5.1 Metodi cromatografici
5.1.1 Cromatografia su strato sottile
Le cromatografie su strato sottile sono state eseguite su lastre di gel di silice Kieselgel 60 F254 (Merck) di 0.25 mm di spessore su un supporto di vetro o di alluminio. Come fasi mobili (eluenti) sono state scelte diverse miscele di solventi a seconda del campione in esame: ● n-esano-CHCl3, in miscela 8:2, 1:1 ● CHCl3-MeOH, in miscela 99:1, 98:2, 97:3, 95:5, 9:1 ● CHCl3-MeOH-H2O, in miscela 70:30:3 e 80:18:2 ● n-BuOH-CH3COOH-H2O, 60:15:25 ● n-esano-AcOEt-MeOH-H2O (8:5:5:2) ● toluene-HCOOH-AcOEt (5:1:4)
La rivelazione delle macchie è stata effettuata sia con luce UV a 254 e 366 nm, sia con il seguente reattivo spray:
● soluzione satura di solfato di cerio in acido solforico al 65%, seguita da riscaldamento a 120° C per 15 minuti, per consentire lo sviluppo della colorazione tipica delle macchie, indice della natura dei composti analizzati (Fig. 5.1). Il solfato di cerio è stato impiegato come rivelatore universale.
Fig. 5.1 TLC
5.1.2 Cromatografia su colonna
5.1.2.1 Cromatografia ad esclusione molecolare
La cromatografia ad esclusione molecolare è stata impiegata per cromatografare l’estratto n-butanolico (9.4 g) delle parti aeree di Arcytophyllum thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl., ottenuto dalla ripartizione n-BuOH/H2O dell’estratto metanolico.
Come fase stazionaria è stato utilizzato gel di Sephadex LH-20 (25-100 µm, Pharmacia Fine Chemicals), impaccato in una colonna di 100 x 5 cm (id = 5 cm, V = 19.6 ml/cm) (Fig. 5.2). Come fase mobile è stato utilizzato MeOH ed è stata utilizzata una pompa peristaltica Pharmacia Fine Chemicals P1 con un flusso costante di 1.5 ml/min.
Fig. 5.2 Colonna Sephadex LH-20 ad esclusione molecolare
5.1.2.2 Cromatografia flash con strumentazione Biotage® Isolera™ Spektra
La cromatografia flash è stata impiegata per cromatografare l’estratto cloroformico (RC) (5.0 g) delle parti aeree di Arcytophyllum thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl.; tale metodica è stata usata anche per separare la frazione RC/7 (1.22 g).
Come fase stazionaria è stato utilizzato il gel di silice 60 (230-410 µm, Merck) impaccato su una colonna (SNAP cartridge) le cui dimensioni variano in base alla quantità di estratto da caricare su Samplet cartridge. Per quanto riguarda la fase mobile, l’eluizione è stata condotta a gradiente di polarità crescente calcolato ed ottimizzato automaticamente dallo strumento, utilizzando miscele in sequenza n-esano-CHCl3-MeOH. Per lo studio dell’estratto cloroformico è stato usato lo SNAP cartridge da 340 g, ed il flusso della fase mobile è stato impostato a 100 ml/min, mentre per lo studio della frazione RC/7 è stato usato lo SNAP cartridge da 100 g, ed il flusso è stato impostato a 50 ml/min, data la minore quantità di campione. Il sistema di purificazione cromatografico con strumentazione Biotage® Isolera™ Spektra consente di rilevare lo spettro PDA con scansione in tempo reale. Le lunghezze d’onda selezionate sono state λ=254 nm e λ=320 nm (Fig. 5.3). Le dimensioni delle colonne, relative alla quantità di campione caricato, sono riportate in Tab. 5.1.
Fig. 5.3 Cromatografo Biotage® Isolera™ Spektra
Colonne (g) Capacità di carico (mg) Flusso (ml/min) 10 100-500 10-20
25 250-1250 15-40 50 500-2500 30-50 100 1000-5000 30-50 340 3400-17000 65-120
Tab. 5.1 Parametri Biotage® Isolera™ Spektra
5.1.3 HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
Le separazioni in fase inversa con HPLC (20-100 bar) sono state effettuate con un apparecchio Shimadzu (Fig. 5.4), costituito da:
● Pompa Shimadzu LC-8A ● Rivelatore Shimadzu RID-10A
● Colonna Waters C-18 µ-Bondapak (30 cm x 7.8 mm) ● Integratore Shimadzu C-R3A
Le separazioni sono state condotte utilizzando come fase mobile miscele eluenti di MeOH-H2O, ad una velocità di flusso di 2 ml/min, attenuazione 7x, con un numero variabile di iniettate di 100 µl di campione (diluizione 10 mg/100 µl) ciascuna.
