Espressione ed utilizzo della informazione genetica

Espressione ed utilizzo della

informazione genetica

Prof.ssa Flavia Frabetti

L’informazione genetica, contenuta nel DNA, ha lo scopo di:

1) mantenere lo stato vitale (strutture e funzioni)

2) realizzare l’adattamento (risposta ad un cambiamento)

3) determinare il differenziamento (specializzazione di strutture e funzioni per es. a livello cellulare)

L’informazione genetica ereditata determina il manifestarsi di specifici caratteri inducendo la sintesi di specifiche proteine:

le proteine sono l’anello di congiunzione tra informazione e la realizzazione/effettuazione di strutture ed attività.

Cosa studiamo?

Trascrizione e Traduzione Codice genetico

Meccanismi di CONTROLLO della espressione genica Dove è scritta l’informazione genica:

DNA

Cromatina / cromosomi Nucleo eucariotico

Come è organizzata l’informazione genica:

Genoma

Geni - come concetto

- “struttura del gene eucariota tipo”

Come si esprime l’informazione genica:

nucleo

DNA istoni

cromosoma telomero centromero

telomero

Dove è scritta la informazione?

proteine acide

Come è organizzata l’informazione?

Una enorme quantità di informazione dentro ad ogni singola cellula:

il GENOMA

Aprendo ogni libro si trovano brani così scritti:

…..ATCCGAGCTTTACGTACGGTTACCGGATCGAGCATACT……

il complesso dell'informazione genetica di una cellula

la massa totale del DNA cellulare il patrimonio ereditario

dell'organismo a cui appartiene

Anche la definizione di genoma è complessa!

Il genoma è:

Genoma

COMPLESSITA’ DEL GENOMA

Proporzionalità da batteri a vermi Poi non viene mantenuta

PARADOSSO DEL VALORE C:

NON PROPORZIONALITA’

TRA COMPLESSITA’ GENOMA E COMPLESSITA’ ORGANISMO

Servono informazioni proporzionali alla complessità dell’organismo ?

Organizzazione generale del genoma umano

Il genoma umano è distribuito in cromosomi:

22 tipi di AUTOSOMI

2 tipi di ETEROCROMOSOMA (X e Y) Corredo aploide 3.200.000.000 bp ovvero 3, 2 Gbp Contenenti, si stima, circa 25000 geni

Genoma nucleare 3.200.000.000 bp (aploide) = 3,2 Gbp

Genoma mitocondriale 16.569 bp

Cromosoma 1 279.000.000 bp Cromosoma 21 45.000.000 bp

Peso (genoma diploide) 7 pg Lunghezza (genoma diploide) 2 m

Come una sorta di matriosca il genoma si organizza nei cromosomi, che contengono i geni che altro non sono che tratti di DNA

DNA genomico:

32% DNA genico 68% DNA extragenico

…… Ma cosa sono i geni?

ORGANIZZAZIONE DEL GENOMA UMANO

NUCLEARE MITOCONDRIALE

0,5 %

1,7 % DEL GENOMA negli mRNAs maturi 5,3% mRNA MATURO

(ESONI) 1/3 GENI CODIFICANTI

PROTEINE

2/3

DNA EXTRAGENICO E PER ncRNA

56% CODIFICANTE (CDS) 0,96 % DEL GENOMA (30Mb)

Geni

codificanti proteine), nei mammiferi rappresentano da 1/2 a 3/4 di tutti i trascritti

Ai geni che codificano proteine si affiancano geni che specificano per RNA non codificanti.

Stime odierne:

Geni umani codificanti per proteine sono un numero di 20.000-25.000

La maggior parte del genoma dei mammiferi è trascritta

Human 58% 98%

Mouse 55% 98%

Fruitfly 60% 71%

Worm 59% 56%

Yeast 70% 0.6%

Known or predicted transcribed

Noncoding percent of transcription

7Mb 100Mb 130Mb 2.6Gb 2.9Gb

Il 98% dell’output trascrizionale nei mammiferi è rappresentato da RNA che non verrà tradotto in aa

La sorprendente complessità trascrizionale dei genomi di mammiferi

JS Mattick and IV Makunin (2006) Non-coding RNA. Human Molecular Genetics 15: R17-R29 miRNA

snoRNA coding exons noncoding exons

 Trascritti antisenso

 Trascritti intronici

 Introni ritenuti

 Trascritti alternativi

 Non-coding RNA Quali implicazioni?

