Capitolo II. Materiali e Metodi.

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Capitolo II. Materiali e Metodi.

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Obiettivi dello studio.

1. Valutare l’efficacia del trattamento con azacitidina in un gruppo di 47 pazienti affetti da Sindrome Mielodisplastica o Leucemia acuta Mieloblastica oligoblastica che hanno intrapreso il trattamento tra il Settembre 2005 ed il Novembre 2011 presso la U.O. di Ematologia dell’Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana attraverso le percentuali di risposta (remissione completa o CR, risposta parziale o PR, hematological improvement o HI, che tutti insieme configurano la risposta complessiva o ORR), i dati di sopravvivenza (overall survival o OS) e di prognosi (progression free survival/leukemia free survival o PFS/LFS). Tali variabili sono state correlate con le caratteristiche demografiche e cliniche all’esordio, inclusi i sistemi di classificazione del rischio IPSS e WPSS; infine, sono stati raccolti anche i dati di tossicità per un ulteriore chiarimento del rapporto costo/beneficio del trattamento in questione.

2. In un sottogruppo di 27 pazienti valutare l’impatto prognostico dei livelli di espressione del gene WT1 in corso di tale trattamento demetilante in relazione alle caratteristiche demografiche, ai tassi di risposta al trattamento e di sopravvivenza ed alle caratteristiche prognostiche IPSS e WPSS.

3. In un sottogruppo di 31 pazienti valutare l’impatto prognostico dei livelli di espressione del gene RPS14 su campioni midollari prelevati al momento della diagnosi o la momento dell’inizio del trattamento con Azacitidina, cercando di individuare eventuali correlazioni con caratteristiche demografiche, prognostiche, tassi di risposta al trattamento e sopravvivenza.

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Pazienti e metodi

Pazienti.

Sono stati valutati 47 soggetti con diagnosi di Sindrome Mielodisplastica o Leucemia acuta Mieloblastica (con percentuale di blasti midollari compresa tra il 20 e 30%), secondo la classificazione WHO 2008. Tali diagnosi sono state effettuate presso il nostro centro tra il Dicembre 2004 ed il Novembre 2011; dopo un periodo variabile di osservazione e terapia di supporto con fattori di crescita o agenti differenzianti, (mediana 3 mesi, range 0-42 mesi), tali pazienti hanno ricevuto terapia con 5-azacitidina tra il Settembre 2005 ed il Novembre 2011. I dati sono stati raccolti fino ad Aprile 2012.

Il totale dei pazienti era composto da 13 femmine e 34 maschi; 38 soggetti (12 femmine e 26 maschi) erano affetti da mielodisplasie con diversa sotto-classifcazione WHO e 9 pazienti (1 femmina e 8 maschi) erano affetti da Leucemia Mieloblastica acuta oligoblastica. L’età mediana all’inizio del trattamento era 68 anni (range 18-87 anni).

Metodi.

• Caratterizzazione morfologica.

Tutti i pazienti sono stati sottoposti a valutazione morfologica midollare all’inizio del trattamento onde poter individuarne la categoria di rischio secondo i criteri della classificazione WHO 2008.

• Caratterizzazione molecolare.

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dell’inizio del trattamento abbiamo selezionato una sottopopolazione di 27 pazienti (11 femmine, 16 maschi) per determinazione dei livelli di espressione del gene WT1 con metodica di RT-PCR quantitativa e successivamente effettuato un monitoraggio longitudinale nel tempo in corso di terapia (8, 12, 16, 24 settimane). Abbiamo inoltre eseguito una determinazione con metodica RT-PCR quantitativa dei livelli di espressione del gene RPS14 in 31 pazienti scelti sulla base della disponibilità di sangue midollare al momento della diagnosi o immediatamente prima dell’inizio del trattamento con 5-Azacitidina.

