3. Materiali e metodi di SEpiAS SEpiAs materials and methods

(1)

Materiali e metodi di SEpiAs - Coinvolgimento dei volontari

3. Materiali e metodi di SEpiAS

SEpiAs materials and methods

3.1 Coinvolgimento dei volontari

Volunteers involvement

Il Protocollo di studio (Allegato 1) è stato inviato ed approvato dai quattro Comitati Etici di ciascuna delle Asl coinvolte nel progetto. Nelle aree di interesse il reperimento dei volontari ha seguito diverse procedure, in base agli aspetti organizzativi e al contesto territoriale. Sono stati avvertiti e coinvolti i medici curanti dei volontari selezionati di ogni area, che in alcuni casi hanno fornito in prima persona i contatti telefonici degli assistiti. In particolare, i medici curanti hanno ricevuto una specifica Lettera al medico

curante, contenente le informazioni utili e i contatti per le informazioni. Nel caso di

Taranto i volontari sono stati reclutati a seguito della diffusione di notizie e riferimenti per i contatti a mezzo stampa. I media sono stati utilizzati anche a Gela, dove il tema del biomonitoraggio dell’arsenico era già conosciuto dalla comunità a seguito dello studio SEBIOMAG realizzato nel 2008-2009.331_{Ai donatori SEpiAs sono stati consegnati due}

moduli di consenso informato per spiegare le finalità dello studio: Modulo di consenso

informato per la donazione del sangue e urina e Modulo di consenso informato per gli esami cardiovascolari. Nei moduli si specifica la richiesta di esprimere la volontà di

ricevere o meno i risultati delle analisi personali effettuate, direttamente o al medico di famiglia. Per la migliore informazione sul lavoro in corso sono state preparate schede informative per il donatore contenenti i riferimenti specifici dei responsabili delle attività di prelievo e di spedizione dei campioni in ciascuna area: la Scheda informativa

per il paziente. Analisi del sangue e delle urine e la Scheda informativa per il paziente per gli esami cardiovascolari. Per facilitare il reperimento di volontari e l’identificazione dei

luoghi di prelievo e visita sono stati preparati altri due strumenti informativi:un

Volantino informativo, con specifiche diverse per ciascuna delle quattro aree e b) una Locandina, con specifiche diverse per ciascuna delle quattro aree. I donatori hanno

compilato, con l’assistenza di una figura addestrata appositamente, un questionario per la raccolta delle informazioni rilevanti per l’interpretazione dei risultati strumentali. Il Questionario per i donatori è suddiviso nelle seguenti sezioni:

(2)

Materiali e metodi di SEpiAs - Coinvolgimento dei volontari

Sezione A. Dati personali - Dati anagrafici utili per la descrizione

Sezione B. Condizioni ambientali - Localizzazione dell’abitazione di residenza rispetto a impianti industriali (incluso discariche e inceneritori), abitazioni precedenti se residente da meno di 10 anni, tipo e stato dell’abitazione, presenza di animali domestici, uso di acqua per bere e altri usi domestici.

Sezioni C. e D. Attività lavorativa ed esposizione ad agenti chimici e fisici - Tipo di lavoro svolto nel passato e nel presente, tipo di esposizioni lavorative croniche e acute ad agenti tossici (una lista è proposta).

Sezioni E. e F. Abitudini individuali - Fumo attivo e passivo, alcol da utilizzare come classici confondenti o modificatori di effetto rispetto a eventi principali (marcatori) o secondari (condizioni, sintomi, fattori di rischio, attività ricreative).

Sezione G. Storia medica – Richiesta di elenco di malattie e condizioni cliniche diagnosticate dal medico, allergie, sintomi respiratori e cardiovascolari, uso di farmaci.

Sezione H. Dieta - Consumo di cibi (domande su elenco), con specificazione di quantità, frequenza, luogo e modalità di produzione, adesione a diete e perdita di peso.

Sezioni I. e J. Storia riproduttiva - Per le donne è dato rilievo alla storia degli esiti delle gravidanze precedenti e sono richieste informazioni sull’allattamento. Per gli uomini, sono richieste informazioni sulla sterilità o infertilità.

Sezione K. Scheda su percezione di pericoli e rischi - A valle della definizione di pericolo e rischio si richiede di attribuire priorità fattori antropici e naturali, alla loro presenza nell’area, ai mezzi d’informazione abitualmente consultato, giudizio sull’ambiente di vita.

Sezione L. Scheda ambulatoriale – Una scheda in sede di prelievo (riuscita del prelievo, eventuale motivazione del rifiuto) con peso e altezza misurati al momento della somministrazione.

(3)

Materiali e metodi di SEpiAs - Caratterizzazione delle quattro aree in studio

3.2 Caratterizzazione delle quattro aree in studio

Characterization of the 4 study areas

Di seguito vengono riportate le schede caratterizzanti le quattro aree in studio dal punto di vista ambientale e sanitario.

UO1 - Lazio Comuni di Civita Castellana e Ronciglione

Caratterizzazione ambientale - L’area in studio è costituita dai Comuni di Civita

Castellana (16156 residenti) e Ronciglione (8347 residenti) ed è interessata da inquinamento da arsenico nelle acque potabili di origine naturale o antropica. La direttiva 98/83/CE, in vigore dal 2003, impone per l’arsenico nelle acque potabili il valore limite di 10 µg/L. Tra il 2003 ed il 2009 sono state concesse all’Italia 2 deroghe a 50 µg/L e nel 2010 una terza deroga a 20 µg/L per quattro regioni (Toscana, Lombardia, Lazio e Umbria).

I campionamenti di ARPA Lazio sulle acque potabili (periodo 2005-2010) mettono in evidenza valori medi di arsenico superiori a 20 μg/L nei Comuni di Civita Castellana e di Ronciglione. A Civita Castellana su 127 prelievi la concentrazione media di arsenico nelle acque era di 29,5 µg/L, con un massimo di 71,0 µg/L e a Ronciglione la concentrazione media di arsenico su 50 prelievi era 80,4 µg/L, con un massimo di 350,0 µg/L.

Caratterizzazione sanitaria – Nei comuni in studio sono state effettuate analisi di

mortalità utilizzando come riferimento i comuni della provincia di Viterbo con concentrazioni di Asi<10 µg/L ed i risultati, riportati come RR, si riportano nella

(4)

Tabella 19 – Analisi di mortalità per i comuni di Civita Castellana e di Ronciglione. Table 19 – Mortality analysis for municipalities of Civita Castellana and Ronciglione. Civita Castellana Rischi relativi (RR)

Malattie respiratorie RRM=2,48

Broncopneumopatie croniche ostruttive (BPCO) RRM=1,58

Tumore del polmone RRM=1,64

Ronciglione

Malattie sistema circolatorio RRM=1,18

RRF=1,11

Malattie ischemiche del cuore RRM=1,18

Malattie respiratorie RRM=1,37

RRF=1,46

Broncopneumopatie croniche ostruttive (BPCO) RRM=1,82

Diabete RRM=2,20

RRF=2,33

Tumore del polmone RRM=1,45

Tumore della vescica RRM=2,66

Note – RR: Rischio Relativo; M: Maschi; F: Femmine. Notes – RR: Relative Risk; M: Males; F: Females.

