Risultati e discussione

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Risultati e discussione

Range di diluizioni e dose infettante

I materiali oggetto di studio, rappresentati da siero di pazienti e da concentrati di immunoglobuline, mostrano ovviamente differenze significative in termini di contenuto anticorpale. La differenza nei livelli di concentrazione implica che il range di diluzioni applicabile sia diverso: ciò non ha di fatto un impatto significativo al fine della verifica della comparabilità tra i metodi poiché il range viene definito apriori in base ai dati attesi.

Altro aspetto che invece è da considerare è la dose infettante: la maggior parte dei protocolli e degli studi presenti in letteratura ed in linee guida applicati a siero di pazienti rilevano che la dose infettante utilizzata è pari a 100 TCID50 (Fujino et al., WHO/IVB/04.10).

Gli studi presenti in letteratura per la determinazione degli anticorpi neutralizzanti in concentrati di immunoglobuline riferiscono di dosi infettanti pari a 1000 TCID50. (Audet et al.)

sebbene non ci siano indicazioni da parte degli enti regolatori quali FDA.

È evidente che al fine della comparabilità tra i protocolli sono state applicate le medesime condizioni in termini di dose infettante, laddove applicabili.

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Tipo di substrato cellulare

Il protocollo sviluppato dal laboratorio di Glasgow utilizza le VeroCells mentre il metodo del laboratorio di Virologia le cellule KB; vista la differenza nel tipo cellulare utilizzato si è ritenuto necessario verificare l’applicabilità e l’effetto del tipo cellulare.

Le cellule Vero derivano dal rene di scimmia verde (Cercopithecus aethiops) e rappresentano una delle linee cellulari più utilizzate in ricerca e diagnostica (Ammerman et al.). Oltre ad applicazioni in batteriologia per la propagazione di batteri intracellulari (ad esempio

Rickettsia spp.) sono applicate anche per la propagazione di rotavirus, poliovirus, virus della

rabbia, reovirus e virus dell’encefalite giapponese. Questo tipo di cellule solitamente impiegano dai due ai tre passaggi prima di raggiungere una costante velocità di crescita. Al contrario le cellule KB, originate da una sottolinea continua di cellule Hela (originate da un cancro della cervice uterina di una paziente), sono molto più resistenti delle altre cellule tumorali e sono in grado di sopravvivere in condizioni che altre cellule non possono tollerare replicandosi più volte anche in assenza di terreno di coltura (Kohn et al.).

Al fine di verificare l’impatto della tipologia sull’esito finale del test sono stati eseguiti test di neutralizzazione in parallelo utilizzando sia le cellule Vero sia le cellule KB per verificare il titolo anticorpale contro il virus polio 1, polio 2 e polio 3 in sieri di dieci pazienti precedentemente analizzati dal laboratorio di Virologia dell’Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana. Per queste prove è stato applicato il protocollo a disposizione dell’azienda ed il protocollo FDA.

In breve sono state eseguite due repliche per ciascuna diluizione e diluizioni scalari in base 4 a partire dalla diluizione 1:8 fino alla 1:512. Le prove sono state eseguite con 100 TCID50/75

μl per tutti e tre i virus, il cui effetto citopatico dopo è stato valutato sia in cellule KB sia in cellule Vero dopo 5 e 6 giorni di incubazione. Tali prove avevano lo scopo di verificare se il differente substrato cellulare potesse influenzare il risultato finale.

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Di seguito in tabella i risultati:

