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3. LA RISPOSTA ALLO SHOCK TERMICO
Quasi tutte le specie di procarioti ed eucarioti esposte a temperature elevate subiscono la
produzione di una serie di proteine in quantità relativamente massiccia [1a],[2].
Queste proteine note come proteine da shock termico hanno mostrato di svolgere un ruolo
straordinariamente conservato nella omeostasi di tutte le specie [2].
L'elevazione dei livelli di HSP durante la risposta heat shock è stato dimostrato inibire
l'uccisione delle cellule stress-mediata ed esperimenti recenti indicano un ruolo altamente
versatile per queste proteine come inibitori della morte cellulare programmata [3].
Indagini approfondite conducono alla spiegazione delle funzioni molecolari di HSP come
chaperon molecolari, proteine che si rivolgono alle strutture terziarie di altre proteine,
conosciute come i loro "clienti"[4].
La risposta allo shock termico è indotta nelle cellule a seguito di diversi fattori tra cui:
l’invecchiamento, lo stress ossidativo, le specie reattive dell’ossigeno (ROS), metalli pesanti.
Di conseguenza la risposta allo shock termico (HSR) innesca un fattore di shock termico
(HSF) che produrrà proteine da shock termico (HSP) utili al mantenimento delle normali
- 12 -
3.1.
Il fattore di shock termico
HSF è regolato anche da modificazioni post-traduzionali, quali fosforilazione, acetilazione
sumoilazione [1,4] e stress cellulare che causano il dispiegamento proteico e che sarebbero,
dunque, la causa dei cambiamenti nella quantità e nella disponibilità di HSP che saranno
trasdotte in modo da alterare coordinativamente le vie di segnalazione, la localizzazione della
proteina e la stabilità e ciò interessa cambiamenti globali nella fisiologia della cellula.
In questo modo, lo stress cronico può portare ad effetti deleteri, come quelli connessi
all'invecchiamento [5].
La trascrizione del fattore HSF avvia la produzione di proteine da shock termico quando le
cellule sono esposte a danni proteici.
Le HSP sono anche chaperon molecolari che proteggono il proteoma (insieme di proteine di
un organismo o di un sistema biologico, ovvero le proteine prodotte dal genoma) dalla
denaturazione proteica (svolgimento) e promuovono la degradazione delle proteine
gravemente danneggiate. L'attivazione del HSF è associato funzionalmente ai diversi
processi fondamentali legati alla longevità e orchestra il percorso verso l’invecchiamento
attraverso l'induzione di HSP e l'antagonismo dell’aggregazione proteica.
Oltre alla mediazione di controllo della qualità delle proteine, hsp27 e hsp70 proteggono
- 13 - shock termico va calando e questo indebolimento contribuisce all'invecchiamento,
permettendo così l'insorgere di malattie da aggregazione proteica, la riduzione del vigore e
della longevità cellulare.
3.2.
Regolazione genica delle HSP attraverso HSF e FOXO
Tre vie di segnalazione (HSF. IIS e JNK) convergono sui fattori di trascrizione FOXO e
HSF per attivare l’espressione dei geni HSP.
FOXO (forkhead box)
Specie reattive dell'ossigeno (ROS) possono attivare la via di risposta JNK (chinasi JUN
N-terminale) allo stress (e di altri fattori) che, a loro volta, attivano il fattore di trascrizione
FOXO e facilitano la sua traslocazione nel nucleo.
(i nella Fig 3.1)ed i fattori di trascrizione HSF risiedono nel nucleo,
legati ad un promotore di un gene Hsp, dove attivano l'espressione delle HSP e altri geni
promuovendo così la resistenza allo stress e la longevità.
Il Fattore di crescita insulino-simile (IIS) (ii nella Fig 3.1) regola negativamente l'attività di
FOXO.
Il recettore insulino-simile (InR in Drosophila; Daf2 in e Caenorhabditis Elegans) è attivato
- 14 - L'InR avvia una cascata di trasduzione del segnale che coinvolge il substrato del recettore
dell'insulina (chiamato IRS nei mammiferi e Chico in Drosophila), PI3K (fosfatidil inositolo
3 chinasi) (chiamato AGE1 in C. Elegans) e la serina / treonina chinasi (AKT).
