2. MATERIALI E METODI
2.1. Allevamento del materiale vegetale
L’indagine è stata condotta su semenzali di leccio (Quercus ilex L.) di circa tre anni di età provenienti dal vivaio “La Torraccia” di UmbriaFlor s.r.l. (Gubbio, PG). Le piante, trasportate a fine inverno presso le strutture del Dipartimento di Scienze Agrarie, Alimentari ed Agro-ambientali (DiSAAA-a) dell’Università di Pisa, sono state trapiantate in vasi in PVC (15 x 15
x 30 cm) contenenti un miscuglio di torba e sabbia (1:2, in volume, Figura 11). Il materiale
vegetale è stato successivamente mantenuto una settimana in camera di crescita in presenza di aria filtrata, di un regime idrico ed edafico ottimale e di condizioni luminose ed idro-termiche controllate [20±1°C, 85±5% di umidità relativa (U.R.), 530 µmol m-2s-1 di radiazione fotosinteticamente attiva (PAR: λ = 400-700 nm) ed almeno 14 h di fotoperiodo].
2.2. Simulazione in ambiente controllato di fattori di stress combinati
Per l’esposizione in ambiente controllato a O3 e stress idrico, 68 piante omogenee per taglia e
grado di sviluppo ed in buono stato vegetativo sono state selezionate, numerate e disposte all’interno di box in perspex (1,50 x 1,50 x 1,00 m), in presenza di aria filtrata e di un adeguato approvvigionamento idrico [in condizioni climatiche naturali (luce, temperatura, U.R. e fotoperiodo)]. Dopo due settimane di ambientazione, 17 vasi, scelti casualmente, sono stati sottoposti, per 80 giorni, rispettivamente a: (i) stress da O3 (80 ppb dalle 10.00 alle
15.00, ora solare, box 1), (ii) carenza idrica (approvvigionamento idrico quotidiano di circa 1/3 del totale evapotraspirato dalle piante di controllo ben irrigate, box 2), (iii) la combinazione dei due agenti di stress (O3 + carenza idrica, box 3) e (iv) aria filtrata e
approvvigionamento idrico giornaliero pari al 100% dell’evapotraspirato (controllo, box 4). In
Figura 12, si riporta uno schema esemplificativo delle tesi prese in esame e della loro
distribuzione.
Figura 12. Schema esemplificativo della suddivisione delle piante di Quercus ilex nei quattro box in relazione
alla tesi di appartenenza [ozono (box 1), carenza idrica (box 2), combinazione dei due agenti di stress (box 3) e controllo (box 4)].
L’O3 prevede la sua generazione a partire da ossigeno (O2) attraverso la scarica
elettrica prodotta da uno specifico generatore (Fisher 500) raffreddato ad aria. La concentrazione raggiunta all’interno dei box (1 e 3), regolata su valori desiderati agendo sull’intensità della scarica elettrica e sull’entità del flusso in entrata di O2, è misurata di
continuo. La miscela aria-O3, infatti, costantemente campionata mediante un tubetto in teflon
posto all’altezza delle piante, è convogliata ad un rilevatore automatico (Monitor Labs, mod. 8810), funzionante in base al principio dell’assorbimento della radiazione UV, controllato elettronicamente da uno specifico software.
Nei box 2 e 3, le piante sono state sottoposte ad un regime idrico caratterizzato da un’irrigazione manuale con volumi di acqua tali da restituire giornalmente l’evapotraspirato quotidiano. La quantità di acqua consumata giornalmente è stata valutata per pesata. In dettaglio, sono stati selezionati cinque esemplari che, dopo un adeguato approvvigionamento idrico, sono stati pesati (misura del peso alla capacità idrica di campo) e successivamente reinseriti nei box; dopo 24 ore i vasi sono stati nuovamente pesati in modo da determinare il valore medio dell’evapotraspirazione giornaliera. La stessa procedura è stata ripetuta ad intervalli regolari nel corso della prova.
In base ai dati, le piante sono state quotidianamente irrigate, inizialmente con 100 ml e successivamente, in conseguenza della loro crescita e delle mutate condizioni climatiche, con circa 150 ml. Gli esemplari sottoposti a stress idrico sono stati invece irrigati inizialmente con volumi di acqua pari a circa il 30% dei valori calcolati per le piante di controllo. Dopo un certo periodo, al raggiungimento di uno stress idrico pari a circa -2 MPa sono stati misurati per pesata i consumi idrici giornalieri delle piante in carenza irrigua e, con l'irrigazione giornaliera, è stato somministrato un contenuto idrico equivalente con lo scopo di mantenere lo stato idrico raggiunto.