ID paziente Anno di nascita Sesso Reparto Test Ab polio 1 Ab polio 2 Ab polio 3

Titolo Ab Target Titolo Ab PISA Titolo Ab FDA

Tipo cellulare Tipo cellulare Tipo cellulare Cellule KB Cellule Vero Cellule KB Cellule Vero Cellule KB #1 2011 Maschio Onco-‐ematologia pediatrica Ab polio 1 > 1:512 1:512 1:512 Ab polio 2 1:256 1:128 1:256 Ab polio 3 1:256 1:256 1:256 #2 2011 Maschio Pediatria Ab polio 1 1:32 1:32 1:32 Ab polio 2 1:16 1:32 1:32 Ab polio 3 1:32 1:32 1:32 #3 1975 Femmina Nefrologia Trapianti-‐Dialisi Ab polio 1 < 1:8 < 1:8 < 1:8 Ab polio 2 < 1:8 < 1:8 < 1:8 Ab polio 3 < 1:8 < 1:8 < 1:8 #4 2008 Femmina Pediatria Ab polio 1 > 1:512 1:512 1:512 Ab polio 2 1:32 1:32 1:64 Ab polio 3 1:256 1:128 1:128 #5 1968 Femmina Nefrologia Trapianti-‐Dialisi Ab polio 1 1:256 1:128 1:128 Ab polio 2 1:32 1:16 1:16 Ab polio 3 1:64 1:64 1:64 #6 2011 Femmina Pediatria Ab polio 1 1:512 1:256 1:128 Ab polio 2 1:512 1:256 1:256 Ab polio 3 1:128 1:64 1:64 #7 2015 Femmina Pediatria Ab polio 1 1:64 1:64 1:64 Ab polio 2 1:256 1:128 1:64 Ab polio 3 1:32 1:32 1:32 #8 2015 Maschio Pediatria Ab polio 1 > 1:512 >1:512 1:512 Ab polio 2 > 1:512 >1:512 >1:512 Ab polio 3 1:512 1:512 1:512 #9 2015 Femmina Onco-‐ematologia pediatrica Ab polio 1 > 1:512 1:512 1:512 Ab polio 2 < 1:8 < 1:8 < 1:8 Ab polio 3 > 1:512 > 1:512 1:512 #10 2001

Femmina Centro Prelievi

Ab polio 1 1:512 1:512 1:256

Ab polio 2 1:256 1:256 1:256

Ab polio 3 1:64 1:64 1:64

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I risultati di tali prove hanno dimostrato che non vi sono differenze significative nell’utilizzo dei due differenti tipi cellulari che nelle condizioni sperimentali di questo lavoro risultano equivalenti.

Tempo di incubazione della soluzione virus/anticorpi

Il saggio di neutralizzazione si basa sulla capacità degli anticorpi neutralizzanti di bloccare l’infettività virale a partire da una soluzione di un virus a titolo noto e fisso e il materiale oggetto di indagine. Al fine di poter garantire un efficace neutralizzazione è necessario che la sospensione virus/anticorpi o siero del paziente subisca un periodo di incubazione. Il tempo necessario è variabile da almeno trenta minuti a 37°C in CO2 al 5% (Lamb et al.) fino a due ore

a temperatura ambiente (Neumann et al.); generalmente il tempo di incubazione medio in un test diagnostico è di un’ora alla temperatura di 37°C in CO2 al 5%.

Il tempo di incubazione nei due protocolli in studio sono differenti: il metodo del laboratorio dell’AOUP prevede un periodo di incubazione di un’ora a 37°C in CO2 al 5%, mentre il

protocollo applicato nel laboratorio di Glasgow richiede un’ora e mezzo nella medesime condizioni di temperatura e CO2.

Il protocollo di comparabilità ha quindi previsto la verifica del tempo minino di incubazione per ricondurre, laddove applicabile, a risultati equivalenti.

Questo aspetto è stato verificato applicando il protocollo del laboratorio AOUP e 1000 dosi di virus a due lotti di concentrati di immunoglobuline per verificare se l’elevata concentrazione anticorpale contro polio 1, 2 e 3 potesse incidere sul tempo di incubazione richiesto per la determinazione del titolo finale; sono stati considerati tre tempi di incubazione (tempo di 30 minuti, tempo di 1 ora e di 1 ora e 30 minuti); i risultati sono stati poi confrontati con il titolo di rilascio determinato secondo il protocollo FDA.

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L’esperimento ha permesso di identificare che il tempo di trenta minuti alla temperatura di 37°C permette l’espressione di un titolo anticorpale protettivo; tuttavia questi risultati non sarebbero in linea con quelli target poiché è infatti necessario mantenere un periodo di incubazione di almeno un’ora per ottenere livelli paragonabili come mostrato graficamente in grafico sotto:

Dai risultati emersi si nota come il maggiore delta tra i titoli anticorpali non è risultato superiore ad un logaritmo in tutti i tre tempi; per tale ragione il tempo di incubazione di un’ora a 37°C come previsto dal protocollo del laboratorio dell’AOUP è sovrapponibile a quello utilizzato nel protocollo del laboratorio di Glasgow.