AKT fosforila FOXO. con il risultato che FOXO rimane sequestrato nel citoplasma.
In questo modo, il segnale attraverso IIS attiva negativamente la regolazione di FOXO e di
conseguenza l’espressione di Hsp e la durata della vita.
Anche se HSP sono abbondanti nelle cellule (iii nella Fig 3.1), sembra non essercene un
eccesso.
Riduzioni parziali di HSP tendono ad avere effetti significativi.
HSP che sono "disponibili" per l'associazione ad un “committente”, come ad esempio una
nuova proteina denaturata, dissociandosi così da altri “committenti”.
Ad esempio, la denaturazione delle proteine citosoliche causate da ROS o da calore (iv nella
Fig 3.1) rivela residui idrofobi di aminoacidi che si legano e sequestrano HSP (HSP indicato
come ovali neri nella Fig 3.1 ). Le HSP si dissociano da altri committenti, tra cui HSF.
La dissociazione delle HSP dai monomeri HSF consente al HSF di convertire la forma attiva
- 15 - L'espressione risultante dalla differenza dell’alto livello dei geni HSP produce proteine HSP
sufficienti per legarsi di nuovo e inattivare HSF (v), fornendo così un feedback negativo per
terminare la risposta.
Fig 3.1 (Regolazione genica delle HSP)
3.3.
Diminuzione della risposta allo shock termico e controllo
della qualità delle proteine nell’invecchiamento
L’elevata attività di HSF1 è strettamente collegata alla longevità in mosche e in nematodi e
- 16 - L'inibizione dell’espressione di HSF1 e la diminuzione della sua funzione diminuisce la
durata della vita mentre copie supplementari di HSF1 aumentano la durata della vita del
C.elegans [7].
HSF1 è essenziale per l’induzione della fame, della longevità indotta così come nelle risposte
allo shock termico e allo stress ossidativo [8].
La fame attiva cordinativamente Sir2 e HSF1 in C. elegans, un dato che è concorde con gli
studi recenti che indicano che nei mammiferi SIRT1 attiva HSF1 [9].
Non è noto però se la fame inneschi un secondo percorso che porta alla longevità,mentre un
calo del segnale tramite l'insulina / IGF-1 / via mTOR contribuisce all’attivazione di HSF1
nei mammiferi.
L’invecchiamento nei mammiferi comporta la degenerazione dell’espressione delle HSP con
il tempo e la perdita di resistenza agli ossidanti cellulare che è in linea con gli studi in C.
elegans e Drosophila [7].
Un indebolimento della risposta allo shock termico durante l'invecchiamento comporta una
ridotta attivazione della trascrizione genica delle piccole proteine da shock termico (SHSP:
HSP16.1, HSP16.49; HSP12.6) in C. elegans [7].
In realtà la longevità HSP-mediata comporta la protezione della funzione neuronale e la
funzionalità motoria e di antagonismo RNAi dell’ HSF1 e l’espressione accelera l'insorgenza
- 17 - Le SHSP (così come Hsp70) giocano un ruolo analogo nella regolazione della longevità in
Drosophila [10].
L'inattivazione del gene di una SHSP (HSP22) nella Drosophila diminuisce notevolmente la
durata della vita e, una diminuzione simile della vita si nota solo se i motoneuroni sono
mirati, fortemente implicati in un ruolo critico per questi tessuti negli effetti delle HSP sulla
longevità nelle mosche [11].
La relazione con la longevità di SHSP può in parte riflettere la loro capacità di opporsi alla
tossicità associata a stress ossidativo [12].
SHSP svolgono un ruolo simile negli esseri umani e dati recenti indicano un effetto
protettivo di l'hsp27 nella malattia di Huntington [13].
Sono presenti polimorfismi nelle hsp22 e hsp27 nella neuropatia [14].
