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Introduzione
Negli ultimi anni, grazie ai progressi delle tecnologie elettroniche e delle biotecnologie, i biosensori sono diventati un interessante campo di ricerca in ambiti diversificati che vanno dalla ricerca biomolecolare, all’individuazione di malattie, alla rilevazione di contaminazioni OGM nei cibi, al monitoraggio ambientale di agenti inquinanti.
Nella letteratura scientifica, un biosensore è definito come “un dispositivo analitico compatto che incorpora un elemento sensibile di natura biologica integrato ad un trasduttore fisico-chimico. Lo scopo principale di tale dispositivo è quello di fornire un segnale elettrico, analogico o digitale, proporzionale alla concentrazione di un singolo analita o un gruppo di analiti” (Turner e altri, 1987). Quello che rende questi dispositivi interessanti per le potenziali applicazioni pratiche sono l’elevata sensibilità, l’alta selettività, i bassi costi e la possibilità di rigenerazione e riutilizzo.
Un particolare tipo di biosensori utilizza come trasduttore le bilance microgravimetriche (QCM, Quartz Crystal Microbalances), costituite da un sottile disco di quarzo munito di due elettrodi d’oro, uno dei quali funzionalizzato in modo da essere sensibile alla presenza di un analita. Dato che la frequenza di oscillazione del quarzo è proporzionale alla massa depositata sull’elettrodo funzionalizzato, tali dispositivi sono in grado di fornire misure qualitative e quantitative relative alla presenza/assenza di un analita.
Tra le molte possibili applicazioni, i biosensori possono essere impiegati nello studio dell’espressione genica. La cellula umana contiene circa 30000-38000 geni per la codifica delle proteine, ma solamente una piccola frazione di essi sono espressi in una singola cellula. Il profilo di espressione genica di una cellula stabilisce la sua unicità e diversità rispetto ad altre cellule, come il patrimonio genetico di un individuo stabilisce la sua unicità rispetto agli altri individui. Dato il crescente interesse attorno a questa branca della biologia molecolare, è molto interessante poter disporre di sistemi di misura compatti, portatili, di facile utilizzo e di basso costo.
L’obiettivo di questo lavoro di tesi, svolto presso l’Istituto di Fisiologia Clinica del CNR di Pisa, è stato quello di studiare e sviluppare un sistema integrato e automatizzato che utilizza una bilancia microgravimetrica funzionalizzata con sonde
2 oligonucleotidiche per misurare la concentrazione di RNA messaggero (mRNA) in estratti cellulari, da utilizzare in studi sull’espressione genica.
Nel primo capitolo sono descritti tecniche bioanalitiche attualmente impiegate nello studio dell’espressione dei geni e le principali caratteristiche dei biosensori (tipologie e principi di funzionamento). Il confronto di queste due tecniche di misura fa emergere vantaggi e svantaggi di ciascuna di esse.
Nel secondo capitolo, dopo una introduzione sull’effetto piezoelettrico, vengono riportate le caratteristiche impedenziometriche dei quarzi che sono state verificate sperimentalmente nel corso del lavoro di tesi mediante l’uso di un analizzatore di impedenza. In particolare, vengono messe in evidenza le risposte in ampiezza e fase del quarzo in diverse condizioni (aria, liquidi di varia viscosità), oltre al comportamento dei parametri RLC equivalenti e del fattore di merito Q.
Nel terzo capitolo, per mezzo di un’approfondita indagine della letteratura, sono confrontate le varie tecniche di misura utilizzabili per la misura delle caratteristiche delle bilance microgravimetriche. Nel corso della tesi sono stati individuati e realizzati vari circuiti oscillatori, che hanno però evidenziato problemi e limiti di funzionamento nel momento dell’esposizione di uno dei due elettrodi ad un liquido. Definite le specifiche per un circuito oscillatore per applicazioni QCM in fase liquida, è stato studiato e realizzato un circuito di cui è stato verificato sperimentalmente il funzionamento.
Il quarto capitolo illustra l’apparato sperimentale nelle sue singole parti. In esso sono descritti il circuito idraulico ed il prototipo di camera di misura realizzata durante al tesi per risolvere problemi di tenuta e di rottura dei quarzi, le caratteristiche del frequenzimetro utilizzato per la misura della frequenza di oscillazione, il software per l’automatizzazione del controllo ed acquisizione dati realizzato in ambiente LabVIEW. Nel quinto capitolo sono presentati i dati relativi alla caratterizzazione di vari tipi di quarzi e le misure effettuate per verificare il buon funzionamento del sistema. Le conclusioni, infine, riassumono i risultati del lavoro svolto, le attività in corso ed i possibili sviluppi futuri di queste ricerche.