Al fine di verificare i livelli di accuratezza di questo test, tali dati sono stati verificati esprimendoli come valore di recupero della potency (Recupero % = (100) x Potenza misurata / Potenza teorica), fissando come titolo target valori precedentemente determinati sui sieri dei pazienti e sui concentrati di immunoglobuline.

Il criterio di accettazione per ritenere un test accurato e riproducibile definito anche nelle USP di Farmacopea Statunitense (USP 1032) è fissato in un range di recupero % tra il 20 ed il 120%, i cui dati calcolati sono illustrati di seguito.

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A B A B A B 71,59 65,08 81,31 74,88 76,05 67,08 30 93,55 72,65 88,82 90,19 83,85 82,56 60 93,55 87,43 103,89 97,86 68,13 82,56 120 LOTTO

R% rispetto al titolo noto

POLIO 1 POLIO 2 POLIO 3

Minuti di incubazione

Figura 1: R% in funzione del tempo di incubazione

Questa evidenza dimostra come, pur essendoci un’attività neutralizzante da parte degli anticorpi dopo trenta minuti di incubazione a 37°C in CO2 al 5%, i valori di recupero %

risultano sia costanti e maggiormente conformi dopo almeno un’ora di incubazione.

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Fase di aggiunta delle cellule

Una variabile importante tra i due tipi di protocolli si configurava nello step di preparazione delle cellule, ovvero la fase di aggiunta delle cellule: il protocollo applicato presso il laboratorio di virologia dell’AOUP prevede infatti l’aggiunta del substrato cellulare nei pozzetti della piastra, in cui la miscela siero/sospensione virale era stata precedentemente aliquotata; questo approccio è stato descritto ed è stato applicato in alcuni lavori sulla titolazione virale (Lamb et. al).

Il Capitolo <1237> Virology Test Method della corrente Farmacopea Statunitense edizione 39 (USP 1237) indica che i campioni contenenti il virus da titolare devono essere inoculati preferibilmente nel substrato cellulare in fase mitotica, quindi in replicazione: ciò significa che le cellule, se aderenti, devono essere in monostrato; anche in studi più recenti, comprese alcune indicazioni rilasciate da fornitori (ATCC Virology Guide; Leland et al.) viene indicato di aggiungere la sospensione virale/siero ad un monostrato di cellule preformato; tale strategia è applicata nel protocollo utilizzato dal laboratorio di Glasgow che prevede l’aggiunta della miscela virus/siero al substrato di cellule a seguito della formazione del monostrato nei pozzetti della piastra, il giorno successivo. In linea di principio l’aggiunta della sospensione cellulare alla miscela di siero/virus potrebbe favorire l’infezione poiché aumenterebbero le probabilità di incontro tra le particelle virali e le cellule in fase di deposizione sul fondo del pozzetto. Queste prove sono state eseguite facendo due prove di titolazione in parallelo del virus polio 1, polio 2 e polio 3 utilizzando una dose infettante pari a 1000 dosi TCID50 a partire da diluizioni scalari 1:10 dello stock di virus; ogni diluizione è stata replicata 12 volte e le letture sono state fatte dopo cinque e sei giorni di incubazione.

I risultati ottenuti dimostrano che non ci sono differenze significative tra i due differenti protocolli: appare evidente che i valori di titolo virale polio 1, polio 2 e polio 3, ottenuti con il protocollo FDA, sono tendenzialmente più bassi rispetto a quelli ottenuti con il protocollo

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dell’AOUP seppur mantenendo il medesimo ordine di grandezza; ciò può essere dovuto alla differente modalità di aggiunta del substrato cellulare: l’aggiunta della sospensione cellulare alla soluzione di virus al giorno 0 (protocollo dell’AOUP) potrebbe favorire l’infezione poiché aumenterebbero le probabilità di incontro tra le cellule e le particelle virali durante l’adesione al fondo del pozzetto. Il protocollo FDA prevede prima la formazione del tappeto cellulare (giorno 0) e poi l’aggiunta della sospensione del virus (giorno 1): questo approccio potrebbe ridurre o quantomeno non aumentare le probabilità di incontro tra cellula e virus determinando un’infezione meno efficiente e titoli inferiori anche se in modo non significativo.

