e P7 (9 ± 2% e 14 ± 3% dei valori nell’adulto) per crescere in seguito. Da questi dati

IV.1 Effetto della diminuzione del tono inibitorio sulla plasticit` a visiva di animali adulti

Negli ultimi anni numerosi lavori hanno suggerito un ruolo fondamentale del sis- tema inibitorio corticale nei fenomeni di plasticit`a visiva. La circuiteria GABAergica, infatti, si sviluppa in V1 molto pi` u lentamente rispetto a quella eccitatoria come testi- moniato dai livelli di espressione del GAD (Dupuy and Houser, 1996; Wolff et al., 1984), dalla sua localizzazione sinaptica, dal numero di sinapsi GABAergiche e dall’espressione di proteine leganti calcio negli interneuroni; tutti questi fattori maturano durante le prime settimane di vita e raggiungono i livelli dell’individuo adulto alla fine del periodo critico. Un ulteriore dato a conferma della maturazione dilazionata del sistema inibi- torio proviene dall’analisi dello sviluppo dei neuroni esprimenti parvalbumina. Questi sono stati identificati come cellule a canestro che innervano preferenzialmente il soma ed il segmento prossimale degli assoni di cellule piramidali all’interno dello strato IV (Di Cristo et al., 2004). L’espressione di parvalbumina nella corteccia visiva di roditori non inizia fino a P21 ed il numero, la grandezza, l’arborizzazione neuritica e l’inner- vazione sinaptica dei neuroni esprimenti questa proteina raggiunge i livelli dell’adulto solo nella quarta settimana postnatale (Del Rio et al., 1994).

Inoltre, `e stato osservato che il rilascio di GABA endogeno `e molto basso a P1

e P7 (9 ± 2% e 14 ± 3% dei valori nell’adulto) per crescere in seguito. Da questi dati

appare, quindi, evidente che la circuiteria inibitoria `e soggetta ad una maturazione che

procede lungo tutto il periodo critico per concludersi alla sua fine.

Una recente ipotesi suggerisce che, durante lo sviluppo, il tono inibitorio su- peri due soglie funzionali all’interno della corteccia visiva. La prima avrebbe un ruolo permissivo rispetto all’instaurarsi di fenomeni plastici, la seconda, invece, causerebbe la chiusura del periodo critico (Feldman, 2000). Tali funzioni potrebbero essere sem- plicemente assunte tramite il modellamento temporale degli input sinaptici laddove un aumento moderato dell’inibizione porterebbe ad una maggiore possibilit`a di dis- criminazione tra input sincroni ed asincroni, mentre un’ulteriore maturazione del tono GABAergico potrebbe rendere difficile l’induzione di cambiamenti a lungo termine nel- l’efficacia sinaptica.

I nostri dati indicano che la funzione non permissiva del sistema inibitorio non si esaurisce con il periodo critico; al contrario, esso continua ad assolvere al suo compito anche in et`a adulta. Infatti, utilizzando due antagonisti della funzione GABAergica, come l’MPA e la picrotossina, i neuroni corticali di animali adulti si sono mostrati nuovamente sensibili agli effetti della deprivazione monoculare.

I due farmaci hanno provocato lo stesso risultato pur agendo in maniera com- pletamente diversa; infatti, mentre l’MPA `e un antagonista del glutammato sul GAD (azione presinaptica), la picrotossina `e un antagonista non competitivo del recettore GABA

(azione postsinaptica). Questa `e stata assunta come prova del fatto che l’au- mento della plasticit`a fosse dovuto specificamente all’effetto sul sistema inibitorio.

Una possibile ed immediata obiezione al nostro studio potrebbe essere che l’ab-

bassamento del tono inibitorio abbia semplicemente smascherato sinapsi sottosoglia

anzich´e determinare modifiche plastiche pi` u profonde. Tale osservazione, peraltro, tro-

verebbe riscontro in evidenze sperimentali ottenute in corteccia visiva e motoria di

animali adulti (Sillito et al., 1980; Jacobs and Donoghue, 1991). Tuttavia, nel caso in

cui questa considerazione fosse vera, ci si aspetterebbe di trovare un grosso aumento

di cellule binoculari. Questo non si verifica n´e negli animali deprivati, che mostrano

uno spostamento della distribuzione verso l’occhio aperto, n´e in quelli non deprivati

che non mostrano alcun cambiamento rispetto alla normalit`a. L’unico effetto trovato

che suggerisce uno smascheramento di input sinaptici sotto soglia `e l’allargamento dei campi recettivi (che `e precisamente ci`o che accade in corteccia visiva e motoria dopo blocco dell’inibizione corticale); tuttavia, esso `e presente sia in animali deprivati che in animali non deprivati mostrandosi, in questo modo, non correlabile con la deprivazione monoculare.