Per gli studi di espressione genica l'RNA totale è stato estratto da 10-15 ml di sangue periferico o aspirato midollare (conservato con anticoagulante EDTA), da cui sono state isolate cellule linfo/mononucleate mediante centrifugazione in gradiente di densità (Lymphoprep). L’RNA risospeso è stato quantificato allo spettrofotometro. 1µg di mRNA è stato retrotrascritto (RT-PCR) in DNA complementare (cDNA) in un volume finale di reazione di 20 µg, contenente M-MLV Reverse Trascriptase, Buffer, dNTPs, random primers, RNasi RiboLock Ribonuclease Inhibitor, DTT, secondo il seguente protocollo termico:

- 37°C per 10 minuti,

- 42°C per 45 minuti,

- 70°C per 10 minuti.

Il cDNA così ottenuto è stato quindi sottoposto a PCR quantitativa. Per quanto riguarda il il gene WT1 la metodica impiegata è stata quella TaqMan Assay, mentre nel caso dell’RPS14 abbiamo utilizzato il Sybr Green.

Il “TaqMan” Assay

Il sistema TaqMan sfrutta una sonda oligonucleotidica complementare ad una porzione interna della sequenza bersaglio delimitata dai due primers, che presenta l'estremità 3'-idrossi terminale bloccata in modo da impedirle di agire come un primer per l'amplificazione. E' provvista, inoltre, di un fluoroforo (reporter)

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all'estremità 5', solitamente il 6-FAM (6-carbossifluoresceina) e di un quencer al 3', il 6-carbossi-tetrametilrodamina (TAMRA) [Heid et al,1996]. Quando le sonde sono intatte i fluorofori eccitati dalla luce alla giusta lunghezza d'onda trasferiscono la loro energia al quencer, anzichè emettere fluorescenza.

Figura 1: Rappresentazione schematica del funzionamento delle sonde TaqMan. In rosso: il querce; Taq: DNA polimerasi; in verde: il reporter.

Durante la fase di estensione la sonda ibridizzata viene rimossa dal filamento neoformato e degradata in singoli nucleotidi per attività 5'-esonucleasica della Taq polimerasi. La degradazione della sonda libera il reporter, il quale, essendo lontano dal quencer, sarà in grado di emettere la propria fluorescenza caratteristica che verrà rivelata dal detector (Holland et al., 1991). La fluorescenza del reporter aumenta in modo lineare man mano che i prodotti si accumulano ad ogni successivo ciclo di amplificazione. La fase in cui la fluorescenza risulta apprezzabile al di sopra del background viene chiamata ciclo soglia (Ct). Il valore del Ct è relativo al numero di

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sequenze di acido nucleico target presenti all'inizio della reazione.

La performance di una Real-Time PCR è di solito caratterizzata dalla sensibilità: l'utilizzo di sostanze fluorescenti e di apparecchiature consentono di arrivare a 10-5. Altro aspetto positivo della Real-Time PCR è rappresentato dalla mancata necessità di una analisi post PCR che permette innanzitutto la riduzione dei tempi necessari per l'esecuzione del test molecolare ed, in secondo luogo, la riduzione anche del rischio di contaminazione, dovuto

soprattutto alla formazione di aerosol durante l'apertura delle provette ed alla volatilità dei prodotti di PCR. Inoltre la Real–Time PCR fornisce un'ulteriore specificità eliminando la possibilità che siano rivelati prodotti amplificati aspecifici dovuti al missappaiamento con i primer o ai dimeri primer-primer grazie al complesso della Taq-polimerasi con uno specifico anticorpo monoclonale che inibisce l'attività polimerasica durante l'assemblaggio della reazione e lo step iniziale di denaturazione (sistema "hot start"), senza alterare l'enzima.

La determinazione quantitativa del gene WT1 è stato impiegato il kit di reazione “WT1 ProfileQuant-KIT” (Ipsogen). Esso contiene specifici plasmidi, primers e probes per i geni WT1 e ABL, che funziona da gene housekeeping. Il numero di trascritti ottenuti sono stati normalizzati rispetto al numero di copie del gene di riferimento

ABL, la cui espressione è stata vista essere particolarmente stabile e costante in tutti i tipi di cellule, sia nel BM che nel PB. I livelli di WT1 sono perciò stati espressi come numero di copie ogni 104 copie di

ABL, considerando come range di normalità per il sangue midollare l intervallo 3-180 copie di WT1/104 copie di ABL. Tale range è stato stabilito basandosi sulle più importanti evidenze in letteratura.

