali e riunioni scientifiche, nonché in programmi di formazione di centri che collaborano con l’OMS, società professionali e altri istituti accademici.

Per la presente revisione, il processo ha incluso quanto segue: il segretariato responsabile del manuale è stato convocato dal Dipartimento di salute e ricerca riproduttiva dell’OMS (RHR) sulla base di una lista ottenuta dal precedente board editoriale e previa consultazione con le istituzioni che collaborano con il Dipartimento; è stato elaborato un piano per arrivare a proporre una lista di membri del comitato editoriale.

Questa lista di possibili collaboratori per la sesta edizione è stata sviluppata da una selezione di relatori a congressi di andrologia, da una revisione dei collaboratori alla quinta edizione del manuale e da una selezione della letteratura medica globale peer-review in materia di andrologia e analisi del liquido seminale. La base per la selezione finale includeva un track record di ricerca e pratica sull’analisi del liquido seminale, pubblicazioni peer-review e competenze tecniche riconosciute a livello internazionale, con un equilibrio tra pratica clinica ed esperienza di laboratorio. Si è cercato di ottenere un equilibrio tra andrologi, esperti di laboratorio, urologi, scienziati, epidemiologi e altri specialisti.

È stato costituito un nucleo editoriale di otto persone per avviare l’organizzazione di un team di redattori più esteso, quando necessario. Tale nucleo editoriale è stato selezionato in base alla collaborazione attiva con il Dipartimento negli ultimi anni e all’esperienza sul precedente manuale del liquido seminale e, in base alla necessità, ha nominato il resto dei membri del team di collaboratori più esteso. Non sono stati previsti onorari o compensi per i membri del comitato editoriale né per i collaboratori.

Una volta completata la lista dei redattori principali, l’OMS li ha invitati a diventare membri del comitato editoriale, con termini di riferimento specifici. I loro curricula, gli accordi individuali e le dichiarazioni di possibili conflitti di interesse sono stati presentati e tenuti in archivio. La maggior parte delle comunicazioni è avvenuta inizialmente attraverso teleconferenze, per poi includere anche incontri in presenza a Ginevra o altrove.

I compiti proposti dal nucleo editoriale degli otto erano:

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suggerire altri membri del team di collaboratori, se necessario;

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fissare i criteri di selezione dei collaboratori generali;

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identificare gli argomenti soggetti a revisione o aggiornamento;

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ideare il processo di scoping di questa edizione.

I membri del comitato editoriale per la sesta edizione del Manuale di laboratorio dell’OMS per l’esame e il trattamento del liquido seminale sono:

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Oleg Apolikhin – https://ecuro.ru/en/node/3485

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Elisabetta Baldi – https://www.unifi.it/p-doc2-0-0-A-3f2a3d2a393028.html

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Christopher Barratt – https://www.dundee.ac.uk/people/christopher-barratt

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Lars Björndahl – https://ki.se/en/people/larsbjor

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Jackson Kirkman-Brown – https://www.birmingham.ac.uk/staff/profiles/

metabolism-systems/kirkman-brown-jackson.aspx

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Dolores Lamb – https://urology.weillcornell.org/dolores-lamb

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Michael Mbizvo – https://www.popcouncil.org/research/expert/michael-mbizvo

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Stefan Schlatt – https://www.medizin.uni-muenster.de/cera/cera-forschung/

experimentelle-und-translationale-forschung-zum-hoden/arbeitsgruppe/univ- prof-dr-rer-nat-stefan-schlatt-1.html

•

Christina Wang – https://lundquist.org/christina-chung-lun-wang-md

All’OMS, la segreteria del manuale comprendeva Igor Toskin e Mario Festin.

Altri membri sono stati aggiunti per supportare i membri anziani del team editoriale e sono stati riconosciuti come collaboratori:

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Petr Houska;

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Stepan Krasnyak;

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Karel Blondeel.

I termini di riferimento includevano:

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rivedere la classificazione e la presentazione delle procedure per migliorare la comprensione tra il personale tecnico;

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preparare una presentazione più chiara delle illustrazioni e delle fotografie;

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rivedere il contenuto dei box e, quando appropriato, inserirlo nel testo principale;

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verificare e aggiornare i valori standard di riferimento dell’edizione precedente.