UO 2 – Toscana Comune di Abbadia San Salvatore

Caratterizzazione ambientale - L’area in studio, costituita dal Comune di Abbadia

San Salvatore, si colloca nell’area amiatina, caratterizzata da importanti giacimenti minerari, da fenomeni naturali geotermici e da attività di produzione di energia elettrica mediante la coltivazione dei fluidi geotermici. L’area è caratterizzata da livelli di arsenico nelle acque potabili tali da indurre alcuni comuni a far ricorso a richieste di deroga ai limiti normativi. Tra il 2003 ed il 2009 sono state concesse all’Italia due deroghe a 50 µg/L e nel 2010 una terza deroga a 20 µg/L per quattro regioni (Toscana, Lombardia, Lazio e Umbria). Secondo lo studio effettuato dall’Università di Siena nel 2008, la presenza di arsenico, boro e zolfo nei suoli dell’area amiatina è dovuta alla natura del substrato roccioso e non è rilevabile, per tali elementi, un’influenza da parte delle emissioni in atmosfera delle centrali geotermoelettriche nell’area di Bagnore e di Piancastagnaio. La zona amiatina presentava elevati livelli di arsenico nelle acque potabili, ma in seguito all’installazione di impianti di abbattimento e tecniche di diluizione, l’acqua potabile presenta caratteristiche sanitarie migliori rispetto alla fonte di approvvigionamento, in linea con quanto richiesto dalla normativa. Per quanto riguarda le centrali geotermoelettriche, si osservano emissioni quantitativamente significative di anidride carbonica, di acido solfidrico e di ammoniaca, mentre sono molto basse le quantità di arsenico rilasciate. Tra il 2000 ed il 2007 si assiste ad una forte riduzione delle emissioni di acido solfidrico e di mercurio, attribuibile

(5)

all’installazione degli impianti di abbattimento mercurio e idrogeno solforato (AMIS). L’Agenzia Regionale per la Protezione dell’Ambiente Toscana (ARPAT) riporta livelli medi di concentrazione dei vapori di mercurio, in atmosfera, molto inferiori rispetto sia al valore guida WHO per la tutela sanitaria (1000 ng/m3_{come media annuale) sia al più}

restrittivo livello di rischio minimo (Minimal Risk Level - MRL) dell’Agenzia per le sostanze tossiche e registri di patologia (Agency for Toxic Substances & Disease Registry- ATSDR) (200 ng/m3_{). Per l’acido solfidrico si evidenziano due superamenti del valore}

guida per la tutela sanitaria WHO (concentrazione meda giornaliera pari a 150 μg/m3₎

determinando una persistente condizione di inquinamento olfattivo. Per gli altri inquinanti (PM10, SO2, NO2, CO) le concentrazioni sono sempre molto inferiori ai valori di

riferimento stabiliti dalla normativa.

Tabella 20 – Analisi di mortalità e analisi sui ricoverati per il comune di Abbadia San Salvatore. Table 20 – Mortality and hospitalization analysis for Abbadia San Salvatore municipality.

ABBADIA SAN SALVATORE

Mortalità (2000-2006) Stima

Malattie infettive e parassitarie SMRM=283,9

Tutti i tumori SMRM=126,4

Tumore maligno della prostata SMRM=166,1

Malattie del sistema nervoso SMRM=163,9

Malattia ipertensiva SMRF=192,2

Malattie dell’apparato respiratorio SMRM=149,6

Malattie respiratorie acute SMRM=196,5

Polmonite SMRM=191,4

Pneumoconiosi SMRM=359,4

Malattie dell’apparato digerente SMRF=173,1

Insufficienza renale (acuta e cronica) SMRF=162,0

Ricoverati (2004-2006) Stima

Malattie infettive e parassitarie SHRM=165,7

Tubercolosi SHRF=393,0

Malattia ipertensiva SHRM=191,9

Malattie respiratorie acute SHRM=152,8

SHRF=172,0

Polmonite SHRM=152,8

SHRF=192,9

Malattie polmonari croniche ostruttive (MPCO) SHRM=292,5

SHRF=220,4

Broncopneumopatie croniche ostruttive (BPCO) SHRM=335,7

SHRF=238,2

Malattie dell’apparato digerente SHRM=130,0

SHRF=126,3

Malattie dell’apparato genito-urinario SHRM=125,8

Note – SMR: rapporto standardizzato di mortalità; SHR: rapporto standardizzato di ospedalizzazione; M: Maschi; F: Femmine.

(6)

Caratterizzazione sanitaria - Le analisi di mortalità (2000-2006), effettuate

nell’ambito del progetto Geotermia, (Studio Geotermia. Progetto di ricerca epidemiologica sulle popolazioni residenti nell'intero bacino geotermico toscano, 2010), sono state aggiornate da ARS fino al 2009 e i risultati statisticamente significativi sono riportati come SMR in Tabella 20.

UO 3 – Puglia Comune di Taranto

Caratterizzazione ambientale - L’area di Taranto è definita ad “elevato rischio

ambientale” ed è caratterizzata da vari insediamenti che costituiscono possibili sorgenti di inquinamento ambientale:

• un impianto di raffinazione; • un cementificio;

• un inceneritore (Massafra); • diverse centrali elettriche; • i cantieri navali;

• un porto mercantile; • l’arsenale militare;

• lo stabilimento siderurgico ILVA comprendente la produzione di coke, con vasti depositi minerari localizzati a ridosso dell’abitato cittadino.

Per quanto riguarda le emissioni di arsenico nelle matrici aria e acqua, le dichiarazioni INES (Inventario Nazionale delle Emissioni e loro Sorgenti)/EPTR nel periodo 2003-2010, mostrano per la provincia di Taranto un andamento discordante nelle due matrici: si registra una tendenziale riduzione del trend emissivo di arsenico nell’acqua, con un

plateau negli ultimi anni, laddove nell’aria si osserva, a partire dal 2006, un sensibile

incremento. In particolare, si può osservare che il dato emissivo in atmosfera della provincia di Taranto per il periodo 2006-2010 rappresenta dal 70 al 100% di quell’intera regione.

Caratterizzazione sanitaria – Visti i recenti sviluppi che hanno coinvolto il comune

di Taranto, riguardanti l’impianto ILVA, e considerata la mole dei dati e dei risultati ottenuti con i vari studi condotti in quest’area, è impensabile riassumere in una tabella i dati di mortalità e di ospedalizzazione. Si riporta, invece, una descrizione complessiva

(7)

dello stato di salute del comune di Taranto. La popolazione di Taranto esposta alle emissioni industriali mostra un quadro sanitario ormai compromesso. La procedura di

risk assessment nell’area di Taranto attribuisce gran parte degli eccessi agli idrocarburi

policiclici aromatici e in particolare al benzo[a]pirene (circa 87% del rischio cancerogeno totale per via inalatoria) e la stima del rischio cancerogeno per via inalatoria attribuito all’arsenico emesso dallo stabilimento siderurgico ILVA, risulta inferiore a 1:100.000 anche in prossimità dell’area industriale (2,7% del rischio cancerogeno totale per via inalatoria è attribuito all’arsenico). I dati di monitoraggio delle matrici aria e acqua potabile negli anni 2011 e 2012 mostrano una situazione confortante rispetto all’arsenico e i dati del biomonitoraggio umano evidenziano dosaggi urinari di arsenico eccedenti i valori di riferimento, almeno per quanto riguarda il 95°percentile a Statte, ma non nel Comune di Taranto.