Un altro dato a sfavore della teoria dello “smascheramento” `e quello secondo cui gli effetti della deprivazione monoculare sono ancora individuabili alla fine del trat- tamento farmacologico, quando le propriet`a funzionali dei neuroni di V1 (compresa la larghezza dei campi recettivi) sono rientrate nella norma.

Resta da chiarire, quindi, quale sia il vero meccanismo che porta dalla riduzione del tono GABAergico all’instaurazione di fenomeni plastici. Una prima ipotesi si av- vale di interessanti osservazioni riguardanti il ruolo della maturazione della circuiteria inibitoria nei fenomeni di plasticit`a sinaptica. ` E stato dimostrato, infatti, che la possi- bilit`a di induzione di LTP negli strati II/III tramite stimolazione della materia bianca, declina parallelamente alla suscettibilit`a verso deprivazione monoculare e tale forma di potenziamento a lungo termine pu`o essere indotta in animali pi` u adulti grazie all’uso di antagonisti del recettore GABA

(Kirkwood and Bear, 1994a). Inoltre, nel nostro stesso laboratorio `e stato dimostrato che l’uso di MPA o picrotossina in vivo, permette il potenziamento a lungo termine di neuroni negli strati II/III tramite la stimolazione di materia bianca anche in fettine provenienti da animali oltre P80 (dati non pubbli- cati).

Questi risultati, insieme ad altri pi` u recenti che dimostrano come gli strati pi` u

superficiali siano quelli pi` u sensibili al rimodellamento plastico sia nel periodo critico

(Trachtenberg et al, 2000) che nell’adulto (Darian-Smith and Gilbert, 1995), sembrano

confermare l’ipotesi del “cancello di plasticit`a” (Kirkwood et al., 1995; Rozas et al.,

2001) secondo cui i neuroni inibitori impedirebbero l’instaurarsi di fenomeni plastici

all’interno degli strati II/III opponendosi all’attivit`a afferente. Infatti, le sinapsi in

quest’area ricevono gli input retinici tramite le cellule stellate eccitatorie dello strato

IV che sono i principali bersagli delle proiezioni talamiche. Lo sviluppo completo degli

interneuroni GABAergici potrebbe ridurre questo scambio di informazioni tra le due aree corticali chiudendo la fase in cui i circuiti sono sensibili alle modifiche operate dall’esperienza.

La teoria omosinaptica `e utilizzata in alternativa alla teoria eterosinaptica del- la competizione tra input provenienti dai due occhi per spiegare lo spostamento delle distribuzioni di dominanza oculare verso l’occhio aperto di animali monocularmente de- privati. Essa prevede non solo il potenziamento delle sinapsi pi` u attive in V1, ma anche un indebolimento di quelle sottoposte ad un livello minore di attivazione. L’occorrenza alternativa di LTP o LTD sarebbe dovuta oltre che al pattern di input che raggiun- gono la sinapsi, anche al livello generale di attivazione della stessa. Secondo questa teoria, infatti, gli input eccitatori presinaptici porterebbero ad un rinforzo oppure ad un indebolimento dell’efficacia sinaptica a seconda del fatto che il loro livello di atti- vit`a sia maggiore oppure minore di un certo valore chiamato “soglia di modificazione”

(θ

). Il θ

non sarebbe un valore fissato ma dipenderebbe strettamente dall’attivit`a postsinaptica (Bienenstock et al.,1982). Inoltre, `e stato proposto che la soglia di modi- ficazione corrisponda al livello di attivazione dei recettori NMDA sufficiente ad indurre LTP (Bear et al.,1987); ne deriva l’assioma secondo cui un’attivit`a input che non riesce ad attivare un numero abbastanza alto di recettori NMDA, provochi LTD nella cellula postsinaptica.

Questa idea `e stata testata nella regione CA1 dell’ippocampo (Dudek and Bear,

1992; Dudek and Bear, 1993). Infatti, `e stato dimostrato che la ripetitiva attivazione

delle collaterali di Schaffer in vitro alla frequenza di 1 − 3 Hz, causa una diminuzione

persistente nell’efficacia sinaptica senza segni di recupero per oltre 1 ora. Questa forma

di LTD si `e dimostrata specifica per la via stimolata e dipendente dall’attivazione di

recettori NMDA; lavori successivi hanno provato, inoltre, che essa richiede un aumen-

to dei livelli postsinaptici di Ca2+ durante il condizionamento (Mulkey and Malenka,

1992). Questi dati, quindi, suggeriscono un modello in cui lo stato di coincidenza

tra l’attivit`a pre- e postsinaptica in CA1 viene convertito tramite il recettore-canale