Il Segretariato RHR dell’OMS si è consultato con il Comitato di revisione delle linee guida dell’OMS (GRC), che decide se una pubblicazione deve seguire il processo di documentazione, revisione e approvazione delle linee guida. Al momento della revisione, il GRC ha notato che le edizioni precedenti del manuale avevano affrontato le questioni di come raccogliere e preparare i campioni, di come analizzarli e della loro interpretazione, includendo i valori di riferimento per il numero, la morfologia, la motilità e altre caratteristiche; non c’erano, invece, raccomandazioni su se, quando e come trattare le anomalie.

Il presente manuale ha solo fornito procedure standardizzate da seguire per con- durre test ed esami di laboratorio; non ha fatto raccomandazioni cliniche o pratiche, che sono al di fuori del suo ambito, come menzionato dal GRC. Le conclusioni e le informazioni contenute nel manuale sono basate sulle migliori evidenze scientifiche disponibili, incluse le citazioni, ove disponibili. Il manuale soddisfa gli standard dell’OMS per lo sviluppo e la pubblicazione dei documenti, compresa la dichiara- zione dei conflitti d’interesse, la gestione dei comitati esterni, lo stile, il processo di autorizzazione e altri; si ricollega inoltre alle attuali linee guida dell’OMS sulla

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gestione dell’infertilità e della contraccezione, se pertinenti. Il manuale mantiene il suo obiettivo di descrivere le procedure e il modo di fissare gli standard locali per i valori di riferimento. L’OMS ha ricevuto conferma dal GRC che l’attuale formato del manuale non lo rende una linea guida e non richiederebbe la sua autorizzazione o approvazione.

Anche all’OMS sono state fatte comunicazioni adeguate con il Dipartimento degli standard di laboratorio (Laboratory Standards Department) per una guida sul contenuto e le procedure, specialmente circa la definizione degli standard in un manuale.

L’autorizzazione per la pianificazione è stata garantita presso il Comitato documenti del Dipartimento di salute e ricerca riproduttiva dell’OMS e l’autorizzazione esecu- tiva è stata data prima della pubblicazione, una volta che il documento è stato com- pletato. Se in futuro si dovessero sviluppare pubblicazioni derivanti dalle revisioni e dalle discussioni nella preparazione del manuale, anche queste saranno decise e concordate dal comitato editoriale.

Il nucleo editoriale ha identificato possibili argomenti riguardanti i fattori che influenzano i parametri seminali. È stata eseguita una revisione della letteratura su specifici temi di ricerca come parte della preparazione del manuale. Sugli argomenti su cui si apriva una discussione, la decisione si basava sul consenso o sul voto aperto. Per facilitare il processo di condivisione, revisione e aggiornamento dei dati è stata creata una piattaforma elettronica. Il team editoriale ha anche considerato altri argomenti da includere, modificare o eliminare dalla presente versione del manuale; sono state inoltre prese diverse decisioni riguardo al formato e alle scadenze. Tra il 2017 e il 2020 si sono tenuti una serie di teleconferenze, scambi di e-mail individuali e di gruppo e due incontri in presenza.

È stata necessaria una revisione della letteratura su alcuni specifici argomenti sui quali ci poteva essere incertezza, o perché riguardavano sviluppi tecnologici molto recenti o a causa di una mancanza di evidenze o di esperienza. Queste sono state le basi della discussione per alcune delle decisioni adottate. Alcuni degli argomenti visionati sono stati:

•

procedure più nuove per la valutazione della qualità dell’eiaculato;

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fattori che influenzano la qualità del liquido seminale (fattori ambientali, uso di farmaci, fattori legati all’età, alla salute e altri; come parte del manuale o come documenti di revisione separati per la pubblicazione).