 Regolazione espressione genica

 Definizione di gene

 Correlazione genotipo-fenotipo

 Reinterpretazione della genetica degli organismi complessi

I geni sono le unità responsabili delle caratteristiche

ereditarie

Il gene è una regione di DNA trascritta che contiene istruzioni per la sintesi di una proteina, di un

RNA o ignota

Il gene come concetto

FUNZIONI

DEI GENI

Il gene è una delle tante istruzioni contenute in ogni cellula

METABOLISMO 22%

INFORMAZIONE GENETICA 25%

STRUTTURA 21%

SEGNALI 12%

FUNZIONI TESSUTO-SPECIFICHE 20%

GENI PER RNA NON TRADOTTI

(rRNA 85%, tRNA 10%, RNA non-codificanti)

GENE

SEQUENZE TRASCRIVIBILI

SEQUENZE REGOLATRICI

PROMOTORE INTENSIFICATORI SILENZIATORI

Gene e sua funzione: Cosa fa accendere il gene?

UNITA’ DI TRASCRIZIONE

Tratto di DNA che codifica per una molecola di RNA e delle sequenze necessarie per la sua trascrizione

  1 ccctgtggag ccacacccta gggttggcca atctactccc aggagcaggg agggcaggag 61 ccagggctgg gcataaaagt cagggcagag ccatctattg cttacatttg cttctgacac 121 aactgtgttc actagcaacc tcaaacagac accATGgtgc acctgactcc tgaggagaag 181 tctgccgtta ctgccctgtg gggcaaggtg aacgtggatg aagttggtgg tgaggccctg 241 ggcaggttgg tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcatgt 301 ggagacagag aagactcttg ggtttctgat aggcactgac tctctctgcc tattggtcta 361 ttttcccacc cttaggctgc tggtggtcta cccttggacc cagaggttct ttgagtcctt 421 tggggatctg tccactcctg atgctgttat gggcaaccct aaggtgaagg ctcatggcaa 481 gaaagtgctc ggtgccttta gtgatggcct ggctcacctg gacaacctca agggcacctt 541 tgccacactg agtgagctgc actgtgacaa gctgcacgtg gatcctgaga acttcagggt 601 gagtctatgg gacccttgat gttttctttc cccttctttt ctatggttaa gttcatgtca 661 taggaagggg agaagtaaca gggtacagtt tagaatggga aacagacgaa tgattgcatc 721 agtgtggaag tctcaggatc gttttagttt cttttatttg ctgttcataa caattgtttt 781 cttttgttta attcttgctt tctttttttt tcttctccgc aatttttact attatactta 841 atgccttaac attgtgtata acaaaaggaa atatctctga gatacattaa gtaacttaaa 901 aaaaaacttt acacagtctg cctagtacat tactatttgg aatatatgtg tgcttatttg 961 catattcata atctccctac tttattttct tttattttta attgatacat aatcattata 1021 catatttatg ggttaaagtg taatgtttta atatgtgtac acatattgac caaatcaggg 1081 taattttgca tttgtaattt taaaaaatgc tttcttcttt taatatactt ttttgtttat 1141 cttatttcta atactttccc taatctcttt ctttcagggc aataatgata caatgtatca 1201 tgcctctttg caccattcta aagaataaca gtgataattt ctgggttaag gcaatagcaa 1261 tatttctgca tataaatatt tctgcatata aattgtaact gatgtaagag gtttcatatt 1321 gctaatagca gctacaatcc agctaccatt ctgcttttat tttatggttg ggataaggct 1381 ggattattct gagtccaagc taggcccttt tgctaatcat gttcatacct cttatcttcc 1441 tcccacagct cctgggcaac gtgctggtct gtgtgctggc ccatcacttt ggcaaagaat 1501 tcaccccacc agtgcaggct gcctatcaga aagtggtggc tggtgtggct aatgccctgg 1561 cccacaagta tcacTAAgct cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag gttcctttgt 1621 tccctaagtc caactactaa actgggggat attatgaagg gccttgagca tctggattct 1681 gcctaataaa aaacatttat tttcattgca atgatgtatt taaattattt ctgaatattt 1741 tactaaaaag ggaatgtggg aggtcagtgc atttaaaaca taaagaaatg atgagctgtt 1801 caaaccttgg gaaaatacac tatatcttaa actccatgaa agaaggtgag gctgcaacca 1861 gctaatgcac attggcaaca gcccctgatg cctatgcctt attcatccct cagaaaagga 1921 ttcttgtaga ggcttgattt gcaggttaaa gttttgctat gctgtatttt acattactta 1981 ttgttttagc tgtcctcatg aatgtctttt cactacccat ttgcttatcc tgcatctctc 2041 tcagccttga ct