La quantificazione in Real-Time PCR per il trascritto del gene RPS14 è stata condotta tramite utilizzo di Sybr Green Mastermix (Biorad) ed il kit Primer design (Eppendorf) che fornisce i primers, le sonde ed i plasmidi necessari alla realizzazione della standard curve , opportuni per il test. Il controllo interno al saggio è rappresentato dal gene 18S.

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Come campioni di riferimento sono stati utilizzati 4 casi affetti da sindrome 5q- e 4 donatori sani. Per l'analisi statistica, i valori di RPS14 sono stati distinti in “a bassa” e ad “alta” espressione sulla base dei valori medi misurati nei donatori sani (1,073).

• Caratterizzazione citogenetica

In tutti i pazienti al momento della diagnosi è stata eseguita valutazione del profilo citogenetico midollare mediante analisi standard del cariotipo. In caso di metafasi insufficienti, un pannello FISH è stato effettuato per esclusione delle forme a citogenetica sfavorevole o a conferma di anomalie genetiche a basso rischio.

• Criteri per la definizione della risposta.

Si è fatto riferimento a dati della letteratura universalmente accettati e codificati dall’International Working Group (IWG) (Cheson, 2000; Cheson,2006)

• Criteri per la definizione della tossicità e degli eventi avversi.

Si è fatto riferimento a dati della letteratura universalmente accettati e tabulati nei Common Toxicity Criteria (CTC, 1999)

• Analisi statistica.

Le variabili continue sono state comparate con il tasso di risposta, di decessi e di progressione a leucemia acuta mediante test di regressione logistica. Le variabili dicotomiche sono state analizzate mediante test di Fisher. L’analisi univariata per la stima della sopravvivenza e della PFS/LFS è stata effettuata con la metodica dei ranghi (log rank). Per le analisi statistiche è stato utilizzato il software SPSS, versione 17.0.

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Capitolo III. Risultati.

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Risultati.

Caratteristiche demografiche/cliniche dei 47 pazienti arruolati nello studio.

Le caratteristiche demografiche e cliniche di tutti i pazienti in esame sono dettagliate nella Tabella 9.

Tab.9. Caratteristiche della popolazione generale

Caratteristiche

N°

%

IPSS risk score Low Intermediate 1 Intermediate 2 High 3 14 20 10 6 30 42 22 WPSS risk score Very low Low Intermediate High Very high 0 4 6 31 6 0 8 13 66 13 Classificazione WHO RA RARS RCMD RCMD-RS RAEB1 RAEB2 5q-Syndrome AML oligoblastiche 1 2 5 0 9 20 1 9 2 4 12 0 19 42 2 19

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L’infiltrazione blastica midollare mediana all’inizio del trattamento era del 9% (range 4%-30%); 10 soggetti (21,3%) presentavano infiltrazione blastica inferiore al 5%, 9 pazienti (19,2%) infiltrazione blastica compresa tra il 5% ed il 9%, 20 pazienti (42,5%) infiltrazione blastica compresa tra il 10% ed il 19% e 8 pazienti (17%) infiltrazione blastica tra il 20% ed il 30%.

Dei 47 pazienti in esame, 32 presentavano classe di rischio citogenetico favorevole (68,1%): in 10 casi le metafasi analizzate sono state insufficienti per un’analisi citogenetica esaustiva, per cui sono stati eseguiti test di FISH onde escludere la presenza di anomalie ad alto rischio. In 2 casi veniva riscontrato riarrangiamento del gene PDGFR-Beta (8,5% dei nuclei); altri 2 pazienti a citogenetica favorevole presentavano una isolata anomalia del cromosoma 5 (del5q alla citogenetica convenzionale); 11 pazienti (23,4%) presentavano classe di rischio citogenetico intermedio: le anomalie citogenetiche riscontrate erano in tre casi trisomie del cromosoma 8 isolate (+8); le altre anomalie erano presenti ciascuna in un singolo paziente (del20q in associazione con +8, del 5q in associazione con + 8, t(3; 12) in associazione con +8, del13 in associazione con +8; t(12:X); del6; (+3); del5q in associazione con del20p; t(1:14)); 4 pazienti (8,5%) presentavano classe di rischio citogenetico sfavorevole per la presenza in due casi di del7 e di due cariotipi con più di tre anomalie citogenetiche associate (cariotipo complesso).