Fig. 5.4 Strumentazione HPLC
5.1.4 HPCPC (High Performance Centrifugal Partition Chromatography)
L’HPCPC è una tecnica cromatografica che non necessita di colonna su fase solida ma che si basa sulla ripartizione dei soluti tra due fasi liquide fra loro immiscibili. La corretta scelta del sistema solvente è cruciale per il successo della cromatografia. La fase stazionaria, viene introdotta nelle celle di ripartizione disposte nel rotore, mentre la fase mobile, passandovi attraverso, forma delle goccioline, in modo che i composti sono separati in base al loro coefficiente di ripartizione. I metodi di eluizione si dividono in due diverse modalità: ascendente e discendente. Nella modalità ascendente, la fase mobile è introdotta dal basso del rotore e fluisce verso l’alto, la fase mobile deve essere quella con la densità minore. Nella modalità discendente, la fase mobile è introdotta dall’alto del rotore e fluisce verso il basso, in questo caso la fase mobile sarà quella a maggior densità. La cromatografia HPCPC è stata effettuata con uno strumento EverSeiko CPC 240 equipaggiato con 3136 celle (15 mm, 240 ml di volume totale) (Fig. 5.5).
Fig. 5.5 Strumentazione HPCPC
5.2 Metodi chimico-fisici
5.2.1 Potere ottico rotatorio
Le misure sono state effettuate con un polarimetro Perkin-Elmer modello 241, fornito di una lampada al sodio (589 nm), alla temperatura di 22 °C, in celle da 1 decimetro di lunghezza ed 1 ml di volume, utilizzando MeOH come solvente (Fig. 5.6).
5.2.2 Spettri UV
Gli spettri ultravioletti sono stati ottenuti e registrati in MeOH con uno spettrofotometro Perkin-Elmer Lambda 11 (Fig. 5.7).
Fig. 5.7 Spettrofotometro UV e rispettive cuvette
5.2.3 Spettri di massa Spettri ESI-MS
Gli spettri di massa ESI-MS (modalità positiva e negativa) sono stati registrati con uno spettrometro Thermo Finningan LC-Q Advantage a trappola ionica, equipaggiato con un software Xcalibur. I campioni sono stati sciolti in 10-20 µg/ml con MeOH ed iniettati nella fonte ESI utilizzando una pompa a siringa. La velocità del flusso è stata di 5 µl/min (Fig. 5.8).
Fig. 5.8 Spettrometro di massa
Spettri HRESIMS
Gli spettri di massa ad alta risoluzione HRESIMS sono stati registrati in modalità positiva su uno spettrometro Q-TOF-Premier provvisto di sorgente nano-elettrospray (Waters-Milford, USA).
5.2.4 Spettri di risonanza magnetica nucleare
Per gli spettri NMR è stato utilizzato uno spettrometro Bruker DRX-600 (software UXNMR) operante a 599.19 MHz per 1H e 150.86 MHz per 13C e uno strumento Bruker AC-250 (software Topspin) operante a 250 MHz per 1H e 62.5 MHz per 13C (Fig. 5.9).