Inoltre, le mutazioni di hsp27 sono osservate in pazienti con malattia Carcot-Marie-Tooth e
nella neuropatia motoria distale ereditaria [15].
- 18 - I membri della famiglia dell’HSF si trovano in tutti gli eucarioti [16].
Le cellule di mammiferi contengono almeno 3 membri della famiglia delle HSF:
HSF1, HSF2 e HSF4 [16].
I neuroni appaiono carenti nella risposta allo shock termico, pur mantenendo la capacità di
esprimere tali proteine.
Inoltre HSF1 non riesce ad essere attivato nei motoneuroni, anche quando microiniettati con
plasmidi che codificano un vettore di espressione HSF1, suggerendo un blocco alle vie di
trasduzione del segnale HSF1 in queste cellule [17].
HSF1 è represso in condizioni di non-stress, da un complesso contenente Hsp90 e altre
proteine (Fig 3.3).
(Fig 3.3 Regolazione di Hsf1 attraverso il danno proteico)
In questo stato inattivo, HSF1 è un monomero che non ha la capacità di legarsi agli elementi
- 19 - Vi è come risultato di tensione della proteina una conversione del HSF1 da monomero
inattivo a trimero che lega il DNA e il rimodellamento del complesso inibitorio chaperone
molecolare [16].
L’attivazione di HSF1 lo shock termico è un processo a multi-step, che può indurre
fosforilazione, defosforilazione, acetilazione e deacetilazione, la cui somma determina la
trascrizione di geni HSP (Fig 3.3).
L’input del segnale di ingresso extracellulare durante lo shock termico comporta la
fosforilazione della tirosina a monte di HSF1, coinvolgendo la tirosin-chinasi del recettore
HER2 e il lancio a valle attraverso cascate di segnale intracellulare Akt chinasi [18].
Akt regola HSF1 almeno in parte attraverso la modulazione della sua associazione con un
legame a ponte con la proteina fosfoserina 14-3-3 [18].
L’esclusione nucleare e la repressione di HSF1 comporta una duplice fosforilazione
attraverso le protein-chinasi ERK1 e GSK3 (quest'ultimo è un bersaglio a valle del HER2 /
AKT) e successivo reclutamento di 14-3-3 [19].
Di emergente importanza l’attivazione di HSF1per stimolare la longevità; l'attività HSF1 è
stimolata attraverso HDAC SIRT1, direttamente accoppiata al HSF1 per mantenere la via
della longevità. [20] (Fig. 3.2).
HSF1 è anche regolato dallo stress proteasomiale, la funzione di degrado del proteasoma o
gli incrementi dei substrati nel proteasoma innescando la risposta attraverso HDAC6 come
- 20 - Sebbene l'attività dell'istone deacetilasi HDAC6 è coinvolta nella attivazione, il ruolo esatto
di acetilazione e deacetilazione nella regolazione di HSF1 non è ancora completamente ben
definito.
Recentemente è emersa un’altra via di attivazione di HSF1 che coinvolge un legame con
funzione ribosomiale.
Il legarsi al fattore di “allungamento-traduzione” eEF1A porta alla trimerizzazione di HSF1 e
questo è essenziale per l'attivazione [23].
L’attivazione HSF1 durante lo shock termico si verifica solo quando eEF1A è complessato a
NON-CODING RNA-HEAT SHOCK RNA-1 (HSR1) [23].
eEF1A è un inibitore della morte apoptotica nei muscoli e nei tessuti neuronali suggerendo
un legame con l’invecchiamento [24].
Chiarire i ruoli di eEF1A nella regolazione della traduzione dell’mRNA o nell’attività di
HSF1 può consentire di valutare il potenziale ruolo di questo fattore nell’invecchiamento
HSF1-mediato
Una diminuzione del tasso di trascrizione di HSP e dell’attività di HSF1 durante
l’invecchiamento si verifica in molti tessuti [25,26] .
La mancanza di una risposta allo shock termico in tempo nei tessuti neuronali era
primariamente attribuita ad una ridotta espressione di HSF1 e alla capacità di declino delle
- 21 - Il calo dei livelli di HSF1 livelli durante l'invecchiamento potrebbe posizionare la risposta
allo shock termico al di sotto della soglia essenziale per l'attivazione.
