Materiali e metodi

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Materiali e metodi

Reagenti:

Acido borico (>99 + %); Aldrich® Idrossido di sodio (>99%); Merck Acido ascorbico (≥ 99.0%); Fluka Acido nicotinico; Sigma

Nicotinamide (>99%); Sigma Aldrich Tiamina cloridrato (≥ 99.8%); Carlo Erba Riboflavina (≥ 99.0%); Fluka

Sodio dodecil solfato; VWR

Ammonio formiato (97%); Janssen Chimica

Acido formico (per analisi, 98-100%); Riedel de Haën Acido cloridrico (37%); VWR

Metanolo (grado gradiente HPLC, >99,8%); VWR SUSTENIUM PLUS® bustine; A. Menarini

Berocca Plus® compresse; Bayer

Acetonitrile (grado gradiente HPLC, >99,8%); VWR Ammonio acetato (> 98%); Sigma-aldrich

Sodio diidrogenofosfato(99%); Aldrich Acido acetico glaciale (99.9%); Sigma-aldrich

Strumentazione

L’apparecchio HPLC utilizzato è costituito da un modulo di pompaggio dei solventi a tre vie (Varianmod. 9012), un detector DAD-UV-Vis (Varianmod. 330) e una valvola d’iniezione (Ecommod. 7004850) equipaggiata con loop da 20μl. Le analisi sono state effettuate su colonne analitiche di diverso tipo:

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Luna HILIC (150 x 4.6 mm, 5 μm; Phenomenex), equipaggiata con pre-colonne dedicate (Luna HILIC guardcolumn, Phenomenex);

LC-ABZ RP-amide (250 x 4.6 mm, 5 μm; Supelco), equipaggiata con precolonna in filtro sinterizzato;

Mediterranea SEA C18 (250 x 4.6 mm, 5 μm; Tecnokroma) e Gemini C18 (250 x 4.6 mm, 5 μm; Phenomenex), equipaggiate con pre-colonne C18 (Luna C18guardcolumn, Phenomenex);

Le analisi in elettroforesi sono state condottesu un apparecchio P/ACE TM MDQ della BeckmanCoulter con un rivelatore DAD a matrice di diodi. Il capillare utilizzato è in silice fusa ricoperto in poliimmide, modello eCAPTM(Beckman). I tamponi di separazione (cromatografia zonale, micellare e microemulsione) sono stati filtrati con un filtro SartoriusMinisart NML con porosità 0,45 µm. Per la purificazione degli estratti sono state utilizzate cartucce SPE Sep-pak C18 (Waters). Il capillare utilizzato risulta avere una lunghezza totale di 60 cm, al detector 50 cm e diametro interno 50 μm.

Le purificazioni in fase solida sono state effettuate su cartucce Sep-pak C18 (360 mg, Waters), SUPELCLEAN C18 (200 mg/6 ml, Phenomenex), Oasis HLB (60/3 ml mg, Waters), Strata-X DVB (200 mg/3 ml, Waters) e Strata SCStrata-X (200 mg/3 ml, Waters).

Preparazione delle soluzioni acquose

Le soluzioni acquose sono state preparate con acqua deionizzata e filtrata su membrana 0,22 µm, ottenuta con sistema Milli-Q (Waters).

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Tampone formiato (HPLC):

Per la preparazione di 1 l di soluzione, 1.5765 g di ammonio formiato vengono pesati esattamente e solubilizzati in circa 900 ml di acqua sotto l’azione di un agitatore magnetico. A dissoluzione completata, si misura il pH della soluzione tramite elettrodo a vetro e si aggiunge acido formico fino a raggiungere un pH di 3.5 o 3.0.Successivamente, si trasferisce la soluzione all’interno di un matraccio tarato da 1000mL e si porta a volume con acqua Milli-Q, controllando il pH finale. Il tampone, prima di essere utilizzato, viene filtrato con un filtro a membrana da 0,45 µm.