Gene della beta-globina (Homo sapiens)

Sequenza GenBank n. NM_000518

DNA a filamento doppio (l’altro si ricava per complementarità)

Il gene ha una natura discontinua:

esoni indicati con E introni indicati con I

Struttura del gene eucariota

E 1 I 1 E 2 I 2 E 3

+1

Tratto di DNA che viene trascritto

DNA TATA

PROMOTORE

+1 -25

E 1 E 2 E 3

Trascritto Primario o

pre-mRNA (HnRNA)

Esone 1 Esone 2 Esone 3

AUG UGA

I 1 I 2

ESONI (in giallo), intervallati da lunghi INTRONI (in grigio)

mRNA ^{5’ UTRAUG UGA 3’ UTR}

Proteina NH₂ COOH

CDS

Dimensione media geni

57.000 bp (57 kb) istoni 100-400 bp (0,1-0,4 kb) distrofina 2.220.000 bp (2,22 Mb)

ESONI

Numero medio 11

(minimo)-(massimo) 1 - 363 Dimensione media 280 bp INTRONI

Dimensione media ca. 6.000 bp

mRNA maturo (in media) Dimensione 3.000 basi Sequenza codificante 1.600 basi (56%) Proteina 540 AA

Criteri:

tempestività economia

ovvero sintetizzare le proteine giuste al momento giusto e nella giusta quantità

DNA RNA proteine

replicazione o duplicazione

trascrizione della informazione

traduzione della informazione

"DNA makes RNA, RNA makes protein, and proteins make us."

Francis Crick

1. Trascrizione

Sintesi delle proteine

2. Traduzione tRNA rRNA

mRNA

MEMBRANA NUCLEARE

Pre-mRNA

CITOPLASMA NUCLEO

Trascrizione: l’informazione genetica contenuta nel DNA viene trascritta in una sequenza di RNA in base al principio della complementarietà delle basi

1- riconoscimento del gene da esprimere

2- individuazione di inizio e termine del gene specifico 3- trascrizione nella giusta quantità del gene

4- alto grado di fedeltà, cioè accuratezza è un processo controllato, regolato

poiché le necessità sono:

Negli eucarioti...

La trascrizione genera diversi tipi di RNA:

rRNA o RNA ribosomiale

sintesi delle proteine, funzione strutturale e catalitica

tRNA o RNA transfer o RNA di trasporto

“adattatore” nella traduzione delle sequenze di nucleotidi in aa ovvero trasporta gli aa per la sintesi (traduttore) mRNA o RNA messaggero

trasferimento informazione da DNA a citoplasma

HnRNA o RNA eterogeneo nucleare o pre-RNA

mRNA immaturo degli eucarioti

snRNA o piccoli RNA non codificanti cooperano alla regolazione genica

gene

proteina in crescita

aa legato al tRNA

ribosomi

TRASCRIZIONE

5’

5’

3’

3’

5’ 3’

filamento SENSO

filamento ANTI SENSO - STAMPO RNA POLIMERASI

Il processo è realizzato da enzimi chiamati RNA polimerasi DNA-dipendenti

l’enzima si lega ad una sequenza sul DNA detta promotore

filamento non-senso serve da stampo

filamento senso basi

Entrambi i due filamenti del DNA possono costituire stampo per la sintesi dell’RNA, in funzione del gene, saranno sempre letti in direzione 3’- 5’, poiché la crescita del filamento di RNA di neosintesi è in direzione 5’-3’

