Riassunto della tesi
Il presente lavoro di tesi si colloca nell’ambito dello sviluppo di nuovi biomateriali per la microfabbricazione di scaffold polimerici nel settore dell’Ingegneria Tissutale. L’Ingegneria Tissutale è un nuovo settore di ricerca multidisciplinare che ha lo scopo di riprodurre vari tessuti biologici basandosi su principi ingegneristici, biologici, chimici e medici.
La riproduzione di tessuti biologici richiede numerose ricerche sia nella fase di sviluppo che nella ricerca di nuovi biomateriali utilizzati come supporto per la ricrescita tissutale, che nella fase di fabbricazione di microstrutture a geometria controllata e loro caratterizzazione chimico-fisica e meccanica.
Il presente lavoro di tesi si focalizza sullo sviluppo di nuovi biomateriali utilizzati come supporto per la ricrescita cellulare e precisamente sulla loro caratterizzazione fisico-meccanica.
E’ importante lo studio delle proprietà meccaniche dei biomateriali in quanto esse influenzano notevolmente la ricrescita cellulare ed è necessario che le proprietà meccaniche dei supporti e dei tessuti da riprodurre siano paragonabili in modo tale che le cellule presentino un sito di adesione con caratteristiche meccaniche simili a quello originario in modo da attuare le loro attività cellulari.
Il seguente lavoro è stato organizzato in due fasi:
1. la prima fase consiste nella caratterizzazione fisico-meccanica di film di miscele a base di chitosano e gelatina, ottenuti con la tecnica del casting.
2. la seconda fase consiste nella caratterizzazione fisico-meccanica di scaffold polimerici di poliuretano di sintesi, ottenuti con la tecnica della Microsiringa Assistita dalla Pressione (PAM), una tecnica di microdeposizione.
La prima fase è organizzata in più stadi:
1) preparazione dei film a base di chiosano e gelatina; 2) prove di swelling e di dissoluzione;
3) prove di sforzo-deformazione; 4) prove di creep-relaxation.
Analizziamo in dettaglio questi stadi.
La preparazione dei film a base di chitosano e gelatina è stata realizzata con la tecnica del casting.
I film per casting sono stati ottenuti da una soluzione delle miscele di chitosano e gelatina per allontanamento del solvente. Le miscele sono state sottoposte ad un trattamento di reticolazione mediante due metodi alternativi: una reticolazione termica, effettuata tramite trattamento in stufa da vuoto, e una reticolazione chimica usando come agente reticolante la genipina. In particolare la reticolazione chimica è stata effettuata con due tecniche differenti, o immettendo la genipina direttamente nella soluzione di preparazione delle miscele, o trattando i film di miscele ottenuti in precedenza con una soluzione in tampone fosfato di genipina. Da un confronto delle due tecniche, sulla base delle prove di swelling, è stato possibile scegliere quale metodo di reticolazione chimica risulta più efficace: il primo segnalato.
Le prove di swelling e di dissoluzione servono per valutare le variazioni in peso dei biopolimeri quando questi entrano in contatto con soluzioni che simulano i terreni di coltura con cui le colture cellulari vengono solitamente eseguite. Le prove di swelling sono state realizzate pesando i campioni secchi, mettendoli in un bagno di PBS ed effettuando prelievi e pesate dei campioni a tempi determinati. La dissoluzione è stata valutata essiccando i campioni prelevati per lo swelling e pesando questi una volta essiccati.
Le prove stress-strain hanno lo scopo di valutare l’andamento dello sforzo dei campioni in funzione della loro deformazione e di valutare i moduli di Young dei
biopolimeri in esame. Tali prove sono state effettuate con l’ausilio di un dispositivo che si trova presso il Centro di Ricerca Interdipartimentale “E. Piaggio”: un trasduttore isotonico di posizione realizzato secondo il modello 7006 della Ugo Basile Biological Research Apparatus.