All’inizio del trattamento 22/47 pazienti (46,8%) presentavano regolare necessità trasfusionale (è stata valutata la trasfusione dipendenza per le emazie concentrate, non essendo indicata nelle categorie WPSS il valore prognostico della trasfusione dipendenza per la componente piastrinica).

Sulla base delle caratteristiche sopra elencate è stata valutata la categoria di rischio prognostico secondo lo scoring IPSS (International Prognostic Score System) e lo score prognostico dinamico WPSS (WHO-based Prognostic Score System); quest’ultimo è stato poi ricalcolato al momento della rivalutazione di malattia i corso di terapia sulla base delle modifiche delle caratteristiche cliniche.

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Dei 47 pazienti, 3 (6,4%) presentavano IPSS low, 14 (29,8%) IPSS intermedio-1, 20 (42,5%) IPSS intermedio-2 e 10 (21,3%) IPSS high. Per l’effettuazione dell’analisi statistica abbiamo successivamente raggruppato le sottocategorie IPSS in 2 macrocategorie, comprendenti la prima pazienti con IPSS low+intermedio-1 (17 pazienti=36,2%) e la seconda includente pazienti con IPSS intermedio-2+high (30 pazienti=63,8%).

Per le categorie prognostiche WPSS dei 47 pazienti nessun paziente presentava score very low, 4 (8,5%) presentavano WPSS low, 6 (12,8%) WPSS intermedio, 31 (65,9%) WPSS high e 6 (12,8%) WPSS very-high. Anche in questo caso, per l’effettuazione dell’analisi statistica, abbiamo raggruppato le sottocategorie WPSS in 2 macrocategorie: 1)WPSS very low+low-+intermedio (10 casi=21,3%) e 2)WPSS high+very high (37 pazienti pari a 78,7%).

Caratteristiche demografiche e cliniche dei 27 pazienti testati per espressione del gene WT1.

Sulla base della disponibilità di campioni di sangue midollare prelevati e congelati al momento dell’inizio del trattamento, abbiamo selezionato una sottopopolazione di 27 pazienti (11 femmine, 16 maschi) per la determinazione dei livelli di espressione del gene WT1 con metodica di RT-PCR quantitativa, sia al momento dell’inizio del trattamento che nel corso dello stesso. In questa sottopopolazione, l’età mediana all’inizio del trattamento era di 71 anni (range 18-87 anni). Le diagnosi poste secondo i criteri WHO all’inizio del trattamento raggruppavano i pazienti come segue: RARS=1 (3,7%), CRMD=4 (14,8%), RAEB1=7 (25,9%), RAEB2 = 11 (40,8%), AML oligoblastiche=4 (14,7%).

In questo sottogruppo di pazienti, l’infiltrazione blastica midollare mediana all’inizio del trattamento era del 10% (range 4%-30%): 7 soggetti (25,9%) presentavano infiltrazione blastica inferiore al 5%, 6 pazienti (22,2%) presentavano infiltrazione

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blastica compresa tra il 5% ed il 9%, 11 pazienti (40,8%) presentavano infiltrazione blastica compresa tra il 10% ed il 19% e 3 pazienti (11,1%) presentavano infiltrazione blastica tra il 20% ed il 30% .

In tutti i 27 pazienti al momento della diagnosi era stata eseguita valutazione del profilo citogenetico: 20/27 (74,1%) presentavano classe di rischio citogenetico favorevole (in nove casi le metafasi analizzate erano insufficienti ma la FISH ha escluso anomalie ad alto ed intermedio rischio con evidenza di un caso con riarrangiamento del gene PDGFR-Beta nell’8,5% dei nuclei); 5 pazienti (18,5%) presentavano classe di rischio citogenetico intermedio e 2 pazienti (7,4%) presentavano classe di rischio citogenetico sfavorevole.