Questo aspetto potrebbe essere in linea con i risultati ottenuti per i quali i titoli anticorpali ottenuti con l’applicazione del protocollo FDA-‐approved appaiono tendenzialmente più bassi, anche se in modo non significativo, rispetto a quelli ottenuti con il protocollo AOUP di cui sotto in tabella:

Protocollo PISA Protocollo FDA

Titolo TCID50/75 µl test #1 (n = 12) test #2 (n = 12)

Titolo* virus polio 1 6,19E+07 5,11E+07

Titolo** virus polio 1 4,22E+07 5,62E+07

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*Titolo calcolato con la formula di Spearman **Titolo calcolato con la formula di Reed Muench

La medesima prova è stata eseguita in due test indipendenti per la determinazione del titolo di una soluzione stock del virus del morbillo; brevemente sono stati applicati entrambi i protocolli per la neutralizzazione utilizzando le cellule Vero, che risultano idonee allo sviluppo dell’effetto citopatico di questo tipo di virus. Le prove sono state eseguite a partire da una soluzione virale a titolo noto (precedentemente titolata e risultata pari a 10^3.75 TCID50); i risultati delle prove, registrati dopo cinque e sei giorni di incubazione, sono

illustrati in tabella sotto:

Titolo* virus morbillo 2,37E+03 5,62E+02

Titolo** virus morbillo 1,78E+03 3,73E+02

Titolo** virus morbillo 2,37+03 8,10E+02

*Titolo calcolato con la formula di Spearman **Titolo calcolato con la formula di Reed Muench

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Tempo di incubazione per la valutazione dell’effetto citopatico

Nel corso del test di neutralizzazione, a seguito dell’interazione tra il virus e gli anticorpi neutralizzanti la sospensione viene posta a contatto con il substrato cellulare, che deve essere in fase mitotica di crescita al fine di promuovere la replicazione virale. Dopodiché l’interpretazione dei risultati prevede un periodi di incubazione di alcuni giorni nei quali il virus esprime il suo effetto citopatico replicandosi attivamente. I dati presenti in letteratura prevedono che la lettura delle piastre venga fatta dopo almeno quattro giorni di incubazione. Nei protocolli oggetto di studio tale data è fissata a cinque e sei giorni rispettivamente per il protocollo del laboratorio dell’AOUP e del laboratorio di Glasgow. Non è emerso alcun tipo di differenza nell’interpretazione dei risultati per quanto riguardano le prove di neutralizzazione dirette contro il virus polio 1, polio 2 e polio 3.

Numero di repliche

Il protocollo applicato presso il laboratorio di Glasgow utilizza un layout di semina sulla piastra che prevede la semina delle diluizioni in quintuplicato ed in base due, mentre il protocollo del laboratorio dell’AOUP rileva i livelli di titoli anticorpali eseguendo diluizioni scalari in base quattro ed in doppio. Il numero di repliche ed i livelli di diluizione possono fortemente influenzare i livelli di accuratezza e precisione come dimostrato in uno studio per il quale utilizzando diluizioni in base due e fino a dieci repliche possano essere raggiunti livelli di accuratezza accettabili (Nielsen et. al) e coefficienti di variazione entro il 20% come indicato nelle linee guida FDA (Assay Development and Validation for Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products). Sotto questo punto di vista il protocollo dell’AOUP rappresenterebbe il worst case, poiché nel corso di una seduta analitica conta di due repliche

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per diluizione in base quattro anziché almeno cinque repliche in base due, apparendo di fatto meno preciso a prescindere.

