RISULTATI
Capitolo 8 RISULTATI
8.1 Incremento del peso corporeo e peso relativo del fegato
(vedi materiali e metodi) e Figura 16) non risultano esserci differenze significative tra i tre gruppi sperimentali.
Figura 16: Incremento ponderale. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo.
Al momento del sacrificio degli animali è stato inoltre pesato ciascun fegato (per il gruppo di controllo 4,88±1,20 g; per il gruppo a dieta iperlipidica 5,91±1,11 g; per il gruppo a dieta iperlipidica e trattato con la miscela batterica 5,89±0,80) e, sulla base del
17, nel gruppo trattato con dieta iperlipidica si ha un aumento significativo di questo parametro, rispetto al controllo. Nel gruppo a cui è stata somministrata la miscela batterica si ha una lieve diminuzione rispetto al gruppo a sola dieta iperlipidica.
Figura 17: Peso relativo del fegato. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo. *p < 0,05 rispetto al controllo.
8.2 Parametri ematici
Su ciascun campione di sangue sono stati dosati diversi parametri ematici.
Le figure 18 e 19 sono relative rispettivamente ai livelli di alanina aminotransferasi (ALT) e aspartato aminotransferasi (AST). Per entrambi i parametri il trattamento con dieta iperlipidica comporta un aumento significativo rispetto al gruppo di controllo. La somministrazione della miscela batterica è associata ad una diminuzione, sebbene non significativa, dei valori ottenuti con la sola dieta iperlipidica.
Figura 18: Dosaggio di ALT ematiche. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo. *p < 0,05 rispetto al controllo.
Figura 19: Dosaggio di AST ematiche. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo. *p < 0,05 rispetto al controllo.
totale, HDL, LDL e trigliceridi. La figura 20 mostra un incremento simile ed altamente significativo del colesterolo ematico in entrambi i gruppi di trattamento rispetto al gruppo di controllo.
Figura 20: Dosaggio del colesterolo ematico. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo. **p < 0,01rispetto al controllo, ***p < 0,001 rispetto al
controllo.
Il dosaggio delle frazioni HDL (Figura 21) e LDL (Figura 22) rivela un aumento simile ed altamente significativo in entrambi i gruppi di trattamento, rispetto al controllo.
Figura 21: Dosaggio delle HDL ematiche. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo. **p < 0,01; ***p < 0,001rispetto al controllo.
Figura 22: Dosaggio delle LDL ematiche. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo. **p < 0,01rispetto al controllo.
Per quanto riguarda i livelli dei trigliceridi ematici si ha un aumento significativo solo nel gruppo di ratti iperlipidici a cui è stata somministrata la miscela batterica, rispetto al controllo (Figura 23).
Figura 23: Dosaggio dei trigliceridi ematici. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo. *p < 0,05 rispetto al controllo.
Infine, la figura 24 mostra un incremento simile ed altamente significativo del glucosio ematico, sia nel gruppo trattato con la dieta iperlipidica che nel gruppo a cui è stata somministrata la miscela batterica, rispetto al controllo.
Figura 24: Dosaggio del glucosio ematico. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo. **p < 0,01rispetto al controllo.
8.3 Glutatione ridotto e perossidazione lipidica
Sui campioni di fegato sono stati effettuati il dosaggio di glutatione ridotto (Figura 25) e la misurazione dello stress ossidativo mediante saggio della perossidazione lipidica (Figura 26). I trattamenti provocano una riduzione del contenuto di GSH rispetto al controllo, significativa solo nel gruppo a cui è stata somministrata la miscela batterica, ma non influenzano in maniera significativa i livelli di perossidazione lipidica.
CTR IPD IPD+B
0 10 20 30 40
*
Figura 25: Dosaggio del g omogenato epatico. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo.
*p < 0,05 rispetto al controllo.
CTR IPD IPD+B
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Figura 26: Perossidazione lipi omogenato epatico. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo.
8.4 Contenuto di lipidi nel fegato
Come mostrato dalla figura 27, si ha un incremento simile ed altamente significativo del contenuto di lipidi epatici sia nel gruppo di ratti trattati con dieta iperlipidica che nel gruppo a cui è stata somministrata la miscela batterica, rispetto a quello di controllo.
Figura 27: Lipidi determinati nel tessuto epatico. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo. ***p < 0,001rispetto al controllo.
8.5 Attività degli enzimi microsomiali
Come -1
(HO-1) e varie attività citocromo P450-dipendenti. É inoltre stata dosata la concentrazione del P450.
Eme ossigenasi 1
La figura 28 -1 non viene influenzata significativamente dai due diversi trattamenti.