Studi successivi hanno anche indicato un difetto di un’ulteriore regolamentazione di HSF nei
motoneuroni in coltura e Batalan dimostrando che, mentre HSF1 non è attivato in colture di
cellule neuronali anche in condizioni sovraespressione, può essere attivata una costruzione
priva di dominio di regolamentazione.[17]
Questo dominio, che è una grande regione di interazione della proteina con la doppia
fosforilazione di questa sequenza con ERK1 e GSK3, porta alla repressione di HSF1
attraverso il reclutamento di 14-3-3 e l'esclusione nucleare [19,28].
Un anomalo incremento dei livelli di GSK3 si verifica nella malattia di Alzheimer, un effetto
(associati con l'aggregazione Tau) che può portare alla repressione di HSF1 [29].
I livelli di 14-3-3 diventano elevati in aree del cervello soggette a malattie da prioni e la
comparsa di proteine 14-3-3 nel liquido cerebrospinale è caratteristica di alcune malattie
neurodegenerative.
Così i cambiamenti legati all'età e i livelli di 14-3-3 in GSK3 potrebbero essere coinvolti nel
progressivo declino della risposta da shock termico.
HSF1 è regolata anche da CHIP (chromatin immunoprecipitations )[30].
Può essere significativo il fatto che CHIP e Hsc70 cooperino con un’altra ubiquitina, la E3
ligasi, Parkin nella degradazione del recettore Pael-R e che i difetti di questo sistema medino
- 22 - Sarebbe quindi utile esaminare l’attività di CHIP in relazione all'età all’inattivazione di
Parkin nelle cellule in invecchiamento [31].
Inoltre, quando CHIP si associa con Hsp70 e Hsp90 attraverso i suoi domini TPR si può
portare a poliubiquitinilazione delle molecole chaperon in aggiunta al loro carico
polipeptidico [30].
Disregolazione delle interazioni HSP-CHIP e alterata degradazione delle HSP può quindi
essere alla base di alcuni dei cambiamenti nei livelli di HSP che accompagnano
l'invecchiamento [32].
CHIP è anche associato all’espansione della pligutammina che media l’aggregazione durante
l'invecchiamento e il sequestro di CHIP con alte concentrazioni di proteine cuscinetto può
reprimere HSF1 durante l'invecchiamento [33].
3.4.
Hsp e riavvolgimento proteico
La famiglia delle HSP comprende il HSP10, HSP27, HSP40, HSP60, HSP70, HSP90 e
HSP110 geni che codificano chaperon molecolari [34,35].
HSP10 e HSP60 sono classificate come chaperonine, proteine che polimerizzano a formare
strutture di grandi dimensioni che possono fagocitare i loro bersagli e funzionare da camere
- 23 - Le Hsp70 e Hsp90 si legano ad aperte sequenze polipeptidiche libere nel substrato
citoplasmatico, mostrando preferenza per le regioni idrofobiche [36].
Queste “accompagnatrici” formano complessi di grandi dimensioni contenenti proteine
accessorie (co-accompagnatrici o co-chaperon), che legano l’ccompagnatore primario, al fine
di mediare scelta, l'idrolisi dell'ATP e dei cicli di associazione e dissociazione da parte del
bersaglio [36].
Hsp70 e Hsp90 riconoscono e avvolgono le proteine e poi vengono rilasciati dai substrati di
tali proteine accompagnati dall’idrolisi di ATP che catalizzata i domini ATP-asi delle
accompagnatrici [36]
(Fig 3.4 Ripiegamento delle proteine danneggiate da parte di Hsp70)
Il ripiegamento proteico coinvolge anche una sottofamiglia di HSP, le hsp27, che funzionano
con un meccanismo alternativo; complessi ad alto peso molecolare comprendenti un gran
numero di tali “piccole hsp” mediano il patrimonio e l’avvolgimento in modo indipendente
- 24 - Un riavvolgimento efficiente del proteoma prevede un'attività coordinata di ciascuna di
questi tipi di chaperon.
