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SEZIONE III - RISULTATI E DISCUSSIONE
III.1 SINTESI E CARATTERIZZAZIONE DEI CONIUGATI TIOLATI
N
+-Ch-SH
L’N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato è un reagente bifunzionale il cui estere di N-idrossisuccinimmide reagisce con i gruppi amminici primari liberi ancora presenti sulla catena polimerica del coniugato N+-Ch per dare legami ammidici stabili. La reazione è rapida in condizioni molto blande in ambiente acquoso. Lo spettro 1H NMR del prodotto del 1° stadio della sintesi, riportato in Fig. 2a, mostra segnali tra 7 e 8.5 ppm, che possono essere assegnati ai protoni dell’anello della piridina legato al gruppo disolfuro. Ciò indica che il legame ammidico si è formato secondo quanto previsto dal 1° stadio della sintesi, mostrato nella Fig. 1. I segnali della piridina sono assenti dallo spettro 1
H NMR del prodotto del 2° stadio della sintesi, riportato nella Fig. 2b e questo è interpretato come una prova della riduzione dei gruppi –S–S– a –SH con conseguente distacco del residuo di piridina. Dopo la reazione di riduzione, le soluzioni del prodotto vennero mantenute a pH acido per evitare l’ossidazione del tiolo a disolfuro che, come è noto, è favorita a pH alcalino.
III.2 MISURE DI PERMEAZIONE ATTRAVERSO LA CORNEA DI
CONIGLIO ISOLATA
Nella Tab. 1 sono riportati i dati di permeazione di DMS attraverso la cornea isolata del coniglio. I dati di Papp indicano che entrambi i polimeri
aumentano la permeabilità apparente di DMS e che non c’è differenza significativa tra di loro (N+(60)-Ch, Papp 7.11±0.61 cm sec-1, N+(60)-Ch-SH(5), Papp 6.61±0.39 cm sec-1).
Dal momento che il DMS attraversa gli epiteli passando prevalentemente per la via transcellulare, tale effetto si pensa sia dovuto alla capacità dei cationi ammonici quaternari presenti su entrambi i polimeri di perturbare l’ordine del
32 doppio strato lipidico della membrana delle cellule corneali. Infatti se i gruppi tiolici presenti sul polimero esercitassero sulla cornea un’azione permeabilizzante parallela, il chitosano multifunzionale N+(60)-Ch-SH(5) sarebbe dovuto risultare più attivo di N+(60)-Ch nel promuovere la Papp.
Tuttavia, dal momento che il valore di lag time è significativamente minore nel caso di N+(60)-Ch-SH(5), il trasporto cumulativo di DMS dopo l’intera durata dell’esperimento è significativamente, anche se di poco, più alto.
Dunque N+(60)-Ch-SH(5) ha mostrato il miglior potenziale come promotore di assorbimento intraoculare di DMS perché produce un effetto più rapido. Questo è particolarmente importante se si considera che le gocce oftalmiche non viscose sono caratterizzate da un tempo di contatto breve. Il livello di idratazione corneale, LI%, è considerato un indicatore sensibile dell’integrità corneale. Secondo quanto riportato in letteratura il normale contenuto di acqua della cornea del coniglio è compreso tra 75 e 78% (Monti et al., 2002). Dunque i dati riportati in Tab. 1 mostrano che i polimeri non danneggiano il tessuto corneale.
III.3 MISURE DI VISCOSITA’
Nella Fig. 3 sono riportati i reogrammi delle gocce oftalmiche preparate come descritto nel paragrafo II.6, ottenuti mantenendo la temperatura a 35°C. Le sospensioni hanno mostrato un comportamento reologico newtoniano con viscosità 5 cP e 2.5 cP nel caso della sospensione contenente N+(60)-Ch e N+(60)-Ch-SH(5), rispettivamente.
Nonostante che la presenza di gruppi tiolici possa dar luogo alla formazione di ponti disolfuro tra le catene polimeriche, si è riscontrata una viscosità più bassa del veicolo a base del polimero tiolato rispetto a quella del veicolo a base del polimero non tiolato. Questo risultato esclude che almeno durante la misurazione della viscosità si siano formati ponti disolfuro intercatena che farebbero aumentare la viscosità del veicolo.
Da notare che la viscosità ed il comportameto reologico delle gocce contenenti i due derivati del chitosano allo studio è molto diversa da quella di
33 una soluzione del chitosano di partenza. In una precedente tesi di laurea (Zaino C. 2004) è stato ottenuto il reogramma della soluzione di Ch-HCl in acqua a 35°C. Il reogramma ha mostrato che tale soluzione ha un comportamento pseudoplastico ed una viscosità, alla velocità di scorrimento di 200 s-1, di 26.7 cP, ossia 5 e 10 volte superiore rispetto ai valori di N+(60)-Ch e N+ (60)-Ch-SH(5), rispettivamente.