5’ 3’

5’

Complementarietà delle basi

Meccanismo della trascrizione:

sintesi di RNA sulla base di uno stampo di DNA Enzima: RNA polimerasi

Trascrizione:

lo stampo di DNA è letto da 3' a 5', l’RNA è sintetizzato da 5' a 3'

1° nucleotide 2° nucleotide

5' 3'

3' 5'

1° nucleotide

Uscita del pirofosfato Formazione legame fosfodiesterico 5'

Codice = sistema di segnali, o segni, o simboli, che, per convenzione, è destinato a rappresentare una informazione tra la fonte dei segnali e il punto di destinazione.

Es. comunicare in codice/ c. linguistico, formato da suoni/ c.grafico, c.fiscale, c. a barre, c.morse, ecc.

Definizioni

Codice genetico

sequenza di codoni contenenti le informazioni genetiche del gene e determinanti la sequenza degli aa che origina la proteina in base alla lettura dei codoni stessi

codice genetico anni ‘60 Codice genetico è un codice a triplette di nucleotidi, detti codoni

I codoni specificano per gli aa. In totale 4³=64 codoni.

Caratteristiche del codice genetico

• il codice è ridondante

• il codice non è ambiguo

• il codice non ha punteggiatura ovvero interruzioni

• il codice è letto senza sovrapposizioni

• per interpretarlo è fondamentale la cornice o quadro di lettura (reading frame)

• il codice è universale (ad eccezione di quello dei mitocondri)

Trp Phe Gly

ACCAAACCG UGGUUUGGC

DNA

mRNA proteina Cornice di

lettura

Nella traduzione l’informazione genetica contenuta nella sequenza di codoni lungo l’mRNA viene decodificata o tradotta in una sequenza di aa costituenti la proteina, uniti in una sequenza precisa determinata dalla sequenza dei codoni

Protagonisti principali di questo processo:

mRNA tRNA ribosomi

porta nel citoplasma il messaggio genetico sotto forma di una specifica sequenza di codoni

sono gli interpreti del linguaggio

facilitano l’appaiamento specifico tra gli anticodoni del tRNA e i codoni dell’mRNA

Ribosomi (60% rRNA+proteine)

1. Hanno un sito di legame per l’mRNA.

2. Un sito P (peptidil-tRNA) che ospita il tRNA che porta la catena aminoacidica in allungamento.

3. Un sito A (aminoacil-tRNA) che ospita il tRNA a cui è legato il successivo aa da aggiungere.

4. Un sito E di uscita del tRNA scarico di aa.

mRNA

subunità maggiore subunità

minore

anticodone

sito di attacco per gli aa (sempre CCA) legami H tra basi complementari

tRNA

Attacco

dell’aa specifico in 3’OH del tRNA

L’enzima riconosce l’anticodone e lega l’aa opportuno

ha un aa “attivato”

Aminoacil-tRNA sintetasi

tRNA = adattatore aminoacido

CODONE tripletta di nucleotidi

codificante per 1 aa

Riconoscimento codone-anticodone

ANTICODONE

U G A

Inizio sintesi proteica

Allungamento sintesi proteica

Terminazione sintesi proteica

Met

5’ 3’

mRNA

AUG

Met

3’

Ser

5’

mRNA

Met-Ser Pro Met-Ser-Pro-Thr

5’

mRNA

Met-Ser-Pro-Thr-...-...-...-

UGA

STOP!

3’

NH3 COO^-

Destino proteico:

l’mRNA può essere tradotto

da ribosomi liberi o ribosomi legati al RER

nucleo

mitocondri cloroplasti

citoplasma

vescicole

secretorie lisosomi m.p.

RIBOSOMI LIBERI

RIBOSOMI SUL RETICOLO

ENDOPLASMATICO

IMPORTAZIONE

POST-TRADUZIONALEc IMPORTAZIONE COTRADUZIONALE

Le proteine ed i loro segnali di smistamento

Proteina non ripiegata Proteina ripiegata

zona segnale sequenza segnale

Ad ogni segnale deve corrispondere un recettore proteico

complementare

Controllo o regolazione

della espressione genica negli EUCARIOTI Scopo:

differenziamento cellulare, ovvero espressione coordinata nel tempo

di geni diversi in cellule diverse.