Tab.10. Caratteristiche cliniche popolazione in studio per WT1

Caratteristiche pazienti

(gruppo WT1)

N°

%

IPSS risk score Low/Intermediate 1 Intermediate 2/High 12 15 44,5 55,5 WPSS risk score Very low/Low/Int High/Very high 10 17 38,8 62,8 Classificazione WHO RARS RCMD RCMD-RS RAEB1 RAEB2 5q-Syndrome AML oligoblastiche 1 4 0 7 11 0 4 3,7 14,7 0 25,9 40,8 0 14,7

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Dei 27 pazienti presentavano 12 (44,4%) presentavano regolare necessità trasfusionale per emazie concentrate.

In riferimento all’IPSS 2/27 presentavano IPSS low (7,5%), 10/27 presentavano IPSS int-1 (37%), int-10/27 presentavano IPSS int-2 (37%) e 5/27 presentavano IPSS high (int-18,5%). Per le categorie prognostiche WPSS dei 27 pazienti nessun paziente presentava score very low, 6/27 presentavano WPSS low (22,2%), 4/27 presentavano WPSS int (16,6%), 14/27 presentavano WPSS high (51,8%), 3/27 presentavano WPSS very-high (11%).

Caratteristiche demografiche e cliniche dei 31 pazienti testati per espressione del gene RPS14.

In questo sottogruppo sono stati inclusi 31 pazienti, sempre sulla base della disponibilità di materiale biologico congelato. Dei 31 pazienti, 10 erano femmine, 21 maschi. L’età mediana era 70 anni (range 18-87 anni) e risultavano così suddivisi: RARS=1 (3,2%), CRMD=5 (16,2%), RAEB1=7 (22,5%), RAEB2=15 (48,4%), AML oligoblastiche= 3 (9,7%). L’infiltrazione blastica midollare mediana all’inizio del trattamento era del 10% (range 4%-30%): 8 soggetti (25,8%) presentavano infiltrazione blastica inferiore al 5%, 6 pazienti (19,4%) presentavano infiltrazione blastica compresa tra 5% e 9%, 15 pazienti (48,4%) presentavano infiltrazione blastica compresa tra il 10% ed il 19% e 2 pazienti (6,4%) presentavano infiltrazione blastica tra il 20% ed il 30% .

Per quanto concerne il rischio citogenetico, 22 (71%) presentavano cariotipo favorevole, 6 (19,3%) un cariotipo intermedio e 3 (9,7%) un cariotipo complesso o sfavorevole. Due pazienti risultavano positivi per riarrangiamento PDGFR beta (entrambi nell’8% delle metafasi analizzate).

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(emazie concentrate) all’inizio del trattamento.

Le caratteristiche della sottopopolazione vengono riassunte nella Tabella 11.

Tab.11. Caratteristiche cliniche popolazione in studio per RPS14

Caratteristiche

pazienti

(gruppo RPS14)

N°

%

IPSS risk score Low/Intermediate 1 Intermediate 2/High 12 19 38,7% 61,3 WPSS risk score Very low/Low/Int High/Very high 7 24 22,6% 77,4% Classificazione WHO RARS RCMD RAEB1 RAEB2 5q-Syndrome AML oligoblastiche 1 5 7 15 0 3 3,2 12,6 22,5 48,4 0 9,7

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Modalità di trattamento.

Il trattamento con Azacitidina è stato effettuato alla posologia di 75mg/mq per 7 giorni, ogni 28 giorni. Il numero mediano di cicli effettuati è stato pari a 6 (range 1-34), e la valutazione della risposta è stata effettuata a 8, 12, 16 e 24 settimane dall’inizio del trattamento, ovvero dopo 2, 3, 4, 6 cicli di terapia che è stata continuata fino a progressione o sospensione per tossicità.

Durante il trattamento i pazienti venivano monitorati mediante esecuzione di emocromo, test di funzionalità renale ed epatica e, in caso di neutropenia o valori di emoglobina inferiori a 11g/dL, supportati con fattori di crescita (G-CSF, eritropoietina). Pazienti con valori di piastrine inferiori a 20000/uL e/o di emoglobina inferiori a 8 g/dL ricevevano altresì supporto trasfusionale.

Efficacia – valutazione della risposta al trattamento secondo i criteri IWG.