In questa fase si è ricercato un modello fisico-matematico predittivo per il calcolo dei moduli di Young di miscele polimeriche bicomponente che descrivesse i moduli di Young dei biopolimeri in esame. Il modello trovato in letteratura che concordava con i nostri dati sperimentali è il modello Equivalent Box Model (EBM) sviluppato da Kolaric.
Le prove di creep-relaxation hanno lo scopo di valutare il comportamento viscoelastico dei biopolimeri studiati. Tali prove sono state effettuate con l’ausilio del trasduttore isotonico di posizione utilizzato per le prove stress-strain. In questa fase è stato individuato un modello fisico-matematico che descrivesse il comportamento viscoelastico dei materiali studiati. Tale modello è definito come solido lineare
standard a tre parametri.
Tutte queste prove sono state effettuate sui biopolimeri reticolati termicamente e su quelli reticolati chimicamente, confrontandone i risultati e valutando l’effetto delle due tipologie di reticolazione.
Le prove di stress-strain e di creep-relaxation sono state ripetute sui campioni reticolati termicamente e precedentemente sottoposti a bagno in terrene di coltura, per valutare le effettive proprietà meccaniche esibite dal materiale durante i test di adesione cellulare.
La seconda fase del presente lavoro, consistente nella caratterizzazione fisico-meccanica di scaffold polimerici di poliuretano di sintesi, ottenuti con la PAM, si sviluppa in questi step:
1) caratterizzazione della macchina in funzione del materiale utilizzato; 2) deposizione degli scaffold polimerici;
4) prove di creep-relaxation.
Analizziamo in dettaglio gli stadi di questa fase.
La caratterizzazione della macchina in funzione del materiale utilizzato, ha riguardato le prove di deposizione del poliuretano allo scopo di determinare i parametri operativi con cui deporre le microstrutture. La macchina utilizzata è la PAM che si trova presso il Centro di Ricerca Interdipartimentale “E. Piaggio”. Da notare che l’unico materiale, tra quelli utilizzati, ad essere impiegato per questa tecnica di microdeposizione è stato il poliuretano di sintesi in quanto è l’unico solubile in un solvente estremamente volatile, come il cloroformio (quello utilizzato in questo lavoro).
La deposizione di scaffold polimerici ha permesso di ottenere strutture tridimensionali a tre strati sovrapposti con differente geometria della cella unitaria. Le geometrie ottenute sono quella quadrata, esagonale ed ottagonale.
Le prove di stress-strain sono state effettuate con il trasduttore isotonico di posizione suddetto e hanno avuto lo scopo di valutare l’andamento dello sforzo dei campioni in funzione della loro deformazione e di valutare i moduli di Young, in funzione della differente geometria della cella unitaria. E’ stato effettuato anche un confronto tra le proprietà meccaniche degli scaffold polimerici di poliuretano e quelle del poliuretano in forma di film ottenuto per casting.
Le prove di creep-relaxation sono state effettuate con lo scopo di valutare il comportamento viscoelastico delle microstrutture in funzione della geometria della cella unitaria e di metterlo a confronto con quello del film per casting di poliuretano.
Le diverse prove descritte hanno mostrato risultati interessanti. Le prove di swelling hanno mostrato che le miscele reticolate termicamente hanno un elevato potere
rigonfiante anche a brevi tempi di prova, e che il comportamento dello swelling delle miscele è legato (in maniera non lineare) alla composizione delle miscele. Dalle prove di dissoluzione si è visto che i materiali tendono a sciogliersi nella soluzione utilizzata, con percentuali di perdita di peso che aumentano con l’aumentare del contenuto di gelatina nella miscela. Queste prove sono state effettuate su campioni sottoposti a reticolazione chimica con genipina, condotta o in fase di preparazione dei film (reticolazione in soluzione) o sui film per casting già preparati (reticolazione in tampone fosfato). Dai risultati si è concluso che con la reticolazione chimica in soluzione si ottengono materiali con percentuali di rigonfiamento e di perdita di peso inferiori rispetto a quelle dei materiali reticolati chimicamente in soluzione tampone. Per questo motivo si è scelto di reticolare i materiali attraverso un trattamento
chimico in soluzione. Infine con le prove di swelling e di perdita di peso si sono analizzate le due diverse tipologie di reticolazione: quella termica e quella chimica in soluzione. Si può affermare che la reticolazione chimica ha dato migliori risultati di quella termica. Questo vuol dire che il rigonfiamento e la dissoluzione dei materiali sottoposti a reticolazione chimica in soluzione risultano inferiori in confronto a quelli dei rispettivi materiali reticolati termicamente.