UO 4 – Sicilia Comune di Gela

Caratterizzazione ambientale - Il Comune di Gela comprende il sito di interesse

nazionale (SIN) di Gela ed è incluso insieme ai Comuni di Butera e Niscemi, nell’”area a

elevato rischio di crisi ambientale”. Il SIN include sia aree a terra (private e pubbliche) sia

superfici a mare. Le aree private all’interno del SIN sono:

• Syndial Spa (ex Agricoltura Spa in liquidazione, ex Enichem)

• EniMed, Eni Mediterranea Idrocarburi Spa (ex ENI divisione Exploration & Production, ex Agip mineraria)

• Raffineria di Gela Spa (ex AGIP)

• ISAF (Industria Siciliana Acido Fosforico S.p.A. in liquidazione) • Polimeri Europa Spa (ex Enichem).

Di questi solo EniMed, Raffineria di Gela e Polimeri Europa hanno impianti in attività. Le aree pubbliche all’interno del SIN sono:

• il Biviere di Gela; • l’area marina;

• i tratti terminali dei torrenti Gattano, Acate e del fiume Gela; • la discarica Cipolla.

(8)

Le sostanze pericolose presenti nell’acqua sotterranea, che mostrano elevati superamenti dei limiti normativi, sono prevalentemente metalli pesanti (arsenico, mercurio, nichel, manganese, ferro, piombo, alluminio, cobalto, selenio, vanadio, cadmio, manganese, ferro, cromo), idrocarburi policiclici aromatici (IPA), composti alifatici clorurati cancerogeni e BTEX (benzene, toluene, etilbenzene e xileni). L’arsenico ha mostrato concentrazioni massime fino a 25000 volte il limite normativo. Molti parametri del suolo superano in modo rilevante le concentrazioni limite della normativa e in particolare l’arsenico ha mostrato un livello massimo di 34,24 mg/Kg, rispetto ad una concentrazione soglia di contaminazione (CSC) di 20 mg/Kg.

Nell’ambito di un’indagine ambientale effettuata dall’Istituto sull’Inquinamento Atmosferico del CNR, i valori medi di arsenico rilevati nei mesi di gennaio, aprile, luglio e ottobre del 2005 sono risultati compresi tra 0,3 e 1,3 ng/m3_{, sensibilmente al di sotto del}

valore soglia di 6 ng/m3_{. Nel 2010 la raffineria di Gela ha emesso in atmosfera 32 kg di}

arsenico e 1,52 tonnellate nelle acque (fonte E-PRTR).

Caratterizzazione sanitaria - Le analisi di mortalità e di morbosità (Tabella 21)

sono state effettuate confrontando i dati locali con due riferimenti, quello regionale al 2001 e quello locale riferito a 18 comuni limitrofi l’area a rischio (L=riferimento locale; R=riferimento regionale).

(9)

Tabella 21 – Analisi di mortalità e di morbosità per il comune di Gela. Table 21 – Mortality and morbidity analysis for Gela municipality.

GELA

Mortalità (2004-2011) Riferimento

Locale (L) Riferimento Regionale (R) SMRM SMRF SMRM SMRF

Tutte le cause 106,8 112,3 108,2

Tutti i tumori 118,3 121,5

Tumore maligno dello stomaco 147,5

Tumore maligno della trachea, dei bronchi e del polmone 160,0

Morbo di Hodgkin 1007,3

Malattie del sistema circolatorio 114,2 113,2 114,2

Malattie ischemiche del cuore 104,9

Malattie cerebrovascolari 140,2 136,6 142,9

Sintomi, segni e stati morbosi mal definiti 136,7 147,8 131,7

Traumatismi ed avvelenamenti 146,7

Morbosità (2007-2011) Riferimento

Locale (L) Riferimento Regionale (R) SHRM SHRF SHRM SHRF

Tutte le cause 113,9 114,6 120,2 118,6

Malattie infettive e parassitarie 115,2 121,4 116,0

Tutti i tumori 113,0 114,8 107,7

Tumore maligno dello stomaco 145,1

Tumore maligno della pleura 309,1

Tumore maligno del sistema nervoso centrale 200,6 162,7

Mieloma multiplo 213,9 180,2

Diabete mellito 124,1

Malattie del sangue e degli organi ematopoietici 117,6 147,9 165,3

Malattie psichiatriche 149,0 158,9 117,6 119,6

Malattie del sistema nervoso 153,1 12,0 180,8 206,5

Malattie del sistema circolatorio 113,2 121,8 112,7 138,5

Malattie cerebrovascolari 141,9 167,1 160,1 183,7

Malattie dell’apparato respiratorio 108,7 110,1 123,1 126,5

Asma (0-14 anni) 163,3

Asma 141,4

Malattie acute dell’apparato respiratorio 109,1 112,8 139,6 148,1

Malattie croniche dell’apparato respiratorio 117,9

Malattie dell’apparato digerente 122,1 134,2 135,7 138,6

Malattie del’apparato urinario 116,5 154,4 116,6

Nefrosi 239,0

Insufficienza renale 118,2 151,7 114,5

Sintomi, segni e stati morbosi mal definiti 127,9 139,0 175,5 189,6

Traumatismi ed avvelenamenti 129,0 131,1 147,8 146,4

Note – SMR: rapporto standardizzato di mortalità; SHR: rapporto standardizzato di ospedalizzazione; M: Maschi; F: Femmine.

(10)

Materiali e metodi di SEpiAs - Marcatori utilizzati

3.3 Marcatori utilizzati

Markers used

Secondo il Protocollo SEpiAs (Allegato 1), le UO 5-8 avevano, rispettivamente, il compito di:

UO5 – (a) valutare l’influenza di polimorfismi funzionali di geni coinvolti nei meccanismi

di detossificazione metabolica e riparazione del DNA nella modulazione di danno genetico ed epigenetico; (b) identificare alterazioni epigenetiche mediante valutazione dello stato di metilazione globale e di geni target in cellule circolanti; (c) valutare l’instabilità genetica con test del MN, biomarcatore cromosomico, accorciamento dei telomeri, come marcatori precoci di rischio di malattie cronico-degenerative.

UO6 – (a) il danno al DNA tramite la presenza della forma fosforilata dell’istone H2AX;

(b) la sintesi di poli(ADP-ribosio) come risposta a condizioni di stress; (c) l’apoptosi mediante vari parametri morfologici e biochimici.

UO7 - Misurare le diverse forme di As in urine e sangue periferico, conoscenza

fondamentale per differenziare la quota inorganica presente come As(III) e As(V), dalle forme organiche presenti come acido monometilarsonico, acido dimetilarsinico, arsenobetaina e arsenocolina, molto diverse in termini di pericolosità per la salute umana, in termini di cancerogenicità, tossicità, metabolismo, delle caratteristiche individuali.

UO8 - dedicata ai marcatori di danno preclinico aterosclerotico: lunghezza del tratto Q-T

del tracciato ECG, indici ultrasonografici di danno preclinico come lo spessore medio intimale carotideo, la compliance arteriosa, lo score del calcio ed il grasso pericardico.