Dopo 8 settimane dall’inizio del trattamento, ovvero dopo soli 2 cicli, 18 dei 47 pazienti arruolati nello studio avevano acquisito una risposta (ORR=38,3%): si osservavano 3 CR (6,4%), 5 PR (10,6%), 10 HI (21,3%). Nei pazienti non responsivi si osservavano 24 casi (51,1%) di malattia stabile (SD) e 5 (10,6%) di progressione (PD). Non si sono osservati decessi nelle prime 8 settimane di osservazione.

Dopo 12 settimane dall’inizio del trattamento, l’ORR aumentava raggiungendo il 46,8% (22/47), con 14,9% di CR, 14,9% di PR e 17% di HI. Non si sono osservati decessi nelle prime 12 settimane di osservazione.

Dopo 16 settimane dall’inizio del trattamento, l’ORR era pari al 48,9%, con 21.2% di CR, 14.9% di PR e 12.8% di HI. A questo time point si è registrato un decesso per progressione di malattia.

Dopo 24 settimane dall’inizio del trattamento l’ORR ammontava al 57,4%, con 29.7% di CR, 12.8% di PR e 14.9% di HI. In questo periodo 10 pazienti progredivano e 3 di

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questi morivano come conseguenza di tale evoluzione di malattia.

Efficacia – valutazione della sopravvivenza.

Come mostrato nella Figura 2, con un follow-up mediano di 40 mesi (range 1-59 mesi), l’OS a 2 anni risultava pari al 67%.

Figura 2. OS dell'intera serie.

Lo studio statistico in analisi univariata non ha mostrato alcuna correlazione significativa con la risposta valutata a 8, 12 e 16 settimane, mentre una correlazione statisticamente significativa è stata osservata con l’ottenimento della risposta (incluso l’hematological improvement) a 24 settimane (p<0,01), con 85% di pazienti responsivi vivi a 2 anni verso il 22% di quelli non responsivi (Figura 3)

72 Figura 3. OS & ORR a 24 settimane

Confrontando le caratteristiche demografiche e cliniche dei pazienti al momento dell’inizio del trattamento con l’OS a 2 anni non è emersa alcuna correlazione statisticamente significativa tra OS ed età (inferiore o uguale/maggiore a 65 anni), sesso, cariotipo e numero di blasti.

Al contrario, l’OS veniva significativamente e negativamente influenzata dal fabbisogno trasfusionale a 8, 12, 16 e 24 settimane (p<0.01), come di seguito riportato nella Tabella 12 e nella Figura 4.

73 Tabella 12. OS e trasfusione dipendenza (RBC-TD) o indipendenza (Non RBC-TD)

2Y-OS

8 week

12 week

16 week

24 week

RBC-TD 42% 42% 42% 43%

Non RBC-TD 92% 92% 92% 90%

Figura 4. OS & trasfusione-dipendenza a 24 settimane

Non si è invece osservata alcuna correlazione statisticamente significativa dell’OS a 2 anni con le due macrocategorie IPSS individuate all’inizio del trattamento né con le macrocategorie WPSS calcolate al momento dell’inizio del trattamento (WPSS-t0) e

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successivamente a 8, 12 16 e 24 settimane dall’inizio del trattamento.

Efficacia – valutazione della sopravvivenza libera da progressione.

Con un follow-up mediano di 40 mesi (range 1-59 mesi), la PFS mediana risultava di 19 mesi, con una PFS a 2 anni pari al 39%.

Figura 5. PFS dell'intera serie

Come mostrato in Tabella 13, lo studio statistico in analisi univariata ha mostrato una correlazione significativa con i tassi di risposta a 8, 12, 16 e 24 settimane dall’inizio del trattamento e la PFS (p<0.01).

75 Tabella 13. PRS e risposta al trattamento.

2y-PFS

8 week

12 week

16 week

24 week

ORR 56% 54% 54% 50%

SD+PD 21% 10% 20% 22%

Confrontando le caratteristiche basali dei pazienti al momento dell’inizio del trattamento con la PFS a 2 anni non è emersa alcuna correlazione statisticamente significativa tra PFS e fascia d’età (inferiore a 65 anni o meno), sesso del paziente e numero di blasti al momento della trattamento, classe di rischio citogenetico.

