LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Greta Bandzevičiūtė
Paratuberkuliozės (Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis)
paplitimas Lietuvos galvijų ir laukinių atrajotojų populiacijoje
Paratuberculosis (Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis)
prevalence in Lithuanian cattle and wild ruminant population
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovas: prof. dr. Arūnas Stankevičius
2
DARBAS ATLIKTAS ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Paratuberkuliozės (Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis) paplitimas Lietuvos galvijų ir laukinių atrajotojų populiacijoje“
1. Yra atliktas mano paties;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą. 2016-12-15 Greta Bandzevičiūtė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. 2016-12-15 Greta Bandzevičiūtė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
2016-12-15 Prof.dr. Arūnas Stankevičius
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE 2016-12-16 Prof. dr. Judita Žymantienė
(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos vardas,
pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
3
TURINYS
SANTRUMPOS ... 4 SANTRAUKA ... 6 SUMMARY ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10 1.1. Sukėlėjas ... 10 1.2. Imuninis atsakas ... 10 1.4. Paratuberkuliozės epidemiologija ... 121.4.1. Paratuberkuliozės paplitimas galvijų populiacijoje ... 13
1.4.2. Paratuberkuliozės paplitimas laukinių atrajotojų ir kitų laukinių gyvūnų populiacijoje... 13
1.5. Diagnostikos metodai ... 14
1.5.1. Imunofermentinė analizė ... 14
1.5.2. Kiti serologiniai tyrimų metodai ... 15
1.5.3. Bakteriologiniai tyrimų metodai ... 15
1.5.4. Polimerazės grandininė reakcija ... 16
1.5.5. Skrodimas ... 16
1.6. Kontrolė ... 16
1.6.1. Neužkrėstų bandų kontrolė ... 17
1.6.2. Jauniklių kontrolė ... 17
1.6.3. Užsikrėtusiu gyvūnų kontrolė ... 18
1.6.4. Vakcinavimas ... 18
2. MEDŽIAGOS IR METODAI ... 19
2.1. Imunofermentinės analizės metodo principas ... 19
2.1.1. Apžvalginė imunofermentinė analizė ... 20
2.1.2. Patvirtinamoji imunofermentinė analizė ... 21
2.1.3. Rezultatų skaičiavimas ... 22
2.1.4. Statistinė duomenų analizė ... 22
3. TYRIMO REZULTATAI... 23 4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 32 IŠVADOS ... 36 PADĖKOS ... 37 LITERATŪROS SĄRAŠAS... 38 PRIEDAI ... 46
4
SANTRUMPOS
AA – Angusai AB – Aubrakai DJ – Danijos juodmargiai DL – Džono liga DŽ – Danijos žalieji H – HolšteinaiIAGM – imunodifuzijos agaro gelyje metodas IFA – imunofermentinė analizė
IgG – imunoglobulinas G IL – interleukinas
INF-γ – gama interferonas IP – inhibicijos procentas
JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos KRS – komplemento surišimo reakcija LI – Limuzinai
LJ – Lietuvos juodmargiai LŽ – Lietuvos žalieji
MAP - Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis n – imties dydis
NMVRVI – Nacionalinis maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institutas OT – optinis tankis
PGR – polimerazės grandininė reakcija PI – pasikliautinis intervalas
5
RVVP - rizikos vertinimo ir valdymo planas TMB – tetrametilbenzidinas
TNF-α – alfa auglių nekrozės faktorius
TRAF1 - su auglių nekrozės faktoriaus receptoriais susiję 1 tipo faktorius VB – Vietiniai baltnugariai
6
SANTRAUKA
Paratuberkuliozės (Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis) paplitimas Lietuvos galvijų ir laukinių atrajotojų populiacijoje
Greta Bandzevičiūtė Magistro baigiamasis darbas
Darbo apimtis: 45 puslapiai, 11 paveikslėlių, 2 lentelės, panaudoti 86 literatūros šaltiniai. Darbo tikslas: ištirti paratuberkuliozės paplitimą galvijų ir laukinių atrajotojų populiacijoje dešimties metų laikotarpiu.
Paratuberkuliozė yra galvijų ir kitų atrajotojų infekcinė, lėtinė virškinamojo trakto liga. Liga svarbi ir reikšminga, nes per ją patiriami dideli ekonominiai nuostoliai. Siekiant sumažinti ligos plitimą ir jos sukeliamus ekonominius nuostolius, svarbu ištirti ligos paplitima galvijų ir laukinių atrajotojų popiliacijose.