3.3.1 Biomarcatori molecolari

Molecular biomarkers

Come già accennato alla fine del paragrafo 1.3, esiste un’elevata variabilità inter-individuale nella suscettibilità alla tossicità indotta da arsenico e probabilmente alcuni fattori genetici specifici svolgono un ruolo molto importante nel causare tale variabilità come per esempio i polimorfismi genetici negli enzimi che codificano i geni coinvolti nel metabolismo dell’arsenico, come AS3MT e le glutatione S-transferasi (GST).70,332,333_I

(11)

coinvolti nel sistema di riparazione del DNA, come X-Ray repair cross-complementing

group 1 - XRCC1 e la 8-ossiguanina DNA glicosilasi 1 umana (human 8-oxiguanine DNA glycolase - hOGG1), inoltre, riducono la capacità di riparazione del danno ossidativo

indotto dall’arsenico inorganico.334,335

In particolare, in SEpiAS sono stati utilizzati i seguenti biomarcatori molecolari:

AS3MT – E’ l’enzima che catalizza la conversione da As(III) ad MMA e di MMA a DMA. Dato che è difficile determinare la capacità enzimatica di AS3MT nei tessuti umani, i profili dell’As urinario vengono utilizzati in SEpiAS come indicatore surrogato della capacità di metilazione dell’arsenico da parte di un individuo. Nell’uomo, infatti, una metilazione efficiente dell’Asi a DMA è associata ad un elevato tasso di escrezione di

arsenico nelle urine.336_{Un metabolismo incompleto di As, con As}_i_{e MMA urinari più}

elevati, ma più basso DMA, sembra essere un marcatore dell’aumento della suscettibilità verso patologie correlate all’arsenico, compreso il cancro.337,338_{Il rapporto delle}

concentrazioni urinarie di MMA/Asi detto anche indice di metilazione primaria (Primary Methylation Index - PMI),339_{indica la capacità di completare il primo step della}

metilazione e DMA/MMA, ovvero l’indice di metilazione secondaria (Secondary

Methylation Index - SMI), il secondo step.339,340_{I risultati ottenuti dagli studi di}

popolazione, infatti, suggeriscono che, tra gli SNP, il polimorfismo Met287Thr è associato all’aumento della capacità del primo step di metilazione aumentando la percentuale di MMA urinario143,341-345_{(Tabella 22) e quindi alla variazione}

inter-individuale nel metabolismo dell’As.346

Tabella 22 – Relazioni tra variazioni individuali nel metabolismo e nella tossicità dell’arsenico con il

polimorfismo Met287Thr del gene AS3MT.

Table 22 – Relationships among individual variations in arsenic metabolism and toxicity with Met287Thr

genetic polymorphism in AS3MT gene.

Polimorfismo Area di studio Associazione Rif.

Met287Thr

Europa centrale (Ungheria, Romania e Slovacchia –

Studio ASHRAM) ↑%MMA, ↓%DMA [342]

Chuquicamata (Cile) ↑%MMA [343],[344]

Hoa Hau, Provincia di Liem Thuan in Ha Nam (Vietnam) ↑MMA/As [345]

Torreon, Coahuila (Mexico) ↑danno DNA [143]

Matlab (Bangladesh) ↓Asi, ↑%DMA [346]

Note - ↑ aumento; ↓ riduzione. Fonte Sumi e Himeno, 2012. Notes - ↑ increase; ↓ reduction. Source Sumi and Himeno, 2012.

(12)

GST-T1 e GST-M1 – Le GST rappresentano il gruppo di enzimi coinvolti nella fase II delle reazioni di detossificazione. Questi enzimi catalizzano principalmente la coniugazione del GSH ridotto al centro elettrofilico dei composti esogeni o endogeni (dopamina, prostaglandina, prodotti della perossidazione lipidica, chemio terapeutici e cancerogeni ambientali). La coniugazione con GSH aumenta la solubilità e facilita l’escrezione di questi composti. Le GST hanno un ruolo importante nel metabolismo dell’Asi, al quale si ritiene prendano parte 4 classi di GST citosoliche (GST-P1, GST-O1,

GST-M1 e GST-T1). GST-O1 e GST-O2 riducono il monometilarsonato347,348_{e l’aumento}

dell’espressione di GST-P1 avviene in alcune linee cellulari As-resistenti ed è inoltre collegata alla formazione dei coniugati arsenico-GSH che vengono escreti dalle cellule attraverso trasportatori di proteine.349-353_{In particolare i polimorfismi di GST-T1 e di}

GST-M1 sono associati a profili urinari distinti dei metaboliti dell’arsenico in popolazioni cronicamente esposte ad acque potabili contaminate da Asi.354-357 Studi epidemiologici

dimostrano che l’assenza o le attività aberranti degli enzimi GST-T1 e GST-M1, dovute al polimorfismo genetico, sono responsabili del rischio di sviluppo di molteplici patologie come il cancro,358-364_{patologie cardiovascolari}365_{o diabete.}366,367_{GST-T1 e GST-M1}

condividono un polimorfismo comune che consiste nella completa assenza nel gene, cioè genotipo nullo. Questo tipo di delezione porta ad una completa perdita dell’attività enzimatica ed è associata ad un aumento della suscettibilità degli individui verso gli agenti genotossici e cancerogenici a causa probabilmente di uno sbilanciamento della capacità di detossificazione.368,369

XRCC1 e hOGG1 – Come accennato all’inizio del paragrafo, l’arsenico è in grado di indurre danno al DNA e di alterare la capacità cellulare di riparazione del DNA370-373_e

quindi i polimorfismi nei sistemi di riparazione del DNA possono influenzare la suscettibilità degli individui all’arsenico. I polimorfismi dei geni coinvolti nei sistemi di riparazione del DNA, non solo sono in grado di alterare la riparazione del DNA in generale, ma oltretutto lo fanno in un modo dipendente dall’esposizione ad arsenico. BER e la riparazione per escissione di nucleotide sono i due principali meccanismi di riparazione del DNA attraverso i quali il corpo ripara spontaneamente ed in modo endogeno il danno al DNA374-376_{anche se BER è comunque il principale meccanismo}

deputato alla rimozione di lesioni di tipo ossidativo375_{che si pensa abbiano un ruolo}

importante nella tossicità indotta da arsenico.377,378_{Nel BER sono coinvolte molte}

(13)

interagire con molte componenti enzimatiche, in qualsiasi stadio del processo di riparazione, come la DNA polimerasi b (POL b) e hOGG1379_{e, inoltre, ripara le rotture del}

singolo filamento che hanno origine dal processo di BER. hOGG1 è una proteina specifica per la riparazione del danno ossidativo, principalmente l’addotto del DNA 8-OHdG.380_I

SNP nei sistemi di riparazione del DNA possono influenzare la suscettibilità nei confronti del danno ossidativo. Due varianti in questi geni riducono la capacità di riparazione del danno ossidativo, precisamente hOGG1 Ser326Cys (rs1052133) e XRCC1 Arg399Gln (rs25487)381_{con conseguente rischio di accumulo del danno al DNA e di insorgenza di}

diverse patologie, addirittura del cancro.376,382-384

Dato che il danno al DNA, in particolare quello che viene causato dalle ROS, ha un ruolo molto importante nella cancerogenesi abbiamo quindi deciso di studiare, in SEpiAs, i polimorfismi AS3MT Met287Thr (rs11191439), GST-T1, GST-M1, XRCC1 Arg399Gln (rs25487), hOGG1 Ser326Cys (rs1052133), coinvolti nella variazione inter-individuale nel metabolismo e nella tossicità dell’arsenico.