Geni costitutivi cioè trascritti e tradotti in tutte le cellule Geni specifici attivati selettivamente da meccanismi di

regolazione genica

L’espressione genica è modulabile anche da segnali esterni che possono “accendere” o “spegnere” geni specifici.

Livelli di controllo sulla

espressione genica 1.pre-trascrizionale o

cromatinico 2. trascrizionale 3. post-trascrizionale

4. traduzionale

5. post-traduzionale

controllo sull’attività della proteina trascritto primario

di RNA (HnRNA)

mRNA

proteina DNA

proteina attiva o inattiva

- già nell’organizzazione della cromatina (eucromatina/eterocromatina) - in alcuni casi il silenziamento può essere invertito e i geni venire attivati attraverso processi che rendono la cromatina meno compatta

modificazioni strutturali della cromatina operate da COMPLESSI PROTEICI di rimodellamento ed enzimi

che modificano gli istoni:

modulazione della espressione genica

DNA

nel nucleo

Livello di controllo pre-trascrizionale o cromatinico (sul DNA) gene scelto

1

- sul suo riconoscimento e aggancio al promotore - sulla sua efficienza nel trascrivere

regolazione su quale gene trascrivere e su quanto pre-RNA produrre

DNA

nel nucleo

Livello di controllo trascrizionale (da DNA a pre m-RNA):

il controllo si esercita sulla attività della RNA polimerasi.

2

Gene - “struttura del gene eucariota tipo”

PROMOTORE natura modulare

Sequenza nel DNA di almeno 40 nucleotidi, con affinità più o meno elevata per la RNA polimerasi, di solito posta a monte del gene.

Hanno:

siti di riconoscimento (es. TATA box) sito di legame stabile

sito di inizio della trascrizione

siti di regolazione (simili a intensificatori e/o silenziatori)

GENE

SEQUENZE REGOLATRICI

SEQUENZE TRASCRIVIBILI

PROMOTORE INTENSIFICATORI SILENZIATORI

Enhancer ovvero intensificatori = aumentano la capacità di iniziare la trascrizione, intensificano la trascrizione

Sequenze tessuto-specifiche

Silenziatori = spengono o reprimono la trascrizione

La trascrizione ovvero la attività della RNA polimerasi sarà dovuta ad un bilancio complessivo tra fattori che

la favoriscono o la inibiscono.

SITI DI REGOLAZIONE, anche a grande distanza!

Si tratta di corte sequenze di DNA

SEQUENZE DI REGOLAZIONE, anche a grande distanza!

Si tratta di corte sequenze di DNA riconosciute da specifiche proteine dette FATTORI DI TRASCRIZIONE

“Dialogo”

tra sequenze regolatrici di DNA e proteine

I fattori di trascrizione sono proteine nucleari il cui ruolo è modulare la trascrizione, attivandola o spegnendola

Intensità di trascrizione: fine regolazione

tra quando e quanto quel gene è attivo!

RNA polimerasi II

Inizio della trascrizione FATTORI GENERALI

di trascrizione

promotore

Questi fattori sono richiesti per l’inizio della trascrizione e sono simili per tutti i geni trascritti dalla RNApolimerasi II

TATA box TFIID TFIIB

DNA gene X

SCOPO:

Attivare o reprimere la RNA polimerasi.

Come avviene la regolazione a livello della trascrizione?

promotore

TATA box

TFIID TFIIB

DNA gene X

RNA polimerasi II

Sequenze regolatrici

PROTEINE REGOLATRICI SPECIFICHE

trascritto di RNA

Le proteine specifiche si possono legare a sequenze specifiche, anche lontane sia a valle che a monte del gene.

Il ripiegamento del DNA le porta poi vicine al promotore per influenzare la polimerasi.

