4. RISULTATI
4.1 Cloni molecolari
Recenti studi hanno dimostrato che la sequenza segnale per l’endocitosi di Env è altamente conservata tra i lentivirus. FIV, in particolare, condivide con i lentivirus dei primati gli aminoacidi definiti critici per il trasporto della glicoproteina all’interno del citoplasma ad opera di proteine cellulari (Hosie et al., 2005). In esperimenti condotti su SIV ed HIV, mutazioni della tirosina e della glicina presenti nel dominio citoplasmatico della TM hanno compromesso il processo endocitotico aumentando di conseguenza il contenuto di Env sulla superficie esterna delle cellule infette. E’ stato ipotizzato quindi, che sfruttando questo meccanismo a scopo vaccinale sia possibile produrre immunogeni più efficaci. In questo lavoro di tesi abbiamo prodotto quattro cloni molecolari denominati Δ00XX, Δ00AI, Δ23XX e Δ23AI. Tutti i costrutti contengono l’intero genoma di FIV-Petaluma, i cloni ∆00 nella versione wild-type, i cloni ∆23 esprimono invece una forma tronca della proteina ORF-A. Tutti infine sono stati modificati nella sequenza di endocitosi di env: i cloni ∆00XX e Δ23XX sono stati deleti dei codoni codificanti glicina e tirosina e nei cloni Δ00AI e Δ23AI gli stessi aminoacidi sono stati sostituiti rispettivamente con alanina ed isoleucina.
Come accennato nell’introduzione ed allo scopo di creare vaccini FIV geneticamente attenuati ed altamente immunogenici, questo studio è stato condotto anche su cloni molecolari modificati in ORF-A, un gene accessorio importante sia per la replicazione in linfociti T sia per il potenziale patogenico di FIV (Gemeniano et al., 2003). Il clone ∆23 produce una proteina ORF-A tronca per la presenza di due codoni di stop e la delezione di tre codoni aminoacidici immediatamente a valle. In precedenti studi è stato dimostrato che questo ed altri cloni similari hanno ridotta capacità di infettare i linfociti, pur mantenendo la capacità di infettare monociti/macrofagi in vitro ed in vivo (Pistello et al., 2002). In esperimenti di vaccinazione i cloni avevano ridotta patogenicità, ma risultavano tuttavia debolmente immunogenici (Pistello et al., 2005). Da qui quindi l’idea di aumentare lo stimolo antigenico alterando il processo di endocitosi di Env. Tra i vari cloni testati, la nostra scelta è ricaduta sul ∆23, essendosi dimostrato
assolutamente stabile e non patogenico anche a seguito di prolungata propagazione in vivo.
4.2 Esperimenti di trasfezione
I cloni molecolari sono stati analizzati per capacità replicative e livelli di espressione di Env mediante trasfezione su cellule CrFK. Esperimenti preliminari, condotti con i cloni in oggetto ed un plasmide esprimente la green fluorescence protein (GFP) come gene reporter, hanno mostrato valori di efficienza di trasfezione delle CrFK tra loro simili e prossimi al 70%, indicando che le modifiche apportate ai cloni molecolari FIV non influenzano l’efficienza di trasfezione e che le preparazioni di DNA plasmidico non contengono inibitori od altri elementi tossici per le cellule (dati non mostrati). Dipendentemente dal saggio utilizzato, il supernatante di coltura e le cellule trasfettate sono stati analizzati a giorni diversi dalla trasfezione per:
1. Proteina capsidica (p25) rilasciata nel supernatante di coltura. 2. Numero di sincizi.
4.2.1 Analisi del contenuto di p25 nel supernatante di
coltura
Produzione e rilascio di p25 nel supernatante sono espressione diretta del livello di replicazione virale. Il dosaggio della proteina nel supernatante di coltura, effettuato con test ELISA, costituisce quindi un comodo sistema per valutare l’entità di replicazione virale.
I valori di p25 misurati a tre giorni dalla trasfezione e mostrati in tabella 4.1 mostrano due diversi andamenti. I cloni con ORF-A wild-type hanno O.D. per p25 intorno a 1.60, i cloni esprimenti ORF-A tronca hanno invece valori intorno a 0.60. Questi risultati, tra loro simili e confermati in una successiva serie di esperimenti indicano, come atteso da risultati pubblicati in precedenza (Pistello et
al., 2002), che la mutagenizzazione di ORF-A riduce notevolmente le capacità
replicative dei cloni molecolari. Il fatto che i cloni della serie Δ00 e Δ23 mostrino tra loro valori molto simili (∆00 1,600, ∆00XX 1,584, ∆00AI 1,593, ∆23 0,597, ∆23XX 0,570 e ∆23AI 0,584 nell’esperimento mostrato in Fig 4.3), indica che la mutagenizzazione in env non altera in modo apprezzabile la replicazione di FIV e permette di valutare le differenze nel contenuto di Env messo in luce con i test successivi.
4.2.2 Determinazione del numero di sincizi
Uno tra gli effetti citopatici più comuni per i virus che espongono sulla superficie esterna delle cellule infette le proteine virali, è la fusione delle membrane citoplasmatiche della cellula infetta con altre cellule circostanti. Questa fusione, chiamata sincizio, è ben visibile al microscopio ottico ed è caratterizzata da cellule giganti multinucleate. Il numero di sincizi è quindi diretta espressione del livello di Env presente sulla superficie esterna e costituisce quindi un immediato parametro di valutazione dell’efficienza del processo endocitotico. Dalle prove effettuate si è visto chiaramente che le cellule trasfettate con ∆00XX, ∆00AI, ∆23XX e ∆23AI presentavano un maggior numero di sincizi rispetto ai cloni ∆00 e
∆23 (Fig. 4.1). Per quantificare questa differenza tutti i cloni sono stati trasfettati nelle stesse condizioni e, a tre giorni dalla trasfezione, è stato contato il numero di sincizi in ogni piastra (Tabella 4.1).
Clone Sincizi p25 ∆00 11 1.600 ∆00XX 88 1.584 ∆00AI 127 1.593 ∆23 12 0.597 ∆23XX 77 0.570 ∆23AI 122 0.584