NMDA voltaggio dipendente in un segnale Ca2+ postsinaptico che provoca LTP quan-

do supera un valore critico (la soglia di modificazione) mentre porta a LTD quando cade al di sotto di tale livello. Poich´e una delle fasi iniziali nello stabilirsi di LTP

`e l’attivazione di chinasi, si potrebbe pensare che bassi livelli di Ca2+ portino a re- clutamento di fosfatasi che agiscono sugli stessi o su differenti bersagli. In accordo con questa ipotesi `e stato dimostrato sia nell’ippocampo (Mulkey et al., 1993) che in corteccia visiva (Kirkwood and Bear, 1994b) che l’inibizione di fosfatasi 1 e 2a pu`o bloccare l’induzione omosinaptica di LTD.

Detto ci`o, `e interessante sottolineare il fatto che una diminuzione dell’inibizione porterebbe ad aumento della soglia di modificazione facilitando fenomeni di LTD per le vie meno attive guidate dall’occhio chiuso e fenomeni di LTP per gli input provenienti dall’occhio non deprivato.

Nonostante il fascino di questa teoria, i cambiamenti osservati durante la depri- vazione monoculare, non possono essere spiegati esclusivamente da modifiche nell’effi- cacia sinaptica. Infatti, oltre alle ben note conseguenze fisiologiche sono presenti anche modifiche pi` u profonde che riguardano la morfologia neuronale. L’ipotesi sinaptica piuttosto che essere scartata, pu`o venire arricchita dalla considerazione secondo cui, a seguito dell’entrata di calcio all’interno della cellule e conseguentemente alla cascate di eventi molecolari ad essa collegate, si potrebbero verificare variazioni nel pattern di espressione genica che porterebbero a trasformazioni pi` u profonde dell’organizzazione circuitale.

IV.2 Interazione tra sistema inibitorio e matrice extra- cellulare

Numerose sono state le ricerche finalizzate a determinare le molecole implicate

nella plasticit`a visiva. Un candidato interessante a questo proposito si `e dimostrato

essere la matrice extracellulare. In particolare, alcuni sui componenti, conosciuti sotto

il nome di condroitin solfato proteoglicani (CSPG), hanno mostrano un ruolo inibitorio

verso fenomeni di rimodellamento circuitale, rigenerazione assonale e plasticit`a sia nel periodo critico che in et`a adulta. Recentemente, `e stato provato che la digestione enzi- matica di tali molecole pu`o rendere nuovamente sensibili agli effetti della deprivazione monoculare, neuroni di V1 appartenenti ad animali adulti (Pizzorusso et al., 2002).

Il meccanismo di azione per mezzo del quale i CSPG opererebbero tali azioni in- ibitorie non `e ancora noto. Di recente, tuttavia, `e stato proposto un ruolo nel sequestro di fattori trofici, nella stabilizzazione di connessioni cellulari o nell’abbassamento del carattere permissivo di sostanze come le laminine (Carulli et al., 2005). Questi effetti non si escludono a vicenda e dipendono dall’estrema versatilit`a con cui CSPG differenti sono in grado di legare molecole diverse all’interno della matrice extracellulare.

Visto il carattere non permissivo di tali sostanze rispetto all’instaurarsi di plas- ticit`a, appare interessante chiarire quali siano i meccanismi che portano alla loro ag- gregazione e disfacimento. Durante lo sviluppo postnatale i CSPG si accumulano progressivamente attorno al soma ed ai dendriti di determinati neuroni, contribuendo alla formazione delle cosiddette reti perineuronali (PNN) (Hockfield et al., 1990; Celio et al., 1998). Inoltre, la formazione delle PNN nella corteccia visiva coincide con la chiusura del periodo critico mentre l’allevamento al buio ritarda la loro comparsa. Un possibile candidato ad interagire con la formazione di PNN potrebbe essere il sistema inibitorio. Infatti, `e stato dimostrato che le reti perineuronali circondano principal- mente in corteccia interneuroni inibitori esprimenti parvalbumina e la subunit`a Kv3.1 del canale potassio. Ricordiamo che tali neuroni si identificano con le cellule a canestro, considerate importanti nella modulazione delle risposte piramidali alle afferenze senso- riali provenienti dal talamo (Wegner et al., 2003). Questi dati sono stati confermati dal nostro studio laddove `e strato mostrato che la maggior parte di cellule attorniate da reti perineuronali presenta contemporaneamente una marcatura per la parvalbumina.