All’interno di ogni box è stato posto un datalogger a doppio canale con sensori di temperatura e umidità relativa (Tinytag Ultra 2, Gemini Data Loggers Ldt) che ha registrato dati per tutta la durata della prova ad intervalli di 15 minuti (Figura 13).
Figura 13. Datalogger per la misura della temperatura e dell’umidità relativa (Tinytag Ultra 2, gemini Data
Loggers Ldt,).
Al termine dell’esposizione, le piante sono state separate in foglie (in relazione all’età ed alla presenza o meno di danni macroscopici), fusti e radici ed è stato rilevato il peso fresco e secco (24 h in stufa a 60 °C) delle singole parti.
2.3. Descrittori dell’ozono
Nei box 1 e 3, le dosi di O3 fornite (80 ppb dalle 10.00 alle 15.00, ora solare) durante l’intero
periodo di studio sono state scelte sulla base dei valori di Accumulated exposure Over
Threshold of 40 ppb (AOT40) cumulata e dei profili giornalieri di questo inquinante. Tali
descrittori sono stati calcolati sulla base delle concentrazioni medie orarie di O3 registrate in
Toscana (1 Aprile - 30 Settembre 2012), in uscita dagli analizzatori fotometrici (basati sull’assorbimento di radiazioni UV) dell’Agenzia Regionale per la Protezione Ambientale (ARPA, Dipartimento Provinciale di Pisa) riportati in Tabella 1:
Tabella 1. Elenco delle centraline automatiche dell’Agenzia Regionale per la Protezione Ambientale (ARPA)
della Toscana (distinte per provincia) che forniscono le concentrazioni medie orarie di ozono.
Arezzo Firenze Livorno Lucca Pisa
Acropoli Incisa Gabbro Carignano Montecerboli Casa Stabbi Settignano Maurogordato Porcari Passi
Poggio San Lorenzo Pontedera
Rossa Santa Croce
Per il calcolo dell’AOT40 sono stati presi in considerazione i valori registrati dalle 8.00 alle 20.00, come stabilito nel supplemento ordinario n. 217/L della Gazzetta Ufficiale Allegato VII al D. n. 155 del 2010.
2.4. Scambi gassosi fotosintetici
Durante l’intera durata della prova, ad intervalli settimanali e durante l’intero arco dell’ultima giornata di trattamento (XI settimana), sono stati misurati gli scambi gassosi delle piante
sottoposte ai diversi trattamenti per mezzo dei sistemi IRGA Li-6400, Li-Cor Inc.,e CIRAS- 2 (PP- systems), costituiti da un analizzatore differenziale a raggi infrarossi (IRGA: InfraRed Gas Analyzer), collegati ad una camera fogliare tipo Parkinson, capace di effettuare misure degli scambi di H2O (vap) e CO2 sulla singola foglia (Figura 14).
Figura 14. Sistemi IRGA per la misurazione dei parametri degli scambi gassosi foto sintetici: a sinistra CIRAS-
2 (PP- systems), a destra Li-6400 (Li-Cor Inc).
Seguendo il protocollo di Francini et al. (2007), le misure settimanali sono state effettuate su cinque piante per trattamento, illuminando le foglie con un’intensità di PAR di 1200 µmol m-2 s-1, quelle circadiane sono state effettuate a fine trattamento, con illuminazione regolata in funzione della luce esterna, su tre individui per trattamento. In tutti i casi è stata utilizzata una concentrazione ambiente di CO2 pari a 380 ppm ed U.R. dell’80%; la camera è stata
illuminata con lampada alogena al quarzo e la temperatura della foglia mantenuta a 26±0,4°C. I parametri presi in considerazione sono stati la fotosintesi netta (A), la conduttanza stomatica (gs) e la concentrazione intercellulare di CO2 (Ci).
2.5. Fluorescenza della clorofilla a
Le analisi della fluorescenza della clorofilla a sono state effettuate mediante un fluorimetro a luce modulata PAM-2000 (Walz, Effeltrich, Figura 15) sulle stesse foglie adoperate per gli scambi gassosi dopo averle adattate al buio per 10’, al fine di garantire la completa ossidazione dell’accettore primario del PSII (QA).