3.3.2 Marcatori di danno al DNA, di stress cellulare e di apoptosi

Markers of DNA damage, cellular stress and apoptosis

La modificazione della proteina legata al DNA, l’istone H2AX, è una delle risposte più precoci messe in atto dalla cellula per contrastare la rottura al DNA indotta dall’arsenico; determinare i livelli di questa proteina modificata, quindi, è un mezzo per stimare la presenza di rotture nel DNA. L'analisi della proteina H2AX modificata può essere effettuata analizzandone i livelli dopo esperimenti di immunofluorescenza indiretta condotti con un anticorpo che riconosce specificamente la forma fosforilata.385

In condizioni di stress cellulare, come esposizione a sostanze mutagene, danno al DNA, cambiamenti dell'ambiente intracellulare, una delle prime risposte della cellula è l'attivazione della proteina PARP-1, che è un sensore di situazioni di potenziale pericolo per la cellula. La proteina reagisce al pericolo con la sintesi del polimero PAR, che promuove i meccanismi di difesa della cellula e che può essere visualizzato all'interno della cellula in seguito ad esperimenti di immunofluorescenza indiretta che prevedono l’uso di un anticorpo monoclonale diretto contro il polimero.386,387

(14)

culminano con l’attivazione di una proteasi, la caspasi 3. Utilizzando un anticorpo in grado di rivelare la forma attiva di questo enzima è possibile monitorare l’apoptosi. 388-391

3.3.3 Esami cardiovascolari

Cardiovascular exams

Vari studi di popolazione hanno messo in relazione l’esposizione ad elevati livelli di arsenico, in particolare nell’acqua potabile, con l’aumento di incidenza di malattia coronarica, arteriopatia periferica e mortalità cardiovascolare,392_{così come}

un’associazione sia tra l’esposizione ad arsenico e fattori di rischio cardiovascolare quali l’ipertensione arteriosa, il diabete mellito e il danno renale, sia tra esposizione ad arsenico e danno vascolare subclinico quale l’aterosclerosi carotidea.393_{I meccanismi}

coinvolti nel fenomeno sono ancora da chiarire, ma il primo passo sembra essere rappresentato dalla disfunzione endoteliale.394_{Meno chiari sono gli effetti}

dell’esposizione a bassi livelli di arsenico e il loro impatto sull’apparato cardiovascolare: a tali livelli, l’effetto atteso è minore, e le limitazioni di metodo (quali la difficoltà di stabilire con precisione l’esposizione cumulativa, ma anche distinguere arsenico organico e inorganico) hanno un maggior peso, così come le difficoltà di stabilire

outcomes affidabili e il ruolo dei fattori di confondimento. I segni precoci di

modificazione funzionale o strutturale (indici ultrasonografici di spessore medio intimale carotideo, funzione endoteliale e compliance arteriosa e/o i livelli circolanti delle cellule progenitrici endoteliali circolanti) sono predittori di eventi clinici a carico del sistema cardiovascolare, utili inoltre per valutare la suscettibilità individuale.

Nell’ambito del progetto SEpiAs, gli indicatori precoci selezionati sono stati: • Ispessimento medio-intimale carotideo – (IMT)

L’ispessimento medio-intimale dell’arteria carotide è un noto fattore di rischio per lo sviluppo di eventi cardiovascolari.395,396_{Data l’associazione fra esposizione ad arsenico e}

aumento di eventi cardiovascolari, e quella fra arsenico e altre alterazioni subcliniche che si situano nel continuum cardiovascolare quali l’ipertensione arteriosa e l’aterosclerosi, è stata indagata l’associazione fra spessore medio-intimale e livelli di arsenico.

(15)

Placche calcificate all’interno delle coronarie costituiscono un marker di carico aterosclerotico predittivo di futuro rischio di eventi cardiovascolari. Solitamente esso viene valutato tramite analisi di immagini CT (Agatston Score). Il CS ecografico utilizzato è un’alternativa di pari livello diagnostico, ma ottenuto con una metodologia di imaging semplice, molto diffusa, poco costosa e non ionizzante.397

Tutte le valutazioni sono servite alla progressione del lavoro per decidere i modelli di analisi, in particolare per decidere le variabili da includere, le soglie da considerare e, inoltre, hanno costituito base per la discussione.

3.3.4 Marcatori di esposizione

Markers of exposure

Già nel paragrafo 1.2 si è parlato dell’importanza della speciazione dell’arsenico sono state quindi speciate le seguenti forme:

- Acido dimetilarsinico [DMA(V)] - Acido monometilarsonico [MMA(V)] - As(III)

(16)

Materiali e metodi di SEpiAs – Metodi di analisi

3.4 Metodi di analisi

Methods of analysis

Gli obiettivi delle analisi effettuate sono la valutazione delle:

• differenze delle distribuzioni delle diverse forme arsenicali, come definite nel paragrafo precedente, tra i campioni di soggetti residenti nelle quattro aree in studio (paragrafo 3.4.1);

• associazioni tra i fattori di esposizione (territorio, occupazione, dieta, stili di vita, ecc.) e le concentrazioni delle varie forme arsenicali (paragrafo 3.4.2);

• associazioni tra marcatori di danno al DNA e le concentrazioni di arsenico (paragrafo 3.4.3);

• associazioni tra IMT e concentrazioni di arsenico (paragrafo 3.4.4). Le analisi statistiche vengono effettuate con i pacchetti STATA13 ed R.

3.4.1 Distribuzione dei livelli di arsenico nel campione in studio

Distribution of arsenic levels in the study sample

Inizialmente viene descritta la distribuzione dei livelli di arsenico nel campione che risulta asimmetrica con diversi valori inferiori al limite di rilevabilità (Limit of

Detection - LOD). Nel caso di distribuzioni asimmetriche è necessario trasformare i dati

originali attraverso una funzione in modo da normalizzarli. A tale scopo viene utilizzata la trasformazione logaritmica dei campioni biologici di arsenico. La media dei dati logaritmici è la media geometrica (MG) dei dati originali. Si calcola la MG perché è una misura che non risente della presenza di valori anomali che possono influire sull’interpretazione della analisi. Alle misure di arsenico inferiori al LOD, inoltre, si assegna il valore di LOD/√2 398_{in modo da stimare in modo più accurato la MG che}

viene calcolata attraverso la seguente formula: 𝑀𝐺 = 𝑒∑ ln 𝑥𝑖

𝑛 𝑖=1

𝑛

dove 𝑛 è il numero di soggetti e 𝑥𝑖 è la i-esima concentrazione di arsenico.

Per la descrizione dei campioni di arsenico, oltre la MG, si utilizzano la mediana, il 25°, il 75° ed il 95° percentile (P25, P75, P95, rispettivamente), la deviazione standard (DS) e gli intervalli di confidenza al 95% (IC95%) della MG.

(17)

Nelle analisi vengono considerati i seguenti cutoff:

• 1,5 µg/L per Asi e 15 µg/L per Asi+MMA+DMA: soglie di riferimento suggerite

dalla SIVR;

• 3,86 µg/L per Asi e 19,3 µg/L per Asi+MMA+DMA. Tali cutoff rappresentano il

valore minimo di esposizione potenzialmente in grado di far insorgere effetti sulla salute.399_{La presenza di numerosi soggetti con arsenico inorganico al di}

sopra del cutoff è il presupposto per la messa a punto di una sistema di sorveglianza ambientale e sanitaria.