Di fondamentale importanza per i sistemi di regolazione delle Hsp70 e Hsp90 e del controllo
della qualità proteica è la presenza di siti di legame all’estremità carbossi-terminale di ogni
molecola di proteine che contengono la ripetizione del dominio Tetratricopeptide (TPR)
[36,37 ].
Il dominio proteico TPR che può legare Hsp70 e Hsp90 incluse proteine Hop che possiedono
almeno 2 domini TPR [37].
Hop si possono legare simultaneamente sia a Hsp70 che a Hsp90 e, stabilizzando le
interazioni di queste chaperon, permettono l’attività coordinata del ripiegamento proteico.
[36].
Le molecole chaperon sono essenziali nell’invecchiamento quando le proteine danneggiate o
in fase di aggregazione tendono ad accumularsi.
Studi in E. coli mostrano che l’aggregazione durante scossa di calore coinvolge un discreto
gruppo di proteine instabili la cui aggregazione è scoraggiata dalle HSP70, DnaK in E.coli
[36].
Anche se tali studi non sono stati effettuati in cellule di mammiferi, molte chiavi di
regolazione proteica quali chinasi e fattori di trascrizione hanno conformazioni instabili che
- 25 - Ciò suggerisce fortemente che tali proteine essenziali subiscono una perdita selettiva del
controllo della qualità dei meccanismi durante l'invecchiamento.
3.5.
Associazione tra molecole chaperon e proteasi per
mediare il controllo della qualità delle proteine
Una seconda strategia per il controllo di qualità delle proteine comporta la degradazione delle
proteine danneggiate attraverso delle proteasi.
Vi è un collegamento interessante tra le chaperon e le proteasi di controllo di qualità che
coinvolge il carbossile terminale della proteina HSP70 (CHIP), che fa da ponte tra le
molecole chaperon e i sistemi di degradazione delle proteine ubiquitina-proteasoma [30].
CHIP contiene entrambe i domini, sia quello per l’ubiquitina per collegarla al substrato, che
quello per le Hsp70, Hsp90 e altre proteine di dominio TPR.
CHIP gioca un ruolo fondamentale nella longevità e l’inattivazione di CHIP nei topi porta ad
una marcata riduzione della durata della vita con un aumento di fenotipi patofisiologici legati
all’età [32].
Questi includono un aumento della senescenza cellulare ed un incidente incremento dello
stress ossidativo [16].
Il significato di CHIP nell’invecchiamento riflette il fatto che il sistema ubiquitina partecipa
- 26 - selezionate per la degradazione attraverso il proteasoma, una macchina dedicata alla
degradazione delle proteine.
CHIP mira così a denaturare le proteine legandosi a Hsp70, Hsp90 Hsc70 per degradarle
catalizzando l’ubiquitina.
Le proteine denaturate all'interno delle cellule invecchiate possono subire almeno quattro
destini diversi, basati sulle interazioni contrastanti tra le proteine danneggiate, le molecole
chaperon e CHIP (Fig 3.5).
Aggregati possono continuare a formarsi progressivamente all’interno delle cellule
invecchiate, come nella via (1) di (Fig 3.5), che porta alla formazione di inclusioni
intracellulari, compromissione della funzione, e la morte [39,40].
Tuttavia, le proteine danneggiate possono entrare nella via (2) di (Fig 3.5) dopo il
rilevamento della proteina denaturata costruendo domini fra Hsp70 (e Hsp90), per essere
inseriti all'interno del complesso proteina-chaperone e di essere ripiegata.
Tali proteine danneggiate possono anche essere trasformate attraverso un’alternativa via (3)
di (Fig 3.5) quando il sito accettore TPR delle Hsp70 è legato a chip anzichè alle Hsp
co-chaperon; in questo caso, la proteina substrato è vicina al dominio della “U-box” di CHIP,
diventando poliubiquinata e mira al proteasoma per una rapida degradazione [35].