Lo studio di comparabilità eseguito su otto lotti di immunoglobuline precedentemente testati per polio 1, polio 2 e polio 3 presso il laboratorio di Glasgow applicando il protocollo del laboratorio AOUP hanno evidenziato che non c’è differenza significativa tra i valori dei titoli anticorpali per tutti i sierotipi di poliovirus come illustrato nei grafici sotto:

Figura 2: Polio 1

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Figura 3: Polio 2 Figura 4: Polio 3

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Formula per la determinazione del titolo anticorpale

Nella letteratura scientifica sono descritte due tipologie di formule per la determinazione del titolo anticorpale: la formula secondo Reed Muench e secondo Spearman.

Entrambi i tipi di metodi sono descritti anche nelle USP statunitensi (USP 1237 e 1032) e sono stati utilizzati per il ricalcolo di tutti i titoli determinati nel corso di questo studio per il virus polio 1, polio 2 e polio 3 e per morbillo, i cui andamenti sono illustrati nei grafici sotto:

Figura 5: Polio 1 Figura 6: Polio 2

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Figura 7: Polio 3

Tabella: titolazione del virus del morbillo

Titolo** virus morbillo 1,78E+03 3,73E+02

Titolo** virus morbillo 2,37+03 8,10E+02

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Non sono emerse differenze significative tra i titoli anticorpali calcolati con entrambe le formule, confermando il trend dei dati precedenti (Lamb et al., Stephenson et al.) ed evidenziando come i metodi siano riproducibili.

I livelli di accuratezza delle prove sono stati verificati esprimendo tale parametro di recupero del logaritmo della potency (Recupero % = (100) x Potenza misurata / Potenza teorica), fissando come titolo target valori precedentemente determinati sui sieri dei pazienti e sui concentrati di immunoglobuline.

Il criterio di accettazione definito è rappresentato dal range di recupero % tra il 20 ed il 120%, i cui dati calcolati sono illustrati di seguito.

1 2 3 4 5 6 7 8 82,48 91,20 79,70 88,75 88,75 86,14 86,28 92,20 78,89 92,27 74,52 88,67 88,67 92,44 80,00 97,32 89,86 87,43 90,12 88,75 88,75 89,86 86,28 84,92 87,06 97,98 93,75 88,67 88,67 87,05 80,00 89,42 LOTTO

Figura 8: R% per polio 1, in rosso dati non conformi, 1° e 3° riga titolo calcolato secondo SP dopo 1h e 1h ½ , 2° e 4° riga secondo RM dopo 1h e 1h ½

1 2 3 4 5 6 7 8 96,33 88,14 96,36 89,33 97,81 96,95 88,73 98,62 82,24 86,45 96,50 92,10 98,63 94,80 66,70 100,92 96,33 88,14 88,75 85,98 97,81 88,99 103,87 87,43 82,24 86,45 78,27 97,32 98,63 85,91 88,87 86,49 LOTTO

Figura 9: R% per polio 2, in rosso dati non conformi, 1° e 3° riga titolo calcolato secondo SP dopo 1h e 1h ½, 2° e 4° riga secondo RM dopo 1h e 1h ½

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1 2 3 4 5 6 7 8 94,92 96,36 85,98 87,15 97,17 96,33 96,34 100,91 116,79 96,50 105,66 98,16 95,22 106,63 106,63 109,56 103,90 103,90 103,90 100,00 92,47 100,00 92,11 100,00 94,64 94,64 94,64 100,00 91,42 100,00 91,88 100,00 LOTTO

Figura 10: R% per polio 3, 1° e 3° titolo calcolato secondo SP dopo 1h e 1h ½, 2° e 4° secondo RM dopo 1h e 1h ½

Solo in quattro occasioni non è stato rispettato il criterio di accettazione del recupero % attribuibile con ogni probabilità alla variabilità intrinseca del metodo.

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Determinazione del titolo anticorpale contro il virus del morbillo

Il titolo anticorpale nei confronti del virus del morbillo rappresenta un test regolatorio per il rilascio di tutti i prodotti di immunoglobuline nel mercato statunitense.

Tuttavia il livello anticorpale è in fase di diminuzione nei prodotti di immunoglobuline e gli attuali livelli di potency minimi dovrebbero conseguentemente essere ridotti (Basil G,

Personal communication). A partire dal 1961 sono stati man a mano prodotti ed utilizzati

differenti lotti di standard internazionali (Lot 1, Lot 175). Nel 1992 il lotto 175 è stato sostituito dal lotto attutale, il Lot 176.