Buvo surinkti ir išanalizuoti serologinių tyrimų paratuberkuliozės atžvilgiu duomenys 2006-2015 metų laikotarpyje. Iš viso ištirta 15970 galvijų ir 4859 laukinių atrajotojų kraujo serumo mėginių. Mėginiai tirti naudojant imunofermentinės analizės metodą. Serologiniams tyrimams naudoti IDEXX diagnostiniai rinkiniai. Atlikus kraujo serumo tyrimus, buvo nustatyta, jog 272 galvijai, 4 elniai ir 13 muflonų buvo serologiškai teigiami paratuberkuliozei. Tai atitinkamai sudaro 1,7 proc. (95%PI 78-2,22), 0,14 proc. (95%PI 0,002-0,95), 4,19 proc. (95%PI 1,35-6,65) nuo visų ištirtų kraujo serumo mėginių. Visi mėginiai buvo surinkti iš 44 rajonų Lietuvoje. Atlikus kraujo serumo mėginių analizę nustatyta, kad Alytaus, Joniškio, Lazdijų ir Šakių rajonuose buvo aptikta daugiausiai paratuberkuliozės atžvilgiu teigiamų galvijų. Mažiausiai paratuberkuliozei specifinių antikūnų nustatyta Šilalės rajone. Visi teigiami muflonų kraujo serumo mėginiai buvo aptikti Joniškio rajone, o elnių – Mažeikių rajone. Daugiausiai serologiškai teigiamų galvijų (6,59 proc.; 95%PI 0,26-13,74) paratuberkuliozės atžvilgiu nustatyta 2007 metais, o laukinių atrajotojų – 2012 metais. Analizuojant mėginius, daugiausiai speficinių antikūnų prieš paratuberkuliozę nustatyta 2,1-6 metų amžiaus galvijams ir vyresniems nei 2,1 metai muflonams bei elniams. Galvijų populiacijoje 95,9 (95%PI 93,41-98,59) patelių ir 4,09 proc. (95%PI 1,41-6,59) patinų buvo serologiškai teigiami paratuberkuliozei.
7
SUMMARY
Paratuberculosis (Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis) prevalence in Lithuanian cattle and wild ruminant population
Greta Bandzevičiūtė Master‘s Thesis
Scope of work: 45 pages, 11 pictures, 2 tables, 86 references.
The aim of this thesis is to examine the prevalence of paratuberculosis in cattle and wild ruminant population during the period of ten years.
Paratuberculosis is chronic infectious intestinal disease, affecting cattle and other ruminants. It is important and significant, since it causes substantial economic losses. In order to reduce the spread of this disease and the resulting economic losses, it is essential to research the prevalence of disease in cattle and wild ruminant populations.
Analysis of serological tests for paratuberculosis during the period of 2006-2015 was performed. In total, blood serum samples of 15970 cattle and 4859 wild ruminants were tested. The samples were tested by using the enzyme-linked immunosorbent assay. IDEXX diagnostic kits were used for serological tests. The blood serum tests revealed that 272 cattle, 4 deer and 13 mouflons were seropositive for paratuberculosis. This represents 1,7 percent (95%PI 78-2,22), 0,14 percent (95%PI 0,002-0,95), 4,19 percent (95%PI 1,35-6,65) of all tested blood samples, respectively. All samples were collected from 44 districts in Lithuania. Analysis of blood serum samples revealed that the highest number of cattle, seropositive for paratuberculosis, was in Alytus, Joniškis, Lazdijai and Šakiai districts. The lowest number of seropositive samples was found in Šilalė district. All positive blood samples of mouflons were found in Joniškis district, and deer – in Mažeikiai district. The highest number of seropositive cattle (6,59 percent; 95%PI 0,26-13,74) was found in 2007, while the one of wild ruminants – in 2012. In 2008, no case of paratuberculosis was found. While analysing the samples, the most specific antibodies against paratuberculosis were found for the cattle of 2,1-6 year-old, and for the mouflons and deer, older than 2,1 year-old. In cattle population, 95,9 percent (95%PI 93,41-98,59) of females and 4,09 percent (95%PI 1,41-6,59) of males were seropositive for paratuberculosis.
8
ĮVADAS
Paratuberkuliozė (PTB) – tai lėtinė virškinamojo trakto liga, kurią sukelia bakterija Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP). Kitaip PTB dar vadinama Džono liga (DL), ją atradusio mokslininko garbei. Ligai jautrūs naminiai ir laukiniai atrajotojai. Pirmą kartą PTB diagnozuota galvijams 1895 metais, Vokietijoje (1-4).
Liga svarbi ir reikšminga, nes per ją patiriama labai daug ekonominių nuostolių. PTB turi ilgą, iki 10 metų trunkanti inkubacinį periodą. Jungtinėse Amerikos Valstijose (JAV) ekonominiai nuostoliai siekia 250 milijonų dolerių per metus (5,6). Nuostoliams daugiausiai įtakos turi sumažėjęs svoris (skerdžiant), padidėjęs jautrumas kitoms infekcijoms, priešlaikinis skerdimas, sumažėjusi pieno produkcija pieninių karvių ūkiuose (7).