Fig. 5.9 Strumentazione NMR
Gli spettri mono e bidimensionali sono stati misurati in CD3OD o in DMSO-d6. Negli spettri 1H-NMR, per le misurazione in CD
3OD e in DMSO-d6, sono stati usati come standard i segnali relativi dei solventi (CD3OD a 3.31 e DMSO-d6 a 2.49 ppm rispettivamente). I chemical shifts sono riportati in δ (ppm). Negli spettri 13C-NMR sono stati usati come riferimento i segnale dei solventi a δ 49.0 per il CD3OD e a δ 39.52 per il
DMSO-d6. L’esperimento di correlazione diretta omonucleare (DQF-COSY, Double
Quantum Filtered COSY) è stato eseguito usando la convenzionale sequenza di impulsi. L’esperimento di correlazione diretta eteronucleare 1H-13C (HSQC) è stato realizzato su una matrice 512 × 1024, usando una costante di accoppiamento C-H di 135 Hz ed un relaxation delay di 1.5 sec (Kay et al., 1992; Palmer et al., 1991). L’esperimento di correlazione eteronucleare long range (HMBC) è stato ottenuto utilizzando la sequenza di Bax (Bax e Subramanian, 1986; Lerner e Bax, 1986) ad una costante long range media di 6-8 Hz e una matrice 512 × 1024. Gli esperimenti DEPT-135° sono stati eseguiti utilizzando trasferimenti di polarizzazione per mezzo liquido di impulsi a 90° per ottenere solo i gruppi CH e di 135° per ottenere segnali positivi per i gruppi CH e CH3 e negativi per i gruppi CH2. Il ritardo nel trasferimento di polarizzazione è stato corretto ad un accoppiamento medio C-H di 135 Hz. Gli esperimenti 1D-TOCSY sono stati ottenuti usando un software UX-NMR e sono stati eseguiti utilizzando un generatore di impulsi gaussiani usando, durante il mixing time, la sequenza di impulsi di tipo MLEV-17 (mixing time 80-100 ms), secondo quanto riportato in letteratura (Davis e Bax, 1985).
5.3 Metodi biologici
5.3.1 Inibizione dell’enzima lattato deidrogenasi
I campioni isolati sono stati saggiati nei confronti dell’isoforma 5 purificata dell’enzima deidrogenasi lattato umana (Hldh5) (Lee Biosolution, Inc.) secondo il procedimento di seguito riportato: è stata stata condotta la reazione (piruvato→lattato) catalizzata dalla LDH (che richiede NADH come cofattore) ed i parametri cinetici sono stati misurati tramite la fluorescenza, per monitorare la quantità di NADH consumata e poter di conseguenza calcolare le IC50. I campioni sono stati testati all’interno di pozzetti in presenza di 200 µM di piruvato e 40 µΜ di NADH, sciolti in una soluzione tampone di fosfato 100 mM (pH = 7.4) e per calcolare i valori di IC50, sono state usate sette diverse concentrazioni (in duplicato per ogni concentrazione) al fine di ottenere una curva concentrazione-risposta; in parallelo sono state eseguite delle prove in bianco. I composti potrebbero competere con il piruvato o con NADH, inibendo di conseguenza l’attività della LDH. Dopo 15 minuti di incubazione è stata calcolata la concentrazione di NADH presente tramite fluorescenza (lunghezza d’onda d’emissione a 460 nm, lunghezza d’onda di eccitazione a 340 nm) usando un lettore di micropiastre Victor X3 (PerkinElmer®) (Fig. 5.10). Un’elevata fluorescenza a 340 nm significa che del NADH non è stato utilizzato come cofattore dall’LDH e quindi l’enzima è stato in qualche modo inibito. I valori di IC50 sono stati ottenuti tramite il software GraphPad Prism (GraphPad – USA).
Il saggio accoppiato prevede l’utilizzo di una seconda reazione nella quale l’enzima diaforasi (Sigma-Aldrich) converte il substrato resazurina nel composto resorufina utilizzando NADH come cofattore (Fig. 5.11); la resorufina che si forma è fluorescente e perciò viene effettuata la lettura finale a 590 nm (eccitazione 560 nm). I composti sono quindi stati testati in presenza di piruvato e NADH nelle condizioni classiche e dopo 15 minuti di incubazione è stata aggiunta nei pozzetti una soluzione contenente resazurina (15 µM) e diaforasi (2 unità/ml), infine dopo ulteriori 30 minuti di incubazione sono state effettuate le misurazioni finali.
CONCLUSIONI
L’indagine fitochimica effettuata sulle parti aeree di Arcytophyllum thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl., arbusto o suffrutice appartenente alla famiglia delle Rubiaceae, originario di Riobamba, Provincia del Chimborazo, Ecuador, ha portato all’isolamento e alla completa identificazione di 26 composti appartenenti a diverse classi di metaboliti secondari.