Integrazione al PROMOTORE di:

RNA pol

fattori generali di trascrizione serie multiple di proteine regolatrici

EFFETTO COMBINATORIO Un singolo promotore può essere regolato da molte sequenze regolatrici sparse lungo il DNA

proteine regolatrici

+ + - +

sinergia trascrizionale

EFFETTO DI COORDINAZIONE Una singola proteina regolatrice/

fattore di trascrizione può regolare e quindi coordinare l’espressione genica di parecchi geni diversi

proteina regolatrice

Gene networks - un gene può esprimere le proprie

informazioni solo nel contesto dell’intero genoma

della cellula

Promot 3 Promot 4 Promot 2

gene1 gene2 gene3 gene4

Promot 1

FATTORI DI TRASCRIZIONE

-

DNA

RNA

proteine

pre-mRNA o HnRNA mRNA (maturo) nel nucleo

Livello di controllo post-trascrizionale (da pre m-RNA a mRNA):

-controllo sulla elaborazione dell’mRNA,

la maturazione comporta 3 tipi fondamentali di modificazioni - controllo del trasporto dell’mRNA al citoplasma e sulla sua stabilità nel citoplasma

3 4

Eventi post-trascrizionali:

dal preRNA all’mRNA 1- aggiunta del CAP (m⁷G)

aggiunta in 5’ di una 7metil-guanosina:

preserva il trascritto dalla degradazione ed è segnale di aggancio per il ribosoma

3- splicing

processo di taglia e cuci per eliminare gli introni

2- poli-adenilazione in 3’OH

aggiunta di una coda di poliA (150-200):

aiuta il passaggo al citoplasma, influenza la stabilità dell’mRNA

DNA TATA

PROMOTORE

+1 -25

E 1 E 2 E 3

Trascritto Primario o pre-mRNA

Esone 1 Esone 2 Esone 3

AUG UGA

I 1 I 2

Da pre-mRNA a mRNA maturo!!!

mRNA CAP ^{AUG UGA}

5’

aaaaaaaaa 3’

Splicing per rimuovere gli introni dall’HnRNA o pre-mRNA

SPLICING= TAGLIA E CUCI degli introni/esoni

Che significato ha lo

splicing? E gli introni? Plasticità del genoma e della sua espressione Splicing alternativo

può produrre forme diverse di mRNA e dunque di una proteina dallo stesso gene

SPLICING ALTERNATIVO: lo splicing mostra una notevole flessibilità

1 2

1 2

1 2 1 Aggiunta di un esone 2

Aggiunta di un tratto intronico

Esclusione a vicenda di esoni

Sito di splicing interno

mRNA (maturo) 5

proteina nel citoplasma

5. Livello di controllo traduzionale (da m-RNA a proteina):

Operato da fattori proteici che possono influire sull’inizio della traduzione e quindi modularla.

6. Livello di controllo post-traduzionale (sulla proteina):

- controllo sulla modificazione delle proteine sintetizzate - controllo del trasporto

6

proteina attiva

Livello di controllo post-traduzionale (sulla proteina):

modificazione delle proteine sintetizzate che risultano essenziali perché la proteina possa funzionare

Immagine mentale della attivazione dei geni lungo il DNA:

I geni lungo il DNA sono come “luci di Natale” lungo la matassa dei fili: si accendono e si spengono ad intermittenza e con una intensità che va da MASSIMA luminosità a MINIMA luminosità e può essere modulata cioè regolata

A modulare la espressione genica delle proteine cellulari intervengono anche i geni non codificanti proteine

Il Il nuovo nuovo “ “ dogma dogma ” ”

ncRNA non sono semplice “rumore trascrizionale”, ma più probabilmente svolgono un ruolo regolatorio e sono coinvolti in numerosi processi cellulari e biologici, in particolare durante lo sviluppo e il differenziamento

 Gruppo eteogeneo per dimensioni e funzione:

difficile classificazione

 Caratterizzati spesso da una alta densità di codoni di STOP e quindi dalla assenza di ORF estese

 Grande importanza perché non sembrano un semplice “intermedio” di reazione come gli mRNA, ma veri e propri protagonisti di funzione biologica implicati nella REGOLAZIONE GENICA

 Possono formarsi dalle zone introniche di geni coding o da vere e proprie unità geniche