Tampone acetato (HPLC):

Per la preparazione di 1 l di soluzione, 1.9275 g di ammonio acetato vengono pesati esattamente e solubilizzati in circa 900 ml di acqua sotto l’azione di un agitatore magnetico. A dissoluzione completata, si misura il pH della soluzione tramite elettrodo a vetro e si aggiunge acido acetico fino a raggiungere un pH di 5.8.Successivamente, si trasferisce la soluzione all’interno di un matraccio tarato da 1000mL e si porta a volume con acqua Milli-Q, controllando il pH finale. Il tampone, prima di essere utilizzato, viene filtrato con un filtro a membrana da 0,45 µm.

Tampone fosfato (HPLC):

Per la preparazione di 1 l di soluzione, 3.0000 g di ammonio formiato vengono pesati esattamente e solubilizzati in circa 900 ml di acqua sotto l’azione di un agitatore magnetico. A dissoluzione completata, si misura il pH della soluzione tramite elettrodo a vetro e si aggiunge acido fosforico fino a raggiungere un pH di 3.2.Successivamente, si trasferisce la soluzione all’interno di un matraccio tarato da 1000mL e si porta a volume con acqua Milli-Q, controllando il pH finale. Il tampone, prima di essere utilizzato, viene filtrato con un filtro a membrana da 0,45 µm.

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Per la preparazione di cento millilitri di soluzione, vengono pesati esattamente 0,2473 grammi di acido borico e fatti sciogliere all’interno di un becker con circa 80 ml di acqua sotto l’azione di un agitatore magnetico. A dissoluzione completata, si misura il pH della soluzione tramite elettrodo a vetro e si aggiunge NaOH 1 M fino a raggiungere un pH di 8,2. Dopodichè, si pesano esattamente 1,730 grammi di sodio dodecil solfato (SDS) e si aggiungono al tampone borato. La soluzione viene lasciata sotto continua agitazione (agitatore magnetico) fino a completa solubilizzazione dell’SDS; successivamente, si trasferisce la soluzione all’interno di un matraccio tarato da 100 mL e si porta a volume con acqua Milli-Q. Il tampone prima di essere utilizzato, viene filtrato con un filtro da 0,45 µm.

Tampone borato (CZE):

Per la preparazione di cento millilitri di soluzione vengono esattamente pesati 0,6153 grammi di acido borico e fatti sciogliere all’interno di un becker con circa 80 ml di acqua sotto l’azione di un agitatore magnetico. A dissoluzione completata, si misura il pH della soluzione tramite elettrodo a vetro e si aggiunge NaOH 1 M fino a raggiungere un pH di 8,2. La soluzione viene così trasferita all’interno di un matraccio tarato da 100 mL. e portata a volume con acqua Milli-Q. Il tampone, prima di essere utilizzato, viene filtrato con un filtro da 0,45 µm.

Preparazione delle soluzioni di integratori:

Per la preparazione dei campioni sono stati pesati circa 2,5 grammi della compressa e del granulato e fatti sciogliere in una beuta, rispettivamente, in 5 e 4 ml di HCl O,1 N, e sottoposti ad agitazione a 70°C. A dissoluzione completata il campione vienetrasferito in vialEppendorf, centrifugato e il surnatante diluito con tampone borato (250 µl surnatante + 250 µl di tampone).

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Prima estrazione:

Il campione omogeneizzato in blender(75 g) viene addizionato di 60 ml di soluzione di estrazione, costituita da acetonitrile (50 ml) e acido acetico glaciale (10 ml) in H2O (1 l). La sospensione viene tenuta in agitazione a temperatura ambiente ed in atmosfera inerte di N2per 40 min, centrifugata in provette Falcon (50 ml) a 12.000 g per 10 min a 4°C, e successivamente conservata a -20 °C.Prima dell’analisi, i campioni vengono scongelati, centrifugati in provette Eppendorf (14.000 rpm, 10 min a 4°C) e diluiti opportunamente nel tampone di separazione HPLC o CE.

Seconda estrazione:

Questo tipo di estrazione prevede un primo passaggio in cui il campione viene scottato in acqua calda a 80°C (“blanching”). Si pesano 115,5 grammi di carciofo tagliato in quarti e si aggiunge 231 mL di una miscela di estrazione compostadall’1% di acido acetico e il 5% di acetonitrile in acqua. Il tutto viene messo in pallone con refrigerante da 500 ml a bagnomaria in agitazione magnetica su piastra sotto atmosfera di azoto, alla temperatura di 80 °C per cinque minuti. Dopodiché, il campione viene trasferito (insieme alla soluzione) e frullato in blenderin atmosfera inerte di N2per 5 mine centrifugato in provette Falcon (50 ml) a 12.000 g per 10 min a 4°C, e successivamente conservato a -20 °C. Prima dell’analisi, i campioni vengonoscongelati, centrifugati in provette Eppendorf (14.000 rpm, 10 min a 4°C) e diluiti opportunamente nel tampone di separazione HPLC o CE.