MAP nuo užsikrėtusių suaugusių gyvūnų daugiausiai plinta jų jaunikliams, kurie yra jautriausi infekcijai. (6). Infekcija plinta fekaliniu-oraliniu būdu. Didžiausia bakterijų koncentracija yra išmatose (taip pat, MAP aptinkama ir krekenose, piene, spermoje). Neatmetama, jog MAP gali būti platinama ir oro lašeliniu būdu (8). Liga serga pieniniai ir mėsiniai galvijai, avys, ožkos, elniai, kupranugariai. Tačiau net ir monogastriniai laukiniai gyvūnai gali būti infekcijos rezervuaru (9). Neatmetama, jog liga gali būti zoonozė (1).
Pagrindiniai ligos požymiai yra stiprus išliesėjimas ir vandeningas viduriavimas. Gyvūnai tampa silpni ir išsekę. Šie simptomai pasireiškia esant klinikinei ligos stadijai. Subklinikinė liga pasireiškia pieno produkcijos sumažėjimu. Užsikrėtę gyvūnai platina MAP su išmatomis, pienu, nerodydami jokių klinikinių požymių (5,6,10).
Per daugiau nei 100 metų liga išplito po visą pasaulį (2). Kiekvienais metais PTB diagnozuojama daugelyje pasaulio valstybių. Endemiškai Džono liga pasireiškia daugelyje šalių galvijų bandose (Olandijoje 54 proc. bandų užkrėstos, Austrijoje – 7 proc., Belgijoje – 18 proc., JAV – 41 proc.) (1). Liga pasireiškusi visuose žemynuose, tiek tarp naminių atrajotojų, tiek laukinių gyvūnų populiacijose (11). Tarp laukinių gyvūnų liga ypač paplitusi danielių populiacijoje (12,13). Žinoma atvejų, kai PTB pasireiškė protrūkio forma tarp jaunų elnių ir briedžių (14). Laukiniai gyvūnai gali užkrėsti kitus jautrius ligai gyvūnus ir yra didelė problema PTB kontrolėje (15).
Lietuvoje šiai ligai skiriamas mažai dėmesio – jos paplitimas mažai tyrinėtas galvijų populiacijoje. Taip pat, ligos paplitimas netirtas laukinių atrajotojų populiacijoje. Atsižvelgiant į tai, kad Lietuvoje mokslinių pubikacijų apie šią ligą praktiškai nebuvo paskelbta, ir siekiant nustatyti paratuberkuliozės realų paplitimą galvijų ir laukinių atrajotojų populiacijose, buvo surinkti ir apibendrinti specifinių antikūnų tyrimų duomenys 2006-2015 metų laikotarpiu.
9
Darbo tikslas: ištirti paratuberkuliozės paplitimą galvijų ir laukinių atrajotojų populiacijoje dešimties metų laikotarpiu.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti paratuberkuliozės sukėlėjui specifinių antikūnų paplitimą galvijų ir laukinių atrajotojų kraujo serumo mėginiuose, surinktuose dešimties metų laikotarpiu.
2. Nustatyti bendrą PTB specifinių antikūnų pasiskirstymą galvijų ir laukinių atrajotojų populiacijose 2006-2015 metų laikotarpiu.
3. Serologiškai įvertinti paratuberkuliozės sukėjo paplitimą galvijų ir laukinių atrajotojų populiacijoje visose Lietuvos apskrityse.
4. Nustatyti didžiausią PTB atžvilgiu teigiamų galvijų ir laukinių atrajotojų kiekį, kuris buvo rastas Lietuvoje.
5. Įvertinti galvijų veislės, lyties ir amžiaus bei laukinių atrajotojų lyties ir amžiaus įtaką PTB pasireiškimui dešimties metų laikotarpyje.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Sukėlėjas
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis – viena iš M. avium komplekso bakterijų, kurį be MAP dar sudaro M. avium subsp. hominissuis, M. avium subsp. avium ir M. avium subsp. silvaticum bei rūšis M. intracellulare (16). Tai intraląstelinis parazitas, sukeliantis paratuberkuliozę (8). Molekulinių tyrimų pagalba buvo išskirti keli šios rūšies mikrobakterijų genotipai: galvijų tipas – C, avių – S. Ligą galvijams, ožkoms, elniams ir kupranugariams dažniausiai sukelia C genotipas. Dar vienas genotipas, vadinamas „bizonų genotipu“, buvo rastas bizonų populicijoje JAV. Aprašytas MAP genotipas, išskirtas iš Indijos bizonų ir vadinamas „Indijos bizonų genotipu“. Šis genotipas būdingas naminiams bei laukiniams atrajotojams (1).