A questo punto si calcola, per area e per sesso, la percentuale di Asi e delle forme

metilate sulla misura totale e si descrivono gli indici di metilazione primario (PMI=MMA/Asi), secondario (SMI=DMA/MMA) e totale (DMA/Asi).

Attraverso un modello di regressione lineare multivariato si valuta l’effetto delle interazioni tra i fattori zona, sesso ed età sulla concentrazione di arsenico. La significatività statistica delle interazioni è stata valutata tramite test del rapporto di verosimiglianza (confronto tra modello con interazioni e senza interazioni).400

3.4.2 Analisi di associazione tra fattori di esposizione, di suscettibilità genetica e concentrazione di arsenico

Analysis of association among exposure factors, factors of genetic susceptibility and arsenic concentrations

Le analisi vengono effettuate attraverso i seguenti step:

• analisi esplorativa con lo scopo di evidenziare associazioni con evidenze scientifiche limitate tra arsenico e fattori di esposizione e di suscettibilità genetica da approfondire nello step successivo;

• analisi con lo scopo di valutare associazioni tra arsenico e fattori selezionati sia dall’analisi esplorativa sia dalla conoscenza epidemiologica a priori riportata in letteratura;

• analisi di correlazione tra fattori risultati più informativi dalle analisi univariate e multilineari.

Analisi esplorativa di associazione tra fattori di esposizione e concentrazione di arsenico - Dal questionario somministrato ai soggetti del campione, vengono selezionate

(18)

precedenza per effettuare una prima analisi di tipo esplorativo dei dati raccolti per individuare quelle variabili correlate ad elevati livelli di arsenico urinario, sottoforma sia di Asi sia di Asi+MMA+DMA. La Tabella 23 riporta le variabili utilizzate per tale analisi ed

il valore assegnato ad ogni variabile. Alcune variabili, raccolte dal questionario per costituire un archivio di dati da rendere disponibile anche per studi futuri, sono state scartate dall’analisi esplorativa perché ritenute poco informative ai fini dell’indagine sui livelli urinari di Asi. L’analisi è effettuata su 267 soggetti per i quali sono a disposizione

dati completi relativi al questionario, ai polimorfismi e ai livelli di arsenico urinario.

Tabella 23 - Variabili selezionate per l’analisi esplorativa. Table 23 - Variables selected for explorative analysis.

Var. Descrizione Valore

Dati personali

Sesso F Il soggetto è di sesso femminile? Dicotomica

Età Età 20-29, 30-39, 40-44

Z Indicazione di appartenenza alla zona dell’Amiata, di Viterbo, di Taranto o di Gela Amiata, Viterbo, Taranto, Gela

Condizioni ambientali

B8a Presenza (in passato) di umidità, muffe p funghi sulle pareti o soffitti di casa Dicotomica B8b Presenza (attualmente) di umidità, muffe p funghi sulle pareti o soffitti di casa Dicotomica RA Indicazione di appartenenza ai seguenti quartieri di Taranto: Tamburi-Lido Azzurro

(T-LA), Città Vecchia-Borgo (CV-B), Paolo VI (PVI) o altri (A) T-LA, CV-B, PVI, A Dist Distanza dalle abitazioni di soggetti del campione di Gela dalle seguenti coordinate: Lat

37.059475 – Long 14.273302 Numerico (Km)

Acqua

B11.1 Il soggetto beve abitualmente acqua da acquedotto pubblico Dicotomica B11.2 Il soggetto beve abitualmente acqua da pozzo privato Dicotomica B11.3 Il soggetto beve abitualmente acqua imbottigliata Dicotomica B11.4 Il soggetto beve abitualmente acqua di altro tipo (depurata, filtrata, dearsenificata, ecc.) Dicotomica B12.1 Il soggetto cucina abitualmente con acqua di acquedotto pubblico Dicotomica B12.2 Il soggetto cucina abitualmente con acqua di pozzo privato Dicotomica B12.3 Il soggetto cucina abitualmente con acqua imbottigliata Dicotomica B12.4 Il soggetto cucina abitualmente con acqua di altro tipo (depurata, filtrata,

dearsenificata, ecc.) Dicotomica

Attività lavorativa

C1 Il soggetto ha mai lavorato? Dicotomica

C1.1 Il soggetto lavora attualmente? Dicotomica

Esposizione ad agenti chimici e fisici

D1 Il soggetto è mai stato esposto, nel suo lavoro, a polveri, sostanze chimiche, gas o

radiazioni? Dicotomica

D1a.1 Il soggetto è mai stato esposto, nel suo lavoro, a silice e lana di vetro? Dicotomica D1a.2 Il soggetto è mai stato esposto, nel suo lavoro, ad asbesto o amianto? Dicotomica D1a.3 Il soggetto è mai stato esposto, nel suo lavoro, a berillio? Dicotomica D1a.4 Il soggetto è mai stato esposto, nel suo lavoro, a polveri di metallo? Dicotomica D1a.5 Il soggetto è mai stato esposto, nel suo lavoro, a derivati del petrolio? Dicotomica Dia.6 Il soggetto è mai stato esposto, nel suo lavoro, ad esalazioni auto, altri gas o fumi? Dicotomica D1a.7 Il soggetto è mai stato esposto, nel suo lavoro, a solventi organici, tinture o acidi? Dicotomica D1a.8 Il soggetto è mai stato esposto, nel suo lavoro, a polveri di legno o carbone? Dicotomica D1a.9 Il soggetto è mai stato esposto, nel suo lavoro, a radiazioni ionizzanti? Dicotomica D1a.10 Il soggetto è mai stato esposto, nel suo lavoro a radiazioni non ionizzanti? Dicotomica D2 Il soggetto ha mai avuto malattia o avvelenamento da esposizione a sostanze chimiche

sul lavoro o per altre attività? Dicotomica

D3 Il soggetto ha mai lavorato in un impianto di trattamento rifiuti? Dicotomica D4 Il soggetto ha mai lavorato in un’azienda agricola? Dicotomica D5 Il soggetto ha mai utilizzato pesticidi al di fuori dell’orario di lavoro? Dicotomica

(19)

D6 Il soggetto ha mai lavorato in un’industria di prodotti chimici? Dicotomica D7 Il soggetto ha mai lavorato con condensatori, bobine di motori elettrici, altri strumenti

con oli dielettrici o isolanti o fluidi idraulici? Dicotomica

Fumo, alcol, caffè

F1 Il soggetto ha mai fumato? Dicotomica

F4 Il soggetto consuma abitualmente 1-2 bicchieri di birra al giorno? Dicotomica F5 Il soggetto consuma almeno 1-2 bicchieri di superalcolici al giorno? Dicotomica F6.1 Il soggetto consuma abitualmente aperitivi? Dicotomica F6.2 Il soggetto consuma abitualmente misto-analcolici e superalcolici? Dicotomica F6.3 Il soggetto consuma abitualmente grappa, whisky, cognac e simili? Dicotomica

F7 Quanto spesso il soggetto beve caffè? 1=Mai, 2=Qualche

tazz./sett, 3=tutti i giorni

Storia medica

G3 Il soggetto assume abitualmente farmaci? Dicotomica

G3a-h Il soggetto assume abitualmente: ormoni tiroidei (a), farmaci anticoncezionali (b), antistaminici (c), analgesici (d), gastrici (e), anti-colesterolo (f), anti-ipertensivi (g), anti-aggreganti (h)?