Figura 28: Attività HO-1 nelle frazioni microsomiali epatiche. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo.
Citocromo P450
Dal dosaggio del citocromo P450 (Figura 29) emerge invece che la proteina, rispetto al valore di controllo, aumenta in maniera significativa sia nel gruppo a dieta iperlipidica che nel gruppo trattato con i batteri, ma non differisce significativamente fra i due gruppi trattati.
Figura 29: Dosaggio del CYP nelle frazioni microsomiali epatiche. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo. *p < 0,05; ***p < 0,001
rispetto al controllo.
Vista la differenza nel contenuto di P450, le attività P450-dipendenti sono state analizzate sia in relazione al contenuto proteico dei microsomi che in rapporto alla concentrazione di P450.
ECOD
La figura 30 -O-deetilasi (ECOD),
dipendente da
proteico dei campioni (Figura 30a) aumenta in maniera altamente significativa nel gruppo trattato con dieta iperlipidica rispetto al gruppo di controllo. Nel gruppo a cui è stata somministrata la miscela batterica, nonostante il valore risulti significativamente aumentato rispetto al controllo, si assiste ad una diminuzione significativa rispetto al gruppo a dieta iperlipid
(Figura 30b) essa aumenta in maniera significativa nel secondo gruppo rispetto al controllo, mentre nel terzo gruppo torna a valori di controllo.
Figura 30: Attività ECOD nelle frazioni microsomiali epatiche. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo, ed espressi in rapporto al contenuto
proteico dei microsomi (a) o al contenuto di CYP (b). *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 rispetto al controllo.
°p < 0,05; °°p < 0,01 rispetto a dieta iperlipidica.
EROD
-O-deetilasi (EROD), dipendente principalmente dal CYP1A1, non viene influenzata significativamente dai due diversi trattamenti (Figura 31).
Figura 31: Attività EROD nelle frazioni microsomiali epatiche. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo, ed espressi in rapporto al contenuto
proteico dei microsomi (a) o al contenuto di CYP (b).
AnH e pNFH
sia che la p-
idrossilasi, dipendente in minima parte anche dalle isoforme 1A1 e 1A2, risulta aumentata in maniera simile e significativa nei ratti sottoposti ai due diversi trattamenti (Figura 32 funzione del contenuto proteico dei campioni che rapportandola al contenuto di P450 degli stessi.
Anche la p-nitrofenolo idrossilasi, più specifica per il 2E1, risulta similmente aumentata nei due gruppi di trattamento rispetto al controllo (Figura 33). Questo aumento è
(Figura 33a), ma non rispetto al contenuto di P450, suggerendo un ridotto contenuto del aumentata popolazione dei citocromi.
Figura 32: Attività AnH nelle frazioni microsomiali epatiche. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo, ed espressi in rapporto al contenuto
proteico dei microsomi (a) o al contenuto di CYP (b). *p < 0,05; **p < 0,1; ***p < 0,001 rispetto al controllo.
Figura 33: Attività p-NFH nelle frazioni microsomiali epatiche. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo, ed espressi in rapporto al contenuto
proteico dei microsomi (a) o al contenuto di CYP (b). *p < 0,05 rispetto al controllo.
BQD
Dalla figura 34a zilossichinolina debenzilasi (BQD),
catalizzata dalle isoforme della sottofamiglia dei CYP3A, aumenta in maniera significativa solo nel gruppo trattato con dieta iperlipidica. La stessa attività non varia in maniera significativa se calcolata in relazione al contenuto di CYP dei campioni (Figura 34b).
Figura 34: Attività BQD nelle frazioni microsomiali epatiche. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo, ed espressi in rapporto al contenuto
proteico dei microsomi (a) o al contenuto di CYP (b). **p < 0,01 rispetto al controllo.
Testosterone idrossilasi La figura 35
P450. Di particola prodotto dalla sottofamiglia dei
prodotto dalla famiglia CYP
Rispetto ai valori di controllo nei due gruppi di trattamento si nota un aumentato trend
nel gruppo trattato con la miscela batterica, in entrambi i tipi di analisi. La riduzione del
35b).
Figura 35: Attività testosterone idrossilasi nelle frazioni microsomiali epatiche. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo, ed espressi in
rapporto al contenuto proteico dei microsomi (a) o al contenuto di CYP (b).
*p < 0,05; **p < 0,01 rispetto al controllo.