Figura 15. Fluorimetro a luce modulata (PAM 2000, Walz,)
La fluorescenza minima, F0, è stata determinata usando la misurazione della luce
modulata quando tutti i centri di reazione del PSII sono aperti. La luce modulata ha un’intensità abbastanza bassa (<1 µmol m-2 s-1), tale da non indurre emissione di fluorescenza variabile, ma solo di F0. Il livello massimo di fluorescenza, Fm, calcolato quando tutti i centri
del PSII sono chiusi, è individuato esercitando un’elevata intensità luminosa (0,8’’) a 8000 µmol m-2 s-1 in foglie adattate al buio. Dai parametri così rilevati si ottiene il rapporto Fv/Fm =
[(Fm-F0)/Fm]. La foglia è stata poi sottoposta a luce attinica (circa 400 µmol m-2 s-1), che attiva
il processo fotosintetico e il trasporto elettronico. In presenza di un’intensità luminosa elevata (10000 mmol m-2 s-1), a intervalli di 20’’ viene definita la fluorescenza massima nella fase di adattamento alla luce (F’m). La fluorescenza minima nello stadio adattato alla luce (F’0) è
stata determinata subito dopo spegnendo la sorgente di luce attinica, in presenza di una base nel rosso lontano (>710 nm) per 10’’, per assicurare l’ossidazione massima degli accettori di elettroni del PSII. Il metodo con impulso saturante è stato adottato per le analisi del quenching fotochimico (qP) e non fotochimico (qNP) come descritto da Schreiber et al. (1986). Quando la frazione di QA ossidati è in equilibrio con quella di QA ridotti, si raggiunge lo steady-state
della fotosintesi e il valore della fluorescenza è detto Ft. La resa quantica effettiva del PSII
(ΦPSII) viene calcolata mediante la seguente equazione: ΦPSII = (F’m-Fs)/F’m in cui Fs è la
misura di fluorescenza durante la fase di adattamento alla luce (Rohacek, 2002). La
performance del processo fotosintetico delle piante è stata monitorata a cadenza settimanale
mediante le analisi sopra-citate. Dopo 77 giorni dall’inizio dell’esposizione, in corrispondenza di un’AOT40 di 15400 ppb h, è stato stabilito il profilo circadiano dei principali marker d’integrità dell’apparato fotosintetico nelle sue componenti fisiologiche.
2.6. Potenziale idrico
Lo stato idrico delle piante è stato monitorato tramite misure di potenziale idrico fogliare effettuate prima dell’alba su foglie mature ben espanse, utilizzando una camera a pressione (model 600 Pressure Chamber Instrument) tipo Scholander alimentata da una bombola contenente azoto (Figura 16).
Al momento del campionamento le foglie sono state recise in prossimità della base del picciolo ed immediatamente sottoposte a misurazione, previa rifinitura della zona di taglio con una lametta ben affilata. Considerando che durante la giornata il potenziale idrico fogliare può variare significativamente per la forte influenza esercitata dalle condizioni ambientali, le misurazioni sono state eseguite prima dell’alba (PD Ψw), prima dell’apertura degli stomi, momento in cui la traspirazione è interrotta e il potenziale fogliare si trova in equilibrio con quello dello xilema (McCutchan e Shackel, 1992).
Figura 16. Camera a pressione (PMS; model 600 Pressure Chamber Instrument)
2.7. Estrazione e determinazione del contenuto in pigmenti fotosintetici e
accessori
I pigmenti fotosintetici sono stati estratti dai campioni fogliari liofilizzati, in accordo con il metodo di Döring et al. (2014), con opportune modifiche. Frazioni di circa 50 mg di materiale vegetale liofilizzato sono state mantenute in 1 ml di metanolo puro per 12 ore, al buio, a 4 °C. Dopo centrifuga (16000g per 15’’ a 5 °C) e filtrazione (filtri asetticiMinisart® SRT 15 da 0,2
µm), l’estratto è stato stoccato a -20 °C fino al suo utilizzo. Il contenuto in pigmenti fotosintetici è stato determinato mediante HPLC, utilizzando un sistema di pompa quaternaria a bassa pressione P680 A LPG-4, dotata di detector UVD 170U UV/VIS (Dionex). I dati cromatografici sono stati processati e registrati mediante il software Chromeleon
Chromatography Management System, versione 6.60-2004. La separazione è stata condotta
utilizzando una colonna C18, della Dionex (Acclaim 120, C18, 4,6 mm diametro interno x 150 mm di lunghezza), e un programma di eluizione a gradiente, con fase mobile consistente in due soluzioni, acetonitrile/metanolo 75/25 v/v (soluzione A) e metanolo/etilacetato 68/32 v/v (soluzione B): 14’’ in 100% di soluzione A (in modo da eluire le xantofille includendo anche la separazione della luteina); 1,5’’ in gradiente da 100% di soluzione A a 100% di soluzione B; 15 minuti in 100% di soluzione B [in modo da eluire le clorofille a e b e il β-carotene] e infine 2’’ in gradiente da 100% di soluzione B a 100% di soluzione A. Il flusso era impostato a 1 ml e il volume di iniezione era di 20 µl. Il cromatogramma è stato acquisito con detector UV-Vis alla lunghezza d’onda di 445 nm. La quantificazione di clorofilla a e b, luteina e β-carotene è stata effettuata in base a rette di calibrazione costruite con soluzioni metanoliche a concentrazione nota di ogni standard. Violaxantina, neoxantina e anteraxantina sono state stimate in equivalenti di zeaxantina, mediante il relativo standard.