Dicotomica

Dieta

H1a-z Il soggetto consuma almeno 1-2 volte a settimana i seguenti cibi? Latte intero (a), latte scremato (b), yogurt (c), bevande a base di latte (d), formaggio (e), mozzarella (f), burro (g), pollami (h), manzo (i), maiale (j), agnello (k), cavallo (l), prodotti a base di maiale (m), fegato (n), pesce (o), molluschi e crostacei (p), uova (q), verdure fresche (s), frutta (t), oli e grassi vegetali (u), oli e grassi animali (v), cereali (w), pasta e pane (x), biscotti (y), vino (z)

Dicotomica

H1a-zP Il soggetto consuma almeno 1-2 volte a settimana i seguenti cibi di produzione propria o locale? Latte intero (a), latte scremato (b), yogurt (c), bevande a base di latte (d), formaggio (e), mozzarella (f), burro (g), pollami (h), manzo (i), maiale (j), agnello (k), cavallo (l), prodotti a base di maiale (m), fegato (n), pesce (o), molluschi e crostacei (p), uova (q), verdure fresche (s), frutta (t), oli e grassi vegetali (u), oli e grassi animali (v), cereali (w), pasta e pane (x), biscotti (y), vino (z)

Dicotomica

H2 Il soggetto fa uso di integratori alimentari? Dicotomica H2a-g Il soggetto fa uso dei seguenti integratori? Ferro (a), sali minerali (b), vitamine

(c),antiossidanti (d), integratori per ossa/articolazioni (e), proteine (f), anticolesterolo (g)

Dicotomica H3 Il soggetto ha mai seguito diete particolari? Dicotomica H3a-d Il soggetto ha mai seguito diete: dimagranti (a), terapeutiche (b), disintossicanti (c),

proteiche (d)? Dicotomica

H4 Il soggetto ha mai perso più di 10 kg nell’arco di sei mesi? Dicotomica L Il soggetto ha mai assunto nei tre giorni precedenti il prelievo pesci, molluschi o

crostacei? Dicotomica

Allattamento e pre-menopausa

I10a Il soggetto sta allattando? Dicotomica

J2 Il soggetto è in pre-menopausa? Dicotomica

Polimorfismi

AS3MT Il soggetto ha almeno un allele mutato Dicotomica

GSTT+ Il soggetto è portatore del genotipo wildtype del gene GST-T1 Dicotomica GSTM Il soggetto è portatore del genotipo wildtype del gene GST-M1 Dicotomica

Nota - Le variabili di tipo dicotomico hanno valori 0/1 riferiti alle risposte NO/SI. Note - Dichotomous variables are set to 0 if the answer is NO and 1 if the answer is YES.

Per effettuare l’analisi espolorativa vengono utilizzati alberi decisionali,401_{in modo da}

ottenere informazioni sull’associazione di variabili eventualmente responsabili di un livello elevato di Asi nelle urine, e successivamente la regressione multilineare, per

spiegare la relazione esistente tra la variabile dipendente (y) e più variabili (indipendenti) caratterizzanti i soggetti oggetto di studio. In particolare l’obiettivo della

(20)

regressione lineare è l’identificazione delle variabili più significative mediante procedure stepwise da sottoporre ad analisi successive.

Gli alberi decisionali rientrano tra le tecniche di data mining e sono utilizzati per costruire modelli predittivi a partire dall’insieme dei dati iniziali. Scopo di questa applicazione è classificare i soggetti del dataset nella loro esatta classe di appartenenza. Per effettuare tale studio, i 267 soggetti selezionati per l’analisi esplorativa sono stati suddivisi in tre classi: classe A (Asi>3,86 µg/L, n=68), classe B (1,5 µg/L<Asi<3,86 µg/L,

n=68) e classe C (Asi<1,5 µg/L, n=131) (vedere paragrafo 3.4.1 per la definizione dei

valori di 1,5 e 3,86 µg/L). Su questa base si sviluppano modelli di classificazione, la cui affidabilità statistica viene valutata in accordo a valori fissati come un’accuratezza >60% ed un TPrate>0,50.402

In seguito a tale analisi si sviluppano modelli di regressione considerando come variabile dipendente continua il logaritmo naturale di Asi, ln(Asi) ed il logaritmo

naturale di Asi più le sue forme metilate, ln(Asi+MMA+DMA). La scelta delle variabili da

inserire nel modello per la descrizione del fenomeno oggetto di studio viene affrontata con particolare cura, tenendo conto che a) il modello dovrebbe includere solo quelle variabili indipendenti la cui variazione apporta un contributo reale alla variazione di ln(Asi) e ln(Asi+MMA+DMA), che b) alcune di queste variabili potrebbero risultare

statisticamente significative e venire quindi incluse casualmente e che c) alcune variabili, considerate a priori importanti per il fenomeno oggetto di studio, potrebbero risultare statisticamente non significative ed essere così escluse dal modello. A causa di queste considerazioni, quindi, si sviluppano diversi modelli e si seleziona poi quello ritenuto migliore in base alla significatività statistica e all’interpretabilità. Le variabili coinvolte nei modelli vengono selezionate secondo diversi metodi utilizzati in sequenza o alternativamente, come l’eliminazione di variabili con variabilità bassa (esposti<1%) o nulla, l’eliminazione delle variabili intercorrelate,403_{l’eliminazione backward manuale, la} stepwise regression automatica,404_{la Correlation-based Feature Subset Selection}

(CfsSubsetEval):406,406_{algoritmo che valuta l’efficacia di un sottoinsieme di variabili}

considerando l’abilità predittiva di ciascuno di essi (rispetto ad y) ed eliminandone la ridondanza attraverso una selezione basata sulla intercorrelazione tra variabili. I modelli di regressione multi-lineare vengono selezionati considerando un numero massimo di variabili coinvolte nel modello ≤20% del numero di soggetti del modelling

(21)

significatività statistica per ciascuna variabile indipendente <0,2. La scelta di una probabilità del 20% ha permesso di essere meno conservativi nella scelta di variabili da approfondire nelle analisi di associazione tra fattori di esposizione e concentrazione di arsenico (basate su ipotesi a priori) riportate successivamente.

Analisi di associazione tra fattori di esposizione e concentrazione di arsenico - Con

questa analisi si vogliono valutare le associazioni statisticamente significative tra i fattori di esposizione, i fattori di suscettibilità genetica e la concentrazione di arsenico, prendendo in considerazione sia fattori di esposizione associati in letteratura a concentrazioni significative di arsenico sia fattori risultati significativi dalle analisi esplorative. Sono stati considerati solamente le variabili che presentano variazioni di MG statisticamente significative (p<0,05) o ai limiti della significatività statistica (p<0,10) e con un numero di casi maggiore o uguale a 3. Le variabili selezionate sono le seguenti:

• zona (Amiata, Viterbese, Taranto, Gela); • sesso;

• classe di età (20-29, 30-39, 40-44 anni);

• consumo di acqua da bere (acquedotto, pozzo, acqua minerale imbottigliata); • consumo di acqua per cucinare (acquedotto, pozzo, acqua minerale

imbottigliata);

• esposizione lavorativa (esposizione a polveri, sostanze chimiche, gas o radiazioni, avvelenamenti da esposizione a sostanze chimiche sul lavoro, esposizione lavorativa in discarica o azienda agricola, esposizione lavorativa in industria chimica);

• stili di vita (esposizione attiva a fumo di sigaretta, consumo di alcol (vino, birra, superalcolici e caffè);

• storia medica;

• dieta (consumo di latte, latticini, carne, pesce, crostacei, verdure, frutta, cereali, pasta);

• consumo di alimenti di produzione propria e/o locale (latte, latticini, carne, pesce, crostacei, verdure, frutta, cereali, pasta);

• polimorfismi genetici (AS3MT, GST-T e GST-M).