8.6 Attività degli enzimi citosolici
Le figure 36 e 37 riportano rispettivamente i risultati relativi ai dosaggi enzimatici di
aumentata in modo simile e significativo sia nei ratti trattati con dieta iperlipidica che nel gruppo trattato con la
della glutatione perossidasi invece diminuisce drasticamente e in maniera analoga a seguito dei due trattamenti.
Figura 36: Attività glutatione reduttasi nelle frazioni citosoliche epatiche. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo.
**p < 0,01 rispetto al controllo.
Figura 37: Attività glutatione perossidasi nelle frazioni citosoliche epatiche. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo.
***p < 0,001 rispetto al controllo.
Le attività di DT-diaforasi (Figura 38), superossido dismutasi (Figura 39) e catalasi (Figura 40) non risultano essere influenzate significativamente né dal trattamento con la dieta iperlipidica né da quello con la miscela batterica.
Figura 38: Attività DT-diaforasi nelle frazioni citosoliche epatiche. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo.
Figura 39: Attività superossido dismutasi nelle frazioni citosoliche epatiche. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo.
Figura 40: Attività catalasi nelle frazioni citosoliche epatiche. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo.
8.7 Analisi di espressione genica
Mediante PCR real-time nel fegato è stata analizzat dei geni codificanti
IL-6 e SREBP1c calcolata normalizzando sul
controllo, a cui è stato attribuito il valore di 1.
TNF e IL-6
Le figure 41 e 42 mostrano rispettivamente i risu
dei geni codificanti per la citochina pro- -
6); queste non sembrano essere influenzate dai due diversi trattamenti.
Figura 41: RT- I valori riportati sono stati calcolati come
media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo.
Figura 42: RT- -6. I valori riportati sono stati calcolati come media
± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo.
SREBP1c L
, aumenta in modo significativo rispetto al controllo solo nel gruppo dei batteri (Figura 43).
Figura 43: RT- I valori riportati sono stati calcolati come
media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo. *p < 0,05 rispetto al controllo.
8.8 Western blotting
Nei campioni di fegato sono stati determinati i livelli apoproteici di tre isoforme di citocromo P450 mediante Western blotting. La quantificazione per ciascun campione è stata effettuata con analisi densitometrica el software ImageJ, normalizzando il valore su -actina. La figura 44 mostra che i livelli
apo (del 170% circa)
nei due gruppi di trattamento rispetto al controllo.
Figura 44: Western blotting per la proteina CYP2E1. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo. *p < 0,05; **p < 0,1 rispetto al
controllo.
orma CYP3A2 non mostra differenze significative tra i vari gruppi (Figura 45).
Figura 45: Western blotting per la proteina CYP3A2. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo.
Per qua i due trattamenti provocano una
riduzione significativa (del 40% circa) dei livelli apoproteici rispetto al controllo (Figura 46).
Figura 46: Western blotting per la proteina CYP2C11. I valori riportati sono stati calcolati come media ± deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su 5 ratti per gruppo. ***p < 0,001 rispetto al controllo.
8.9 Analisi istologica
Per confermare che i due tipi di trattamento avessero provocato cambiamenti nella morfologia del tessuto epatico con accumulo di lipidi,
istologica su campioni di fegato.
per ognuno di essi sono state riportate soltanto due immagini a diverso ingrandimento per ogni colorazione.
Ematossilina eosina
Questa colorazione, che mette in evidenza la struttura generale del tessuto, permette di confermare la presenza di steatosi epatica negli animali trattati con dieta iperlipidica (con e senza miscela batterica). Come visibile dalla figura 47, negli animali sottoposti ai due trattamenti (Figura 47 c, d, e, f) si ha un marcato accumulo di vescicole lipidiche nel citoplasma degli epatociti, caratteristico della steatosi. Tali vescicole non sono presenti nel gruppo di controllo (Figura 47 a, b).
Oil red
La colorazione con Oil red, specifica per i lipidi,
condizione di steatosi che è presente nel fegato degli animali sottoposti ai due tipi di trattamento (Figura 48 c, d, e, f), nei quali sono presenti numerose vescicole di colore
rosso. Nel controllo (Figura 48 pidiche.
Figura 47: Analisi istologica condotta su sezioni epatiche colorate con ematossilina-eosina. Immagini relative al gruppo di controllo (a, b), al gruppo trattato con dieta iperlipidica (c, d) e al gruppo trattato con dieta iperlipidica e
miscela batterica (e, f).
Figura 48: Analisi istologica condotta su sezioni epatiche colorate con Oil red. Immagini relative al gruppo di controllo (a, b), al gruppo trattato con dieta iperlipidica (c, d) e al gruppo trattato con dieta iperlipidica e miscela
batterica (e, f).