2.8. Estrazione e determinazione del contenuto in acido abscissico
Il contenuto in acido abscissico è stato determinato adattando il metodo di Perata et al. (1997). Frazioni di circa 80 g di materiale vegetale liofilizzato sono state mantenute in 0,8 ml di H2O
per 12 ore a 4 °C. Dopo sonicatura (3 ripetizioni da 10’’ a 70 °C), centrifugazione a 16000g per 10’’ a 4 °C e filtrazione (filtri asettici Minisart® SRT 15 da 0,2 µm), l’estratto è stato analizzato mediante HPLC La separazione è stata condotta utilizzando una colonna C18 (Dionex) e un programma di eluizione con fase mobile consistente in due solventi, acqua demineralizzata per analisi cromatografiche, acidificata [0,05 M con acido acetico (soluzione A)] e metanolo (soluzione B): 6’’ in 70% di soluzione A e 30% di soluzione B; 2’’ in gradiente da 70% di soluzione A e 30% di soluzione B a 50% di soluzione A e 50% di soluzione B; 18’’ in 50% di soluzione A e 50% di soluzione B; 2 minuti in gradiente da 50% di soluzione A e 50% di soluzione B a 100% di soluzione B; 2’’ in 100% di soluzione B e infine 2’’ in gradiente da 100% di soluzione B a 70% di soluzione A e 30% di soluzione B. Il
acquisito con detector UV-Vis alla lunghezza d’onda di 254 nm. La quantificazione di acido abscissico è stata effettuata in base a rette di calibrazione costruite con soluzioni acquose a concentrazione nota mediante relativo standard.
2.9. Estrazione e determinazione del contenuto in prolina
Il contenuto in prolina è stato determinato adattando il metodo di Bates et al. (1973). Un totale di 100 mg di materiale liofilizzato, è stato mantenuto in 1,5 ml di acido sulfosalicilico al 3%. Dopo sonicatura (3 ripetizioni da 10’’ a 70 °C), l’omogeneizzato è stato centrifugato a 16000g per 20’’ a 20 °C e filtrato mediante filtri asettici Minisart® SRT 15 da 0,2 µm. Successivamente, 0,8 ml di surnatante sono stati miscelati con 0,8 ml di acido acetico glaciale e 0,8 ml di acido ninidrinico (1,25 g di ninidrina, 30 ml di acido acetico glaciale e 20 ml di H3PO4 6 M). Dopo essere stati incubati per 1 ora a 100 °C, i campioni sono stati posti
velocemente in un bagno di ghiaccio. Alla miscela, sono stati poi aggiunti 1,6 ml di toluene e, previa agitazione di 20’, l’assorbanza della fase toluenica (superiore) è stata stimata a 520 nm. La medesima procedura è stata utilizzata per realizzare una retta di calibrazione, usando come
standard prolina a concentrazioni note (da 15 a 0,94 µg ml-1).
2.10. Trattamento statistico dei dati
La valutazione degli effetti del trattamento sui parametri fisiologici e biochimici del leccio è stata effettuata tramite un’analisi della varianza (ANOVA) per misure ripetute a una via, considerando il fattore “trattamento”. Dove l’interazione “trattamento x tempo” è risultata significativa, le differenze statistiche tra le medie sono state determinate tramite il test della differenza minima significativa (LSD) al livello di significatività P ≤ 0,05. Per ciascuna variabile e specie è stato indicato un indice di plasticità fenotipica che varia da 0 a 1, calcolato come differenza tra i valori di media maggiore e minore dei quattro trattamenti diviso il valore di media maggiore (Valladares et al. 2000). Questo indice ha il vantaggio di permettere che cambiamenti nelle variabili espresse in differenti unità e con range di variazione contrastante possano essere comparati. Le analisi statistiche sono state effettuate con il software NCSS 2004 Statistical Analysis System. Per le elaborazioni in questione si è fatto riferimento al testo di Zar (1984).