Le scadenze sono state fissate per ogni capitolo e per l’intero manuale. Esse riguardavano:

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schema del contenuto dei capitoli;

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presentazione della prima bozza;

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revisione da parte del gruppo editoriale;

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presentazione della seconda bozza;

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revisione da parte del gruppo editoriale;

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approvazione del caporedattore;

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revisione da parte dell’editor per la coerenza in tutti i capitoli;

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revisione interna da parte dell’OMS;

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revisione esterna da parte di altri esperti tecnici in andrologia o analisi del liquido seminale;

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revisione pubblica (come parte delle procedure standard nella preparazione dei

documenti dell’OMS);

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completamento del documento dopo il confronto e la sintesi di tutte le revisioni e i commenti.

Hanno partecipato alla revisione pubblica gli esperti di 43 paesi in tutte e 6 le re- gioni dell’OMS.

Mentre l’appendice del manuale descrive la distribuzione dei risultati ottenuti da uomini le cui partner sono rimaste gravide entro 12 mesi di tentativi (Sezione 8.1, p.

211), per presentare una descrizione più dettagliata degli sforzi per riesaminare e aggiornare le distribuzioni di riferimento un gruppo separato di autori, che includeva alcuni dei membri del comitato editoriale, ha preparato un documento separato con i risultati chiave menzionati nell’appendice 8. Altri argomenti che sono al di fuori dell’ambito del manuale saranno pubblicati separatamente, compresa un’analisi del panorama delle tecnologie emergenti.

Riferimento alla carta di distribuzione dei valori di riferimento:

Campbell MJ, Lotti F, Baldi E et al. Distribution of semen examination results 2020 - A follow up of data collated for the WHO semen analysis manual 2010. Andrology.

2021 May;9(3):817-22.

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ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi2. Esame di base

Capitolo 2:

Esame di base

2.1 Introduzione ... 9 2.2 Sequenza temporale delle fasi dell’esame di base

del liquido seminale ... 12 2.3 Procedure pre-esame ... 13 2.4 Procedure di esame e post-esame ... 15 2.5 Informazioni e commenti aggiuntivi ... 64

L’esame di base del liquido seminale è quello che ogni laboratorio che analizza gli eiaculati umani dovrebbe eseguire. Le tecniche qui descritte sono concepite per fornire la migliore integrazione tra massima affidabilità e praticità dell’esecuzione.

Anche se ci possono essere tecniche alternative con risultati simili, è fondamentale che vengano utilizzati metodi comparabili per ottenere una standardizzazione clinica e scientifica. Questo approccio fornisce le basi per un corretto sviluppo della scienza alla base della cura per la riproduzione del maschio.

2.1 Introduzione

Diversamente dalla maggior parte delle altre secrezioni corporee esaminate ai fini della diagnosi o del follow-up del trattamento, l’eiaculato è una miscela eteroge- nea di secrezioni che si forma nell’organismo prima di essere espulsa. L’eiaculato è composto da una sospensione concentrata di spermatozoi, immagazzinati negli epididimi, diluiti e mescolati principalmente nell’uretra con il liquido prostatico, quindi con una secrezione proveniente dallo svuotamento delle vescicole seminali [13]. Le frazioni sequenziali di eiaculato non hanno dunque la stessa composizione. Il confronto del volume dell’eiaculato pre- e post-vasectomia rivela che circa il 90% del volume dell’eiaculato è composto da secrezioni provenienti dagli organi accessori [14], principalmente dalla prostata e dalle vescicole seminali, con un contributo mi- nore delle ghiandole bulbouretrali (di Cowper) e degli epididimi.

L’eiaculato ha due grandi parametri quantificabili.

•

Il numero di spermatozoi riflette la produzione di spermatozoi da parte dei testi- coli, la pervietà del sistema di dotti post-testicolari, l’efficacia delle contrazioni della muscolatura liscia negli epididimi e nei vasi deferenti per trasportare attivamen-

Tutti gli aspetti della raccolta e dell’esame

dell’eiaculato, se i risultati devono fornire

informazioni affidabili, devono essere

valutati utilizzando delle procedure

adeguatamente standardizzate.