Ad oggi le scorte dell’unico lotto standard internazionale disponibile (Lot 176) sono in fase di esaurimento e l’ente CBER (Center for Biologics Evaluation and Research) ha messo a disposizione una concentrato di immunoglobuline, il Lot 177, che è stato identificato come il potenziale nuovo standard di riferimento per la determinazione del titolo di anticorpi neutralizzanti.

Allo stato attuale presso il laboratorio di Glasgow sono in corso studi collaborativi per la standardizzazione del titolo anticorpale contro il virus del morbillo nel Lot 177 nei confronti dello standard primario Lot 176, che si è dimostrato possedere un titolo pari 2540 mIU/mL at 1% IgG; poiché tale standard internazionale contiene 16,5% in proteine il titolo del non diluito è pari a 42.000 mUI/ml (Audet et al.). Finora presso il laboratorio di Glasgow sono state eseguite 17 prove di neutralizzazione ed il titolo medio di anticorpi neutralizzanti diretti contro il virus del morbillo è pari a 1673, ovvero 10^3,22; di seguito la tabella riassuntiva delle determinazioni.

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Date Measles Form Lot 177 Measles _{Antibody
Titre} Measles Potency (%) 20-‐mag-‐15 Bv1-‐1M 1415,1 97,7 27-‐mag-‐15 Bv1-‐3M 1955,5 97,7 11-‐giu-‐15 Bv1-‐4M 2246,3 114,9 12-‐giu-‐15 Bv1-‐5M 1588,4 75,8 24-‐giu-‐15 Bv1-‐6M 1702,4 70,7 24-‐giu-‐15 Bv1-‐7M 1867,2 93,3 09-‐lug-‐15 Bv1-‐8M 891,4 77,6 28-‐lug-‐15 Bv1-‐9M 1782,9 102,3 13-‐ago-‐15 Bv1-‐10M 1382,8 100 18-‐ago-‐15 Bv1-‐11M 1448,2 87,1 31-‐ago-‐15 Bv1-‐12M 1097,5 97,7 20-‐ott-‐15 Bv1-‐13M 2048 112,2 27-‐ott-‐15 Bv1-‐17M 2407,5 112,2 27-‐ott-‐15 Bv1-‐18M 1782,9 112,2 02-‐ott-‐15 Bv1-‐19M 1955,5 100 11-‐nov-‐15 Bv1-‐20M 1516,6 93,3 30-‐nov-‐15 Bv1-‐21M 1351,2 107,2

Figura 11: dati forniti da Glasgow

Queste informazioni sono state utilizzate per eseguire in parallelo due prove di neutralizzazione (con il protocollo del laboratorio AOUP) sul siero di pazienti di cui era noto il contenuto totale di IgG espresso in mUI/ml al fine di verificare la correlazione tra i valori di IgG totali ed il titolo di anticorpi neutralizzanti utilizzando la formula di Spermann. Il titolo dello standard pari a 1673 (10^3,22) è stato utilizzato come titolo di riferimento.

ID paziente Anno di nascita

Sesso Reparto Titolo Ab IgG ELISA (mUI/ml) #1 1986

Maschio Malattie Infettive 492 #2

2013

Maschio Lab.Patologia Clinica 615 #3

2010

Maschio Onco-‐ematologia pediatrica 1558 #4

2014

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#5 1977

Femmina Onco-‐ematologia 3422

#6 2011

2011

1953

Femmina Medicina 10919

#9 2004

Femmina Onco-‐ematologia pediatrica 14921

I risultati, indicati sotto, evidenziano come ci sia una correlazione tra il titolo degli anticorpi neutralizzanti ed il titolo in IgG; in entrambe le prove valore di recupero percentuale del lotto standard è stato rispettivamente di 90,49% (10^3,22 dello standard contro 10^2,91) e del 86,31% (10^3,22 dello standard contro 10^2,78).

