Metodi per studiare
l’espressione dei geni
• Northern blot
• Trascrittasi Inversa -PCR (RT- PCR)
• Ibridazione In situ
• Trascrizione In vitro
• DNA Microarray
Purificazione dell’RNA
• Procedura
– Lisi delle cellule con un reagente che dissocia le nucleoproteine e inibisce la RNAsi
– Rimozione delle proteine
– Precipitazione specifica dell’RNA
Northern blot
• Per determinare la dimensione e la quantita’ di specifici mRNA
• Studi sull’espressione genica
Northern blot
– Elettroforesi dell’RNA in gel contenente formaldeide per mantenere l’RNA in forma completamente lineare
– Trasferimento dell’RNA su una membrana
– Ibridazione con una sonda marcata
100V 0,2A
+ -
generatore di corrente gel di agarosio
scatola elettroforetica tampone elettroforetico
es. TAE (4mM Tris-acetato, 1mM EDTA, pH 8.0)
Gel Elettroforesi-
Separa le molecole in base alla dimensione
Trasferimento su supporto solido
Trasferimento dal gel alla membrana
Preparare la sonda per il Northern Blot
Ibridazione
• La sonda marcata e’ aggiunta ad una
soluzione contenente il supporto solido che lega l’RNA da analizzare
Lavaggio
• Rimozione della sonda non legata al supporto solido
Rivelazione degli ibridi
• Esposizione di un film se la sonda e’
marcata radioattivamente
• Se la sonda e’ marcata con un enzima si procede alla reazione enzimatica che
produce colore direttamente sul supporto solido
gel
membrana
Dopo il trasferimento
Northern blot
• La rivelazione avviene usando:
– DNA marcato con radioattivo(32P)
– DNA marcato con un enzima
che catalizza una reazione che produce luce o colore
Fig. 5. Northern blot analysis of E. lagascae total RNA from leaves (L), germinating seeds (Se), roots (Ro) and stems (St). The blot was
hybridized with probes for ElLTP1 (top panel) and ElLTP2 (middle panel).
The bottom panel shows ethidium bromide staining of the gel before blotting. The numbers to the left indicate approximate transcript sizes in kb
Northern blot
Svantaggi del Northern Blot
• Richiede grandi quantita’ di RNA
• E’ un processo lungo e laborioso
Trascrittasi Inversa-PCR
• Rivelazione di mRNA molto rari
• Analisi di RNA con pochissime quantita’
Procedura
• Purificazione dell’RNA
• Aggiungere i primer
• mescolare RNA con la trascrittasi inversa per effettuare la sintesi del primo filamento di cDNA
• Aggiungere la DNA polimerasi termostabile per effettuare la sintesi del secondo filamento di cDNA e per amplificarlo con i cicli della PCR
AAAAA
5’ TTTTT
Primer 1 3’ 5’
reverse transcriptase
(RNA-dependent DNA polymerase) AAAAA
TTTTT mRNAcDNA
mRNA
Remove RNA (RNase A)
TTTTT 5´
cDNA
Add PCR primers
Trascrittasi inversa - PCR (RT-PCR)
TTTTT 5’
3’
5’ 3’
Primer 2
Primer 3
3’5’ 5’ 3’
3’
3’
Add Taq polymerase. Run PCR
l
l se r st l se r st pl
+ + + + - - - - RT
Reverse transcriptase-PCR (= RT-PCR) Epoxide hydrolase
831947 19042027
564 1584
Ibridazione dell’RNA in situ
Rivelazione di mRNA direttamente su tessuti messi su vetrini da microscopio
Preparation of RNA probe with in vitro transcription
T7/T3 or SP6 promoter
Fig. 7. RNA in situ hybridization with antisense (a-c) and sense (d) RNA probes for ElLTP1.
E. lagascae seedlings were collected 7 days after sowing. co Cotyledon, en endosperm,
hy hypocotyl, am apical meristem, ro root
RNA in situ hybridization
Colour substrate:
nitro blue tetrazolium (NBT) + 5-bromo-4-
chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)
Northern blotting
Probe labeling
pBS-SemaIII
dATP dTTP dGTP
RNA isolation dCTP
AAAAAA
Gel electophoresis
Blotting
Hybridization
Autoradiography
reverse Northern blotting
Down-regulation of transcripts Up-regulation of transcripts
* *
labeled (specific) probe target
Northern
* *
specific probes
labeled target
reverse Northern
cDNA arrays
(continued)• macro-arrays
– low-density
– filter-supported – radioactive probes
(duplicates) – low sensitivity
– only cDNA clones spotted
– cheap
cDNA arrays
(continued)• micro-arrays
– high-density – glass-supported – fluorescent probes
(single slide) – high sensitivity – ability to spot
oligonucleotides – very expensive
Tessuto della prostata,
normale Tessuto della prostata,
tumorale
Un microarray è un supporto solido sul quale sono stati posizionati diverse migliaia di cDNA in spot separati. Ciascuno spot rappresenta un gene, in quanto contiene numerose copie di un cDNA corrispondente a tale gene.
I microarrays
In questo esempio i cDNA sono stati posizionati su di un vetrino, simile ai normali vetrini usati per l’istologia.
Microarray technology
http://www.ym.edu.tw/excellence/HBP/HBP_CP4/procedure.htm
Microarray synthetized by photolithography or EST/oligo “linking”
Probes
si confrontano i profili di espressione genica di due campioni differenti.
E’ necessario estrarre le molecole di mRNA dai due campioni.
Tessuto della prostata,
normale Tessuto della prostata,
tumorale utilizzo dei microarrays
Estrazione
dell’mRNA dai 2 campioni di cellule che si vogliono confrontare
Conversione in cDNA
Marcatura con 2 fluorocromi diversi
Riconoscimento tra i cDNA
Eccitazione della fluorescenza tramite laser
Immagine a colori raffigurante il microarray
provenienti dai 2 campioni e quelli già presenti sul microarray
(1)
(2)
(3)
(4) (5)
(6)
Confronto dei profili di espressione genica in due campioni cellulari diversi
I puntini gialli corrispondono a geni che sono espressi in uguale quantità nei due campioni.
I puntini verdi corrispondono a geni maggiormente espressi nel campione marcato col fluorocromo che emette fluorescenza verde (ad esempio nelle cellule normali).
I puntini rossi corrispondono a geni che sono maggiormente espressi nel campione marcato col fluorocromo che emette fluorescenza rossa (ad esempio nelle cellule tumorali).
Confronto dei profili di espressione genica in due campioni cellulari diversi