Un altro risultato importante che emerge da questo lavoro `e che l’interferenza

con il sistema inibitorio determina una riduzione di reti perineuronali visibili. Queste

sono state evidenziate grazie all’uso di una marcatore aspecifico per le catene laterali

di GAG dei CSPG (lectina WFA) e tramite due anticorpi monoclonali diretti specifi-

camente verso epitopi della proteina core di aggrecan (CAT-315) e neurocan. I nostri dati immunoistochimici sono in accordo con studi precedenti che hanno evidenziato una marcatura molto debole per neurocan nella corteccia cerebrale adulta (Bruckner et al.,2000) e, al contrario, una marcatura perfettamente evidenziabile rispetto allo sfondo per quanto riguarda aggrecan (Matthews et al., 2002). La WFA, essendo una molecola che lega aspecificamente catene di carboidrati, ha permesso di evidenziare un’alta densit`a di cellule all’interno del campo di acquisizione delle immagini.

L’effetto della riduzione dell’inibizione sul disfacimento delle reti perineuronali si `e mostrato essere non uniforme tra i diversi sottotipi di CSPG. Infatti, esso `e stato evidenziato per la marcatura su aggrecan ma non per quella su neurocan. Questo dato sembra suggerire che la diversa composizione dei CSPG abbia effettivamente un riscon- tro a livello funzionale. Inoltre, `e interessante notare che in un lavoro precedente, la riduzione della marcatura su aggrecan `e stata correlata con gli effetti della deprivazione monoculare durante il periodo critico (Hockfield et al., 1990).

Resta da analizzare la questione di come una diminuita inibizione corticale possa

portare alla riduzione di reti perineuronali attorno ai neuroni di V1. ` E stato dimostrato

che l’aumento dell’attivit`a elettrica porta ad un maggiore rilascio di metalloproteasi al-

l’interno dello spazio extracellulare (Gualandris et al., 1996). In particolare, numerosi

studi si sono concentrati sul ruolo nei meccanismi di plasticit`a cerebrale del “tissue

plasminogen activator” (tPA), una proteasi extracellulare che converte plasminogeno

in plasmina. Per esempio, `e stato dimostrato che il tPA `e uno dei geni precoci espressi

durante l’induzione di LTP nell’ippocampo di ratto (Qian et al., 1993) e nelle cellule

del Purkinje cerebellari dopo apprendimento motorio (Seeds et al., 1995). Allo stesso

tempo, l’LTP ippocampale risulta fortemente compromesso in topi che mancano del

gene per il tPA (Frey et al., 1996; Huang et al., 1996). Inoltre, `e stato provato che

questa metalloproteasi contribuisce alle dinamiche plastiche delle spine dendritiche in

seguito a deprivazione monoculare tramite degradazione della matrice extracellulare

(Oray et al., 2004; Hensch et al., 2004). Questo ruolo sembra chiaro nel periodo criti-

co mentre ci sono discordanze riguardo la sua occorrenza nell’adulto. Ad ogni modo,

data la variabilit`a di metalloproteasi secrete in seguito a depolarizzazione prolungata, possiamo supporre che la via molecolare del tPA non sia l’unica responsabile della dis- gregazione della matrice extracellulare. Questo effetto, tra l’altro, potrebbe essere solo uno dei tanti meccanismi facilitatori verso la plasticit`a attivati dopo rilascio di pro- teasi. Infatti, `e stato dimostrato che le stesse molecole agiscono sulle proneurotrofine determinando il passaggio alla forma matura dei fattori neurotrofici.

Dal nostro studio `e emerso, inoltre, che l’effetto dell’MPA e della picrotossina non `e dose dipendente; al contrario, `e stato dimostrato che sia lo spostamento delle colonne di dominanza oculare in seguito a deprivazione monoculare, sia la disgregazione delle reti perineuronali, non si verificano ad alte dosi dei due farmaci. La spiegazione di tale osservazione richiama meccanismi complessi poich´e l’eccessiva diminuzione del tono GABAergico determina la completa perdita della funzioni neuronali causando il sorgere di fenomeni epilettici. All’interno di questi si verificano eventi complessi di morte neuronale e crescita di nuovi contatti sinaptici ed il ruolo dei CSPG e delle pro- teasi non `e ancora stato chiarito.

In conclusione, i risultati ottenuti in questo lavoro possono essere interpretati

richiamando sia meccanismi di modificazione sinaptica che espressione differenziale di

molecole. Le due ipotesi sono perfettamente compatibili e si arricchiscono a vicenda

laddove venga considerato che cambiamenti nell’efficacia sinaptica potrebbero essere ac-

compagnati da variazioni nell’espressione e trascrizione genica. Indagini future potreb-

bero essere volte al chiarimento del ruolo del tPA o di altre metalloproteasi all’interno

di questo tipo di plasticit`a, oppure all’approfondimento degli effetti elettrofisiologici e

molecolari causati dalla profonda interferenza con il sistema inibitorio.