(22)

esposizione viene valutata l’associazione con il livello sia di Asi sia di Asi+MMA+DMA e le

differenze statisticamente significative sono valutate tramite test t di Studenti per campioni indipendenti (p<0,1).

Analisi di associazione tra fattori di esposizione e concentrazione di arsenico considerando fattori di confondimento o di modificazione di effetto - In base ai risultati

ottenuti nelle fasi precedenti si identificano diversi fattori di esposizione potenzialmente associati all’aumento di arsenico, quali consumo di pesce nei tre giorni precedenti il prelievo, area di appartenenza, sesso e polimorfismi AS3MT e GST-T1 che verranno utilizzati nelle analisi successive come fattori di aggiustamento. Per ognuno di essi viene calcolato il rapporto tra le MG di arsenico tra esposti/consumatori e MG di arsenico tra non esposti/non consumatori (RMG – Rapporto Medie Geometriche). Questa misura di associazione definita come RMG grezzo viene calcolata mediante l’esponenziale dei coefficienti angolari dei modelli di regressione lineare semplice che hanno come variabile risposta (y) la forma arsenicale analizzata e come variabile esplicativa (x) il fattore di esposizione di interesse, considerando tali fattori uno alla volta. Utilizzando poi un modello di regressione lineare multivariato si valuta l’effetto di interazione tra i polimorfismi e ciascun fattore di esposizione di interesse valutando la significatività statistica tramite il test del rapporto di verosimiglianza. Dato che le interazioni risultate statisticamente significative sono meno del 5% (163 su 3420 test), considerando anche la bassa numerosità del campione, si utilizzano quindi modelli additivi senza interazioni, in grado di valutare gli effetti delle variabili di interesse, aggiustati per la suscettibilità genetica. Si calcola quindi come prima l’RMG aggiustandolo per i fattori associati all’aumento dell’arsenico (consumo di pesce nei tre giorni precedenti il prelievo, area di appartenenza, sesso e polimorfismi AS3MT e GST-T1) ottenendo l’RMG aggiustato. Le analisi di regressione sono state svolte su tutto il campione e separatamente per area e per sesso in modo da identificare quali fattori potessero essere specifici per area e per sesso e valutare così le differenze delle vie di esposizione. I risultati sono riportati come percentuale di aumento di arsenico tra gli esposti rispetto ai non esposti: se, per esempio, la MG di arsenico tra gli esposti è 1,5 µg/L e quella tra i non esposti è 1 µg/L allora RMG=1,5 ovvero si ha un aumento del 50% di arsenico tra gli esposti rispetto ai non esposti. Per i fattori risultati statisticamente significativi, inoltre, è stata valutata anche l’entità dei RMG, l’aumento della MG tra gli esposti rispetto ai non esposti ed il

(23)

superamento dei limiti di 1,5 µg/L e di 3,86 µg/L per Asi e di 15 µg/L e 19,3 µg/L per

Asi+MMA+DMA, tra gli esposti.

Associazioni tra variabili risultate più informative dalle analisi univariate e multilineari - Lo scopo prinicipale di questa analisi è quello di valutare effetti sinergici di

fattori in studio sulla concentrazione di arsenico attraverso lo studio delle correlazioni tra le variabili di esposizione e di suscettibilità genetica. Le correlazioni sono state valutate attraverso test Chiquadro.

3.4.3 Analisi di associazione tra marcatori di danno al DNA e concentrazione di arsenico

Association analysis between markers of DNA damage and arsenic concentration

Con questa analisi si valutano le associazioni tra le varie forme arsenicali ed i marcatori di danno al DNA istone H2AX e proteina PARP-1 che hanno mostrato una distribuzione normale e pertanto non è stata necessaria una trasformazione logaritmica. Anche in questo caso, tramite un’analisi di regressione lineare è stata valutata la differenza delle MG sia di H2AX sia di PARP-1 tra i soggetti esposti ad arsenico (Asi≥3,86 µg/L; Asi+MMA+DMA≥19,3 µg/L) e quelli non esposti. Per valutare le associazioni tra l’arsenico e tali marcatori è stata effettuata anche un’analisi multilineare tenendo conto di alcune variabili del questionario che in letteratura sono riconosciute o ipotizzate essere associate a stress ossidativo. Le analisi sono state effettuate sull’intero campione, per sesso e per area e le differenze sono state testate col test t per dati indipendenti.

3.4.4 Analisi di associazione tra IMT e concentrazione di arsenico

Association analysis between IMT and arsenic concentration

Con questa analisi si valuta la variazione dell’IMT in funzione di Asi e di

Asi+MMA+DMA considerando le soglie di 3,86 µg/L e 19,3 µg/L, rispettivamente. Gli

step seguiti per queste analisi sono:

• analisi sulla relazione tra i valori di riferimento di IMT pubblicati recentemente408_{e l’invecchiamento. In particolare, sono state confrontate le rette}

(24)

per maschi e femmine) di IMT in funzione dell’età, globalmente e per ogni area rispetto ai valori di riferimento relativi ad una popolazione sana e priva di fattori di rischio;

• successivamente l’IMT comune è stato messo in relazione ai livelli delle varie forme arsenicali come As totale, Asi, Asi+MMA+DMA e agli indici di metilazione

(PMI e SMI). Nell’ipotesi di una relazione evidente solo oltre una certa soglia di esposizione, la popolazione è stata dicotomizzata secondo la mediana della somma di Asi+MMA+DMA, pari cioè a 7,68 µg/L;

• in una terza analisi sono state valutate le associazioni tra IMT e Asi (cutoff 3,86

µg/L) e Asi+MMA+DMA (cutoff 19,3 µg/L). L’IMT risulta distribuito normalmente

e pertanto non viene effettuata la trasformazione logaritmica. I risultati vengono espressi come differenza tra la media di IMT dei soggetti esposti ad As e il valor medio di IMT dei soggetti non esposti, per sesso e per area e quelle significative vengono testate con test t per dati indipendenti;

• con la regressione lineare multivariata viene valutato l’effetto di As sull’IMT aggiustato per area, per la suscettibilità genetica (AS3MT, hOGG1, XRCC1-399, GST-T1 e GST-M1) e per altri fattori riconosciuti essere fattori di rischio associati all’IMT (sesso, età, diametro della carotide). I risultati vengono espressi come differenza di IMT tra soggetti esposti ad As e IMT di soggetti non esposti aggiustati per altri fattori di rischio (differenza aggiustata). Queste stime vengono confrontate con le stime grezze ottenute dai modelli di regressione al punto 3; • con la regressione bivariata viene valutato l’effetto congiunto dell’arsenico (Asi

Asi+MMA+DMA) con la genetica utilizzando i cutoff ai punti 3 e 4 e poi della

suscettibilità genetica su IMT. In questo modo si valuta la presenza di interazioni significative tra polimorfismi ed esposizione ad arsenico. Queste analisi sono effettuate su tutto il campione, per area e per sesso; i risultati vegnono riportati in forma tabellare e grafica e le differenze significative sono testate con test t per dati indipendenti.