 Sempre di più nei database internazionali

ncRNA - generalità

 La loro trascrizione ed elaborazione è sottoposta a controllo

ncRNA - funzioni e meccanismi

Silenziamento genico post-trascrizionale: stabilità mRNA Interferenza da RNA

Cambiamenti nei livelli di espressione degli ncRNA sono associati con forme diverse di cancro e patologie neurodegenerative

Modulazione della trascrizione (interazioni a triplice elica) Regolazione del trafficking nucleare degli mRNA (RNPs)

Dinamica della struttura della cromatina (regolatori epigenetici)

Regolazione espressione genica

ncRNAs

snoRNA, piRNA

alcuni non noti

~20-300 nt

~300->10.000 nt

~18-25 nt

3-Medium e large RNAs

1- microRNA siRNA

Studi funzionali Nuovi ncRNAs

funzionali

F.F. Costa

“Non-coding RNAs: lost in translation?”

Gene 386 (2007) 1-10

miRNA micro-RNA

Regolazione post-trascrizionale e sequenza-specifica dell’espressione genica; associati a differenziamento e

Da precursori più lunghi (70nt) ripiegati a forcina

Come si formano?

Questa sorta di trascritti primari sono tagliati da un complesso enzimatico “Dicer”

I miRNA sono così trasportati al proprio bersaglio molecolare dal complesso proteico RISC

miRNA+

RISC

miRNA micro-RNA: meccanismi di azione

Regolazione post-trascrizionale:

1. Degradazione mRNA

2. Blocco della traduzione

2 Quasi perfetta

complementarietà al bersaglio

Brevi tratti di complementarietà al bersaglio (6-8 basi)

dsRNA

miRNA

Curiosità e spunti:

• la maggioranza di quelli specificamente espressi in

durante il proseguo dello sviluppo embrionale

• es. miR-134 specificamente implicato nello sviluppo del cervello murino

• altri es. legati a sviluppo del cancro: agirebbero come

122a)

• questo ultimo è down-regolato negli epatocarcinomi

ed il suo bersaglio molecolare è la ciclina-G1 (Bolondi

et al., Cancer Res., 2007)

Andrew Fire, 47 anni Stanford California

Craig Mello, 46 anni Massachusetts Medical School

Premio Nobel per la medicina 2006

Nature, feb. 1998

“Potent and specific genetic interference by double- stranded RNA (dsRNA)

in Caenorhabditis elegans”

Cosa si intende per RNA interference

Sistema di silenziamento genico basato su RNA

RNAi è un processo mediante il quale RNA doppio-strand (dsRNA) silenzia, in modo sequenza-specifico, l’espressione di geni omologhi attraverso l’appaiamento con l’mRNA bersaglio, seguito dalla sua degradazione; quindi: silenziamento post-trascrizionale.

E’ un meccanismo conservato a livello evolutivo di degradazione specifica di mRNA bersaglio

Modello degli stadi dell’RNAi: i siRNAs

amplificazione

RNAsi ATP-dip.

+ RISC (elicasi ATP-dip.) DICER

RICONOSCIMENTO DEL BERSAGLIO

siRNA

RdRP = polimerasi RNA dip.

Due molecole di DICER (Rnasi III) tagliano il dsRNA in siRNA (< 22nt), che vengono incorporati nel complesso (RISC - RNA induced silencing complex) che usa il siRNA come guida per riconoscere il substrato da degradare.

RNAi - Meccanismo d’azione

siRNA

1°stadio-iniziale. I dsRNAs sono processati da un enzima dimerico, DICER (RNasiIII). Si generano i siRNAs.

2°stadio-effettore. siRNAs vengono incorporati in un secondo complesso enzimatico (endonucleasico), RISC (complesso di silenziamento indotto da RNA) che degrada uno dei due

filamenti e usa l’altro per riconoscere, in base all’appaiamento delle basi, il substrato da degradare attraverso l’azione di Slicer (altra subunità del complesso). RISC contiene un’attivita’

elicasica ATP-dipendente

Tutte le molecole di RNA trascritte a partire da un

genoma ANCHE GLI ncRNAs

Tutte le proteine codificate dal genoma ANCHE QUELLE A LOCALIZZAZIONE NUCLEARE Trascrittoma

Proteoma

INTERATTOMA COMPLESSO fondamentale nella regolazione

della espressione genica