Dai dati in letteratura emerge come un titolo compreso tra 1:8 e 1:120 sia da considerare già protettivo (Cohen et al., Latner et al.) e stando ai risultati ottenuti valori di IgG, determinati con metodo ELISA, compresi tra 3000 e 7000 mUI/ml risultano quindi protettivi.

ID paziente Anno di nascita

Sesso Titolo Ab Neutralizzanti Titolo Ab Neutralizzanti Titolo Ab IgG ELISA (mUI/ml) #1 1:8 <1:8 492 #2 1:16 <1:8 615 #3 1:32 1:32 1558 #4 1:64 1:32 1568 #5 1:128 1:64 3422 #6 1:256 1:256 7664 #7 1:256 1:128 8488 #8 1:512 >1:512 10919 #9 1:512 >1:512 14921

Inoltre osservazioni precedenti dimostrano che un titolo pari 8 determinato con tecnica di neutralizzazione sia equivalente a circa 8 mUI/ml (Audet et al.). Considerando la correlazione

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lineare tra titolo ed mUI/ml si è verificato l’andamento dei due metodi di misurazione semplicemente nel grafico sotto riportato:

Questa semplice osservazione dimostrerebbe che il contenuto di anticorpi neutralizzanti fosse inferiore rispetto al contenuto di IgG determinato con tecnica ELISA; tuttavia le informazioni a supporto di questa evidenza sono limitate poiché gli studi di comparabilità presenti in letteratura mettono in evidenza le relazioni esistenti tra i livelli di IgG determinate con metodo ELISA e il contenuto di anticorpi neutralizzanti determinati con il metodo considerato il “gold standard”, ovvero la tecnica delle placche (Mauldin et al., Cohen et al.). Sebbene in questo lavoro non sia stata utilizzata la tecnica delle placche, i risultati ottenuti non sono lontani da quanto osservato; infatti recenti studi riportano che il quantitativo di anticorpi neutralizzanti non correla con il contenuto in IgG in ELISA (Backhouse et al., Matsubara et al.): si ritiene che questa osservazione sia riconducibile al fatto che con le tecniche ELISA in generale vengano misurati gli anticorpi diretti contro differenti tipologie dell’intero virus, che evidentemente differiscono da quelle misurate nei test di neutralizzazione. Questo aspetto andrebbe sicuramente supportato da ulteriori approfondimenti per allestire un test diagnostico di neutralizzazione diretto contro il virus del morbillo, il cui allestimento risulta maggiormente laborioso ed i risultati maggiormente variabili.

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Conclusione

I due protocolli utilizzati per il test di neutralizzazione hanno fornito livelli di performance sovrapponibili. Le variabili che potessero maggiormente influenzare i risultati dei titoli anticorpali, quali differenza di utilizzo nel substrato cellulare, numero di repliche per diluizione, tempi di incubazione e la fase di preparazione della sospensione cellulare, sono state verificate per poliovirus e morbillo. Nessuna di entrambe le metodiche prevede una valutazione dei possibili effetti piastra di cui le linee guida tecniche sottolineano l’importanza ed i potenziali bias in fase di preparazione della piastra; il protocollo approvato dall’FDA, applicato presso il laboratorio di Glasgow presenta un layout simile a quello del laboratorio dell’AOUP, quindi l’eventuale effetto piastra può essere considerato trascurabile. In linea generale il test di neutralizzazione risulta essere un approccio laborioso e time-‐consuming per i quale è richiesto un elevato livello di expertise da parte dell’operatore. Nonostante che il protocollo del laboratorio dell’AOUP preveda l’utilizzo di un numero inferiore di repliche per ciascuna diluizione e preveda diluizioni scalari doppie rispetto al protocollo utilizzato dal laboratorio di Glasgow, i risultati ottenuti sui concentrati di immunoglobuline sono in linea in termini di riproducibilità e accuratezza con i dati forniti dal laboratorio GMP di Glasgow. In questo senso il protocollo di neutralizzazione del laboratorio dell’AOUP ne permetterebbe la configurazione, per questa tipologia di test, come un possibile centro di riferimento che possa garantire livelli di performance equivalenti a quelli di un laboratorio GMP e certificato Food and Drug Administration.