In effetti la derivatizzazione del chitosano comporta una drastica diminuzione della sua viscosità, pur in assenza di depolimerizzazione.
III.4 TESTS IN VIVO
Le gocce, preparate come descritto nel paragrafo II.6, instillate negli occhi dei conigli, si sono dimostrate biocompatibili, in quanto non hanno causato alcun evidente segno di irritazione, come edema congiuntivale/corneale e/o iperemia.
E’ stato confrontato il tempo di residenza medio del DMS nel fluido lacrimale dei conigli (MRT). Per ciascuna soluzione polimerica sono state ottenute 8 curve di eliminazione di DMS dal fluido lacrimale, ciascuna determinata in un singolo occhio di animali differenti. Per ciascuna curva è stato calcolato un valore di MRT come rapporto AUMC/AUC (area under momentum curve/area under curve).
I dati riportati in Tab. 2 mostrano che entrambi i polimeri fanno aumentare enormemente l’MRT che passa da 5.07±0.25 min nel caso del controllo a 65.74±4.91 min nel caso di N+(60)-Ch, fino ad arrivare a 77.96±3.57 min nel caso di N+(60)-Ch-SH(5), un valore significativamente maggiore del precedente. I dati di RTmax, tempo massimo di residenza di DMS nell’area precorneale a concentrazioni misurabili, sono in accordo con i dati di MRT. Infatti, come si vede dal grafico CFL vs t riportato in Fig. 4, in presenza del polimero multifunzionale N+(60)-Ch-SH(5) il tempo di residenza di DMS nell’area precorneale è più lungo rispetto a quello che si ottiene in presenza di N+ (60)-Ch. Tali risultati non si possono spiegare con la viscosità delle gocce, perché la viscosità delle gocce contenenti N+(60)-Ch-SH(5) è addirittura la metà rispetto a
34 quella delle gocce a base di N+(60)-Ch, eppure le prime hanno aumentato di più il tempo di residenza di DMS nel fluido lacrimale. Le ipotesi che possono spiegare tali risultati sono: 1) entrambi i polimeri sono mucoadesivi per l’interazione dei loro cationi ammonici quaternari con gli anioni delle glicoproteine del muco; 2) la presenza di gruppi tiolici fa aumentare la mucoadesività del polimero grazie alla formazione di ponti disolfuro con i tioli delle glicoproteine del muco che ancorano il polimero alla superficie corneale. Gli esperimenti di permeazione ex vivo hanno evidenziato effetti di aumento della permeabilità corneale da parte dei derivati del chitosano. Tali effetti tuttavia sono insufficienti di per sé a preannunciare una effettiva promozione dell’assorbimento transcorneale in vivo, perché questi polimeri richiedono un certo tempo per esercitare la loro azione ed è noto che il tempo di contatto consentito dalle gocce oftalmiche è piuttosto breve. Quindi è stata misurata la farmacocinetica nell’umore acqueo del coniglio per verificare l’efficacia dei polimeri come promotori di assorbimento intraoculare e la loro tollerabilità oculare. I profili di concentrazione di DMS vs. t nell’umore acqueo mostrati in Fig. 5 insieme ai dati di AUCrel (area sotto la curva concentrazione nell’umore acqueo vs tempo relativa, data dal rapporto tra l’AUC ottenuta dopo somministrazione delle gocce contenenti ciascun polimero e quella ottenuta con le gocce di controllo) riportati in Tab. 3 mostrano che in presenza dei polimeri l’assorbimento intraoculare di DMS è significativamente maggiore rispetto al controllo e che il polimero multifunzionale N+(60)-Ch-SH(5) è significativamente più efficace del polimero non tiolato N+(60)-Ch (AUCrel 5.31 contro 3.44, rispettivamente). La maggiore bioattività di N+(60)-Ch-SH(5) è testimoniata anche dai valori di Cmax. Infatti solo nel caso del polimero multifunzionale si ottiene un valore di Cmax significativamente più alto rispetto al controllo.
Per spiegare tali risultati si ammette che la mucoadesività dei polimeri, prolungando il tempo di contatto con la cornea, permetta loro di esercitare l’effetto di permeabilizzazione. La maggiore mucoadesività di N+
(60)-Ch-SH(5), dovuta ai gruppi tiolici, si riflette in una maggiore promozione dell’assorbimento intraoculare.