Non si è invece osservata alcuna correlazione statisticamente significativa della PFS a 2 anni con le due macrocategorie IPSS e WPSS definite all’inizio del trattamento. Dati positivi di correlazione sono emersi invece dal confronto tra PFS 2 anni e le due macro categorie WPSS ricalcolate a 8, 16 e 24 settimane (p<0.02) (vedi Figura 6 e Tabella 14).

Figura 6. PFS & WPSS a 24 settimane.

76 Tab.14. PFS e macrocategorie WPSS.

2Y-PFS

8 week

16 week

24 week

WPSS VL+L+INT 59% 56% 67%

WPSS H+VH 25% 32% 24%

Come per l’OS a 2 anni, anche per la PFS a 2 anni dati positivi di correlazione sono emersi invece dal confronto con i dati di trasfusione-dipendenza al momento della diagnosi (p<0.03) (17 mesi nei trasfusione dipendenti vs 51 mesi nei pazienti non trasfusione dipendenti) (Figura 7, Tabella 15).

77 Tabella 15. PFR e trasfusione dipendenza (RBC-TD) o indipendenza (Non RBC-TD)

2Y-PFS

8 week

12 week

16 week

24 week

RBC-TD 54% 55% 57% 58%

Non RBC-TD

23% 22% 21% 20%

Monitoraggio dell’espressione del gene WT1.

Non si è osservata alcuna correlazione statisticamente significativa tra i livelli di espressione di WT1 alla diagnosi (WT1 t0) e fascia d’età, sesso, blasti percentuali all’inizio del trattamento, cariotipo, trasfusione dipendenza, punteggio prognostico IPSS e WPSS (al sia all’inizio del trattamento che dopo 8, 12, 16 o 24 settimane). Complessivamente l’ORR dopo 8, 16 e 24 settimane non è stata statisticamente influenzata dai livelli di espressione di WT1 t0 in analisi univariata, mentre dopo 12 settimane dall’inizio del trattamento si è notata una differenza significativa (p=0.007): dei pazienti responsivi (12/27) solo 4 (33%) presentavano al t0 WT1 elevato, contro 13/15 (87%) nel gruppo dei pazienti non responsivi.

A 16 settimane dal’inizio del trattamento 7 pazienti presentavano incremento dei livelli di espressione di WT1, mentre 13 mostravano stabili o ridotti livelli di espressione di WT1. Non si è osservata alcuna correlazione statisticamente significativa la variazione dei livelli di espressione WT1 a 16 settimane e fascia d’età,

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sesso, blasti percentuali all’inizio del trattamento, cariotipo, trasfusione dipendenza, mentre una correlazione significativa si è notata la variazione dei livelli di espressione di WT1 a 16 settimane ed il punteggio prognostico IPSS e WPSS.

Infatti, il 100% dei pazienti che a 16 settimane mostrava incremento di WT1 rientrava nella categoria WPSS high+very high o IPSS high contro il solo 46% di quelli che avevano livelli di WT1 stabili o ridotti.

In analisi uni variata, l’OS non è stata significativamente influenzata dai valori di WT1 misurati all’inizio o in corso di trattamento.

Anche la PFS non è stata significativamente influenzata dai valori di WT1 all’inizio della terapia con azacitidina, mentre lo è stata dall’incremento dei livelli di espressione misurati alla sedicesima settimana (p=0.03) (Figura 8). Infatti, risultavano liberi da progressione a 2 anni il 21%dei pazienti con incremento dei livelli di espressione di WT1 rispetto al 56% dei pazienti con stabilità o riduzione degli stessi.

Figura 8. PFS & incremento dei livelli di espressione di WT1 misurati alla sedicesima settimana.

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Monitoraggio dell’espressione del gene RPS14.

Confrontando le caratteristiche basali dei pazienti al momento dell’inizio del trattamento con i livelli di espressione di RPS14 non è emersa alcuna correlazione statisticamente significativa tra questi e fascia d’età (inferiore a 65 anni o meno), sesso del paziente e numero di blasti al momento della trattamento, trasfusione dipendenza, IPSS e WPSS.