Competendo con co-chaperon come la co-Hop per il sito accettore TPR sul Hsp70 e Hsp90,
CHIP inibisce la via di ripiegamento, mentre altre proteine con dominio TPR possono a loro
- 27 - Ci sono anche ulteriori livelli di regolazione delle vie in (Fig3.5) mediata attraverso
aggiuntive co-chaperon che si legano a Hs70 compresi Bag1-1, Bag-2 e HSPBP1 [32].
Queste proteine sono candidate per la mediazione del triage tra le vie di competizione del
ripiegamento proteico, la degradazione e fornire ulteriori strati di regolazione che possono
divenire sregolate durante l'invecchiamento.
(Fig 3.5 controllo di qualità, salvataggio e recupero delle proteine danneggiate)
3.6.
Autofagia chaperon-mediata
Le proteine possono disaggregarsi durante l’autofagia, un percorso di auto digestione
cellulare che si osserva nella “fame”.
Due delle sue maggiori forme varianti, MACROAUTOFAGIA e AUTOFAGIA
CHAPERON-MEDIATA, subiscono un declino età-dipendente.
Durante l’autofagia chaperon-mediata (CMA), Hsp70 reclutano le proteine citoplasmatiche
- 28 - CMA è stimolata sia dalla “fame” che dallo stress ossidativo ed è responsabile dellea
degradazione del 30% delle proteine intracellulari che contengono l’elemento di
riconoscimento KFERQ CMA [41].
CMA assomiglia alla degradazione proteasomiale CHIP-mediata nella quale le proteine
danneggiate formano complessi contenenti Hsc70, Hsp40,Hop, Hsp90 e Bag-1 che
presumibilmente mediano il riconoscimento CMA-substrato e lo svolgimento preventivo
all’inserimento lisosomiale.
I substrati per i CMA sono consegnati al recettore di membrana LAMP2A lisosomiale, sono
inseriti nel lume lisosomiale e quindi accolti nel lume da una popolazione di molecole Hsc70
intralisosomiali.
Sia i livelli di LAMP2A che Hsc70 sono modulati durante la “fame”e lo stress ossidativo e i
livelli di LAMP2A in particolare subiscono un calo durante la senescenza.
La diminuzione della CMA è coinvolta nella malattia del Parkinson e questa potrebbe essere
legata alla degradazione della α-sinucleina.
3.7.
Aggresomi, istone deacetilasi ed invecchiamento
Quando la capacità delle cellule di ripiegare o degradare le proteine mal ripiegate si satura,
- 29 - In questo caso, microaggregati formatisi nel citoplasma sono attivamente trasportati lungo i
microtubuli al centrosoma e si accumulano in strutture chiamate aggresomi.[42]
Gli aggresomi in genere possono essere eliminati mediante percorsi di macro-autofagia o
durante la divisione cellulare asimmetrica, in cui, una singola cellula figlia eredita gli
aggresomi ed è presumibilmente sacrificata per mantenere in vita le altre cellule figlie.
Questo percorso sembra essere regolato, nelle cellule dei mammiferi, dalla ISTONE
DEACETLASI 6 (HDAC6), un enzima in rado di legarsi sia a proteine poliubiquitinate che
ai microtubuli[21].
HDAC6 si lega a Hsp90 e può regolare le sue funzioni di chaperon attraverso la
deacetilazione dell’istone [22].
HDAC6 è anche associato al metabolismo dell’HSF1 ed è necessario per l’attivazione di
quest’ultimo durante l’inibizione dell’attività del proteasoma.
HDAC6 legandosi all’ubiquitina sembra innescare il distaccamento del Hsp90 da HSF1 e la
sua attivazione.
Così HDAC6, oltre al ruolo nella formazione dell’aggresoma partecipa anche alla sintesi
delle molecole chaperon.
Un legame tra l’istone deacetilasi, l’aggresoma e l’invecchiamento è indicato dai risultati nei
lieviti, che dimostrano, che la divisione cellulare asimmetrica richiede SIR2 e diminuisce con
- 30 - L’attività dell’istone deacetilasi HDAC6 e SIR2 può così essere associata al controllo di