Dopo aver effettuato le prove stress-strain si può concludere che tutti i materiali analizzati hanno un comportamento elastico, con andamenti lineari delle curve sforzo-deformazione.
Inoltre analizzando i moduli di Young si nota che i materiali reticolati chimicamente presentano valori più alti di quelli dei rispettivi materiali reticolati termicamente. Sempre in riferimento ai moduli di Young delle miscele, sia quelle reticolate
chimicamente che quelle reticolate termicamente, si vede che hanno un andamento crescente in funzione del contenuto di gelatina. Si è notato che la legge di additività dei moduli di Young delle miscele bicomponente in funzione della composizione non è valida ed è per questo che si è adottato un modello predittivo particolare:
l’Equivalent Box Model (EBM) sviluppato da Kolaric che si adattava
all’interpretazione dei dati sperimentali. L’individuazione di un modello predittivo affidabile può permettere in futuro di determinare a priori la composizione chimica di una miscela che presenti le caratteristiche meccaniche adatte all’applicazione
specifica.
Sono state effettuate le prove di stress-strain sui campioni reticolati termicamente successivamente all’immersione in un mezzo di coltura cellulare. I materiali dopo questo trattamento presentano un comportamento di tipo plastico come indicato dall’andamento non lineare delle curve stress-strain. Si è registrato inoltre una sensibile diminuzione dei moduli di Young, con un andamento decrescente all’aumentare del contenuto di gelatina in miscela.
Dopo aver effettuato le prove di creep-relaxation su tutti i materiali, si può
concludere che essi hanno un andamento della deformazione in funzione del tempo paragonabile a quello di un solido lineare standard a tre parametri.
Dall’analisi di questi tre parametri si può concludere che i materiali reticolati chimicamente hanno un comportamento puramente viscoelastico meno marcato rispetto a quello dei materiali reticolati termicamente, ed inoltre la velocità di recupero dei primi è minore rispetto a quella dei secondi.
Nella seconda parte della Tesi si sono analizzati film ottenuti per casting e scaffold tridimensionali ottenuti tramite deposizione con Microsiringa Attivata dalla Pressione (PAM) in poliuretano a blocchi biodegradabile. Su questi campioni sono state
condotte le prove stress-strain e di creep-relaxation.
Dalle prove stress-strain risulta che il film presenta un andamento lineare mentre gli scaffold presentano due tratti rettilinei a diverse percentuali di deformazione: il primo tratto è legato alle proprietà meccaniche derivanti dalla geometria (quadrata,
esagonale e ottagonale) della cella unitaria dello strato mentre il secondo tratto è dovuto al tipo di materiale utilizzato.
Dalle prove di creep-relaxation si è notato che anche questi materiali hanno un andamento della deformazione in funzione del tempo paragonabile a quello di un solido lineare standard a tre parametri. Si può affermare che gli scaffold ottenuti per microdeposizione hanno un comportamento puramente viscoelastico meno marcato rispetto a quello del film ottenuto per casting, ed inoltre la velocità di recupero dei primi è minore rispetto a quella del secondo. Si nota un’influenza nelle proprietà meccaniche in relazione alla geometria della cella unitaria dello scaffold.
Infine sono stati effettuati dei confronti tra i moduli di Young dei materiali studiati e i moduli di Young dei tessuti biologici per determinare se risultano adatti per la rigenerazione dei tessuti biologici ed in particolare per quale tipo di tessuto.