Terza estrazione:

Cento grammi di carciofi surgelati sono stati frullati con 250 ml di HCL 0,1 N sotto azoto in un mixer per circa dieci minuti, fino a completa omogeneizzazione. Il tutto è stato trasferito in un pallone da 500 ml con refrigerante e messo a bagnomaria a 50 °C per quattro ore, tenuto in agitazione sotto atmosfera di azoto. Parallelamente, la stessa procedura è stata applicata a una miscela di standard (concentrazione finale di 20ppm). Da questa soluzione è stata prelevata un’aliquota (10 ml) prima dell’inizio della procedura come riferimento del non trattato

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(“bianco”), mentre il resto viene sottoposto alla stessa procedura del campione. Al termine il campione viene trasferito in provette Falcon da 50 ml e successivamente centrifugato a 16.000 g per 10min a 4 °C. Il surnatante viene trasferito in provette Falcon da 50 ml, e il pelletri-sospeso in 50 ml di miscela di estrazione (HCl 0,1 N) e ri-centrifugato per dieci minuti a 16.000 g a 4 °C, dopodiché i surnatanti vengono riuniti. Gli estratti vengonoconservati a -20°C fino all’analisi. Prima dell’analisi, i campioni vengono scongelati, centrifugati in provette Eppen dorf (14.000 rpm, 10 min a 4°C) e diluiti opportunamente nel tampone di separazione HPLC o CE. Per quanto riguarda gli standard dopo la cottura vengono divisi in due aliquote di cui una subirà il processo di liofilizzazione. Il liofilizzato così ottenuto verrà poi ripreso con acqua o metanolo in rapporto 1 g/5 ml di solvente e conservato a -20°C; prima dell’analisi, la soluzione viene scongelata, centrifugatain provette Eppendorf (14.000 rpm, 10 min a 4°C) e diluita opportunamente nel tampone di separazione HPLC o CE.

Quarta estrazione:

Cento grammi di carciofi surgelati sono stati frullati con 250 ml di HCL 0,1 N sotto azoto in un blender per circa dieci minuti, fino a completa omogeneizzazione. Il tutto è stato trasferito in un pallone da 500 ml con refrigerante e messo a bagnomaria a 90 °C per quattro ore, tenuto in agitazione sotto atmosfera di azoto. Al termine, il campione viene trasferito in provette Falcon da 50 mle successivamente centrifugato a 16.000 g per dieci minuti a 4 °C. Il surnatante viene trasferito in provette Falcon da 50 ml e il pelletri-sospeso in 50 ml di miscela di estrazione (HCl 0,1 N) e ri-centrifugato per dieci minuti a 16.000 g a 4 °C, dopodiché i surnatanti vengono riuniti. Un’aliquota viene utilizzata per l’analisi dell’estratto tal quale, mentre tutto il rimanente viene sottoposto al processo di liofilizzazione.Il liofilizzato così ottenuto verrà poi ripreso con acqua o metanolo in rapporto 1 g/5 ml di solvente. Gli estratti vengonoconservati a -20°C fino all’analisi;prima dell’analisi, le soluzioni vengono scongelate, centrifugatein provette Eppendorf (14.000 rpm, 10 min a 4°C) e diluite opportunamente nel tampone di separazione HPLC o CE.

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La procedura è identica alla “quarta estrazione” eccetto che per la procedura di triturazione del campione, che viene effettuata in mortaio con pestello tramite azoto liquido, aggiunto in aliquote da 20 ml ca. fino ad omogeneizzazione del campione in polvere fine. Il campione viene trasferito in pallone con refrigerante insieme alla soluzione di estrazione (HCl 0.1 N in H2O, 100 g/250 ml), dopodichè la procedura è uguale a quanto riportato nella “Quarta estrazione”.

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