In analisi univariata, si osservava un trend ad una più breve sopravvivenza per i pazienti che prima del trattamento con azacitidina mostravano bassa espressione di

RPS14 (OS a 2 anni era pari al 51% per i casi con bassa espressione RPS14 verso il 100% per i casi con alti livelli (p = 0,08) (Figura 9)

Figura 9. OS e livelli di espressione di RPS14 misurati prima del trattamento.

80

livelli di espressione di RPS14: infatti, per i pazienti con bassi livelli di RPS14 la PFS a 2 anni risultava del 39% contro il 100% dei pazienti con RPS14 ad alta espressione (p = 0,018) (Figura 10)

Figura 10. PFS e espressione di RPS14

FS &

Tossicità del trattamento.

Nel complesso, il trattamento con 5-Azacitidina è stato ben tollerato. La tossicità ematologica è stata la più rappresentata benché in associazione con il trattamento con 5-Azacitidina sia stato impostato supporto con fattori di crescita (Eritropoietina e G-CSF). Neutropenia di grado 1-2 e di grado 3-4 si sono verificate rispettivamente nel 34% (16/47) e nel 55,4% (26/47), mentre il 10,6% di pazienti non ha presentato neutropenia. Anemia di grado 1-2 e di grado 3-4 si è verificata rispettivamente nel 48.9% (23/47) e 38,3% (18/47). Piastrinopenia di grado 1-2 e di grado 3-4 si è verificate rispettivamente nel 46,8% (22/47) nel 36,2% (17/47). Eventi emorragici (grado 3-4) si sono verificati in 2/47 soggetti (4,3%), (melena e ematoma intra-epatico). Eventi

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trombotici di grado 1-2 (trombosi venose superficiali dell’arto inferiore) e grado 3-4 (trombosi venosa profonda massiva) si sono verificati rispettivamente in 2/47 (4,3%) e 1/47 (2,1%) pazienti. Le tossicità ematologiche riscontrate sono riassunte nella Tabella 16.

Tab. 16. Tossicità ematologica in corso di trattamento.

Tossicità

ematologica

Grado 1-2

Grado 3-4

Le tossicità extra ematologica più rappresentata è stata la presenza di nausea di grado 1-2 in 7/47 (14,9%) dei casi e di reazione cutanea nel sito di somministrazione del farmaco di grado 1-2 in 4 casi (8,5%) e di grado 3-4 in un caso; in tale paziente si è resa comunque necessaria una sospensione del trattamento.

Le tossicità d’organo sono risultate di scarsa rilevanza. Solo un paziente ha presentato intolleranza al trattamento per epigastralgia di grado 4, con sospensione per tale motivazione. La maggioranza dei pazienti non ha presentato tossicità epatica (95,7%) né renale (93,6%). Solo 2/47 (4,3%) hanno presentato modesto rialzo delle transaminasi (grado 1-2), ma senza necessità di sospensione del trattamento. Solo 2/47 (4,3%) hanno presentato modesto incremento della creatinina (grado 1-2), con insufficienza renale di grado 3-4 in 1 paziente.

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Non si è verificata tossicità cardiaca nel 95,7% dei casi; 2 pazienti hanno invece presentato eventi cardiaci di grado 3-4 in corso di terapia (scompenso cardiaco, flutter atriale).

La sintomatologia sistemica maggiormente lamentata è stata la fatigue di grado 1-2 (8,5%) e di grado 3-4 (4,3%) .

Non si è verificata tossicità neurologica ad eccezione di un caso di ischemia cerebrale con decesso del paziente.

In 3 pazienti, in corso del follow-up, è stata riscontrata una seconda neoplasia extraematolocica (melanoma, carcinoma gastrico, carcinoma vescicale).

In 14 pazienti (29,8%) si è verificata una neutropenia febbrile di grado 3 senza evidenza microbiologica di infezione documentata. Tuttavia in 8 casi è stato possibile documentare la presenza radiologica di un processo infettivo a carico del polmone. In ulteriori 3 casi si è verificata infezione dei tessuti molli (cellulite, ascesso dentario, ascesso cutaneo).