Nello specifico sono stati isolati: ● 10 iridoidi (composti 11-20) ● 1 triterpene (composto C)
● 8 cumarine (composti 1, 2, 5, 6, 8, 9, 10, 22) ● 7 flavonoidi (composti 3, 7, 23, 25, 26, 27, 28) ● 2 derivati dell’acido caffeico (composti 21, 24) ● 1 acetofenone (composto 4)
Tra questi, l’iridoide 18, il flavonoide 7 e le cumarine 9, 10 e 22, risultano essere nuovi derivati naturali, mai isolati in natura, mentre i metaboliti C, 16 e 20 sono ancora in corso di completa caratterizzazione.
Obiettivo principale di questo lavoro sperimentale è stato l’isolamento di composti a struttura cumarinica ed iridoidica, risultati essere i metaboliti secondari principali della specie A. thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl.
Dallo studio dell’estratto cloroformico sono state isolate sette cumarine, due flavonoidi ed un acetofenone. I composti 1 e 2 appartengono alla classe furanocumarine angolari e fino ad oggi sono stati isolati solo nel genere Hedyotis; molte furanocumarine sono studiate per le loro interessanti attività biologiche, ma quelle 6-ossigenate sono rare ed è presente un esiguo numero di studi riguardante le loro proprietà. In particolare ne è stato valutato il potenziale citotossico nei confronti di diverse linee cellulari tumorali, verso le quali hanno mostrato una certa citotossicità (Chen et al., 2006, Yue et al., 2012). I composti 6 e 9 rientrano invece nella classe delle piranocumarine angolari, il primo è stato caratterizzato unicamente e per la prima volta nella specie Toddalia asiatica (L.) Lam. (Rutaceae) (Tsai et al., 1998) mentre il secondo risulta essere un nuovo derivato. I composti 5 e 10 sono idrossicumarine sostituite con un gruppo isopentilico in posizione 8, il primo è stato isolato solo nella specie Cneorum pulverulentum (Vent.) (Rutaceae) nel 1975 (Mondon e Callsen, 1975), mentre il secondo costituisce un nuovo derivato. Infine la cumarina 8 è un composto noto, già isolato in diverse specie botaniche. I flavonoidi 3 e 7 sono flavanoni prenilati, metaboliti secondari piuttosto rari e il composto 7 rappresenta un nuovo derivato naturale.
Dallo studio dell’estratto più polare metanolico sono stati isolati tutti i composti di natura iridoidica e 10 derivati fenolici, fra cui cinque flavonoidi, tre cumarine e due derivati dell’acido caffeico. I composti 11-20 fanno parte del principale gruppo degli iridoidi, costituito dai glucosidi iridoidi, essi presentano infatti un’unità di glucosio legata al gruppo emiacetalico in C-1. Il composto 15 è già stato isolato in passato da Arcytophyllum nitidum (Kunth) Schltdl. (De Feo et al., 1992) e la sua caratterizzazione nella specie A.thymifolium
(Ruiz & Pav.) Standl. ne conferma la presenza nel genere Arcytophyllum. Per quanto riguarda gli altri iridoidi, solo il composto 18 rappresenta un nuovo derivato naturale, mentre gli altri sono già stati caratterizzati in precedenza da piante non appartenenti al genere Arcytophyllum, ma facenti parte comunque della medesima famiglia delle Rubiaceae.
Le cumarine 2 e 8 sono state già caratterizzate nell’estratto cloroformico, mentre la piranocumarina 22 è il derivato demetossilato del composto 9 e costituisce anch’essa un nuovo composto. Tutti i flavonoidi isolati appartengono alla classe dei flavonoli, fra essi i composti 23 e 25 contengono nella loro struttura diverse unità zuccherine, gli altri invece sono molto diffusi nel regno vegetali (26-28).
In conclusione lo studio fitochimico delle parti aeree di Arcytophyllum thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl. ha rilevato per la prima volta la presenza di composti a struttura cumarinica nel genere Arcytophyllum ed ha confermato la presenza di derivati flavonoidici e di iridoidi, mettendo inoltre in evidenza la grande abbondanza di questi ultimi.
I composti 1, 2, 3, 6, 8 e 15 sono stati saggiati nei confronti della lattato deidrogenasi (LDH), enzima coinvolto nei processi tumorali, tuttavia nessuno dei composti testati ha mostrato possedere un’attività inibitoria significativa; tuttavia sulla base dei risultati ottenuti e dal confronto con i dati presenti in letteratura, è possibile prevedere ulteriori test di attività biologica successivi sui composti più rilevanti isolati.