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ne3. Esame esteso 4. Esamiavanzati 5. Tecniche di preparazionedegli spermatozoi 6. Crioconservazione degli spermatozoi 7. Assicurazione di qualitàe controllo di qualità 8. Appendici9. Bibliografi2. Esame di base

te gli spermatozoi all’uretra e l’efficienza erettile ed eiaculatoria per espellere un eiaculato ricco di spermatozoi. Questi ultimi aspetti sono influenzati dalla durata e dalla qualità dell’eccitazione sessuale e si realizzano mediante segnali nervosi alle cellule muscolari lisce (vasi deferenti, ghiandole, sfintere della vescica), così come alle cellule muscolari lisce che controllano l’afflusso e il deflusso del sangue tra i tessuti erettili del pene e i muscoli striati bulbocavernosi e perineali.

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Il volume di fluido apportato dalle varie ghiandole accessorie riflette l’attività secretoria delle ghiandole e le successive contrazioni della muscolatura liscia che svuotano ciascuna di esse. Queste attività avvengono in risposta alla stimo- lazione nervosa autonoma provocata dall’eccitazione sessuale e come preparazione all’eiaculazione.

La natura degli spermatozoi (la loro vitalità, motilità e morfologia) e la composizione del plasma seminale sono anch’esse caratteristiche importanti per la funzione spermatica. Ci sono, tuttavia, differenze significative per quanto riguarda l’esposizione degli spermatozoi ai fluidi eiaculatori tra la situazione in vivo e quella che si verifica in vitro.

Come esito del rapporto sessuale, la frazione prostatica iniziale dell’eiaculato, ricca di spermatozoi, può venire in contatto con il muco cervicale che si trova nella vagi- na [15] senza che avvenga alcun contatto significativo con il resto dell’eiaculato. In laboratorio, al contrario, l’intero eiaculato viene raccolto in un contenitore dove gli spermatozoi vengono intrappolati in un gel costituito da proteine seminali di origine vescicolare. In vitro, questo gel viene successivamente liquefatto dall’azione delle proteasi prostatiche; mentre questo avviene, la sua osmolarità aumenta [13, 16-18].

Alcune evidenze indicano che il volume totale e il contenuto di spermatozoi di un eiaculato variano a seconda delle circostanze in cui l’eiaculato è prodotto: quelli ottenuti mediante masturbazione e raccolti in un contenitore in una stanza vicino al laboratorio possono avere una resa inferiore rispetto a quelli recuperati da pre- servativi privi di spermicidi usati a casa durante un rapporto [19]. Questa differenza può rispecchiare un diverso livello e una diversa durata dell’eccitazione sessuale, poiché il tempo trascorso a produrre un campione con la masturbazione influenza anche il volume e il contenuto dell’eiaculato [20].

In determinate condizioni di raccolta, le caratteristiche dell’eiaculato dipendono da fattori che di solito non possono essere modificati, come la produzione di spermatozoi da parte dei testicoli, le secrezioni degli organi accessori e una malattia recente (in particolare febbrile), così come da altri fattori, come l’astinenza eiaculatoria, che invece devono essere registrati e considerati nell’interpretazione dei risultati.

I risultati delle misurazioni delle caratteristiche dell’eiaculato ottenute in laboratorio dipendono da quanto segue.

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La raccolta in modo completo o meno dell’eiaculato. Durante l’eiaculazione, le prime frazioni espulse sono principalmente secrezioni prostatiche ricche di spermatozoi, mentre le successive sono composte in prevalenza da liquido seminale vescicolare [13]. Pertanto, perdere la prima frazione (ricca di spermatozoi) dell’eiaculato ha più influenza sui risultati dell’analisi di quanta ne avrebbe la perdita dell’ultima porzione.

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L’attività delle ghiandole sessuali accessorie, le cui secrezioni diluiscono gli spermatozoi epididimali concentrati durante l’eiaculazione [21]. Poiché è influenzata dalla funzione secretiva di altri organi, la concentrazione nemaspermica non riflette in modo diretto la produzione di spermatozoi testicolari. Un indice migliore della capacità di produzione nemaspermica è quindi il numero totale di spermatozoi eiaculati (concentrazione di spermatozoi moltiplicata per volume seminale) [22].