MAP yra aerobinės, silpnai rūgštims teigiamos, gram teigiamos, tarpinės formos tarp lazdelės ir koko, 0,5-1,5 µm dydžio bakterijos (1 priedas). Bakterijos in vitro auginamos ir kultyvuojamos terpėse su mikobaktinu (3). Mikobaktinas dalyvauja visų mikobakterijų, tame tarpe ir MAP metabolizme (17). Šie mikroorganizmai gali daugintis tik gyvame šeimininko organizme, makrofaguose, panaudodamos geležį savo metabolizmo procesuose (6,7,17). Bakterijos terpėse auga dažniausiai 12-16 savaičių (18).
Lėtas bakterijų augimas siejamas su stora, lipidinių bei vaškinių komponentų turinčia, sienelės sandara (1). Mikobakterijų sienelė turi unikalių savybių, yra nepralaidi daugeliui junginių, tad dėl šios priežasties, mikobakterijos pasižymi dideliu atsparumu daugeliui vaistų. Bakerijos sienelė sudaryta iš išorinio ir vidinio sluoksnių, kurie supa plazminę membraną. Išorinis sluoksinis susideda iš lipidų ir baltymų. Vidinis sluoksnis sudarytas iš kovalentinėmis jungtimis sujungtų peptidoglikanų, arbabinoglikanų ir mikolio rūgšties, kurie tęsiasi nuo plazminės membranos sluoksniais į išorę (18). MAP atsparios džiūvimui, daugeliui dezinfekcinių priemonių bei ilgą laiką išgyvena vandenyje, dirvožemyje ir išmatose (1).
1.2. Imuninis atsakas
Bakterija patenką su pašaru į virškinamąjį traktą. Pasiekusi plonojo žarnyno gleivinę, MAP turi gebėjimą pereiti į dviejų tipų ląsteles: M ląsteles, kurios dengia Pejerio plokšteles ir dalyvauja antigenų priėmimo funkcijoje bei jų pateikimą intraepiteliniams limfocitams; bei enterocitus (19). Pagal vieno tyrimo rezultatus, į M ląsteles avių žarnyne (klubinėje ir tuščiojoje žarnose) patenka daugiau MAP nei į enterocitus (20). Žarnyno gleivinė veikia kaip pirminis barjeras prieš patogenus, tačiau MAP sugeba apeiti šį barjerą, sukeldama lėtinę infekciją šeimininko organizme (21). Patekusios į M ląsteles, bakterijos yra atsparios intraląsteliniam sunaikinimui. M ląstelės nepasižymi pakankama hidrolitinių fermentų gausa bei pakankamo subrendimo endosomomis, jog
11
MAP būtų sunaikinta (22). Bakterijas fagocituoja žarnų gleivinės poepiteliniai makrofagai (6). MAP sugeba sustabdyti magrofagų gebėjimą jas fagocituoti, todėl lengvai išsilaiko makrofaguose, kurie tampa bakterijų augimo rezervuaru (23). Šiuo periodu organizme yra maža reakcija į infekciją arba jos nėra iš viso (6). Atlikti tyrimai, kurių metu nustatyta, jog į pelių ir karvių žarnų epitelio ląsteles MAP patenka per 30 minučių, o į lamina propria sritį prasiskverbia per 1 valandą (19).
MAP lokalizuojasi šeimininko makrofagų fagosomose arba endosomose (7). Didžiausia bakterijų sankaupos vieta yra klubinės žarnos Pejerio plokštelių makrofagai. Dendritinės ląstelės iš lamina propria srities, taip pat gali transportuoti MAP, sugavusios šiuo antigenus savo ląstelių ataugomis bei atpažinusios per specifinius receptorius. Antigenai dendritinių ląstelių yra nunešami į regioninius limfinius mazgus. Būtent dėl šios priežasties MAP gali migruoti po limfinius mazgus (19). Infekcija dažnai sukelia limfinių mazgų hiperplaziją, su padidėjusiu juose T ir B limfocitų skaičiumi bei padidėjusiomis makrofagų infiltracijomis (24).Ypač sunkiais atvejais, esant gausiam užsikrėtimui ir nusilpusiam imunitetui, MAP bakterija gali lokalizuotis ir kitų audinių makrofaguose. Bakterijos iš limfinių mazgų gali būti išnešiotos po visą organizmą (20).
Po pirminio kontakto su MAP, vyksta būdingas T ląstelių atsakas, kurio metu atpalaiduojami priešuždegiminiai citokinai, tokie kaip gama interferonas (INF-γ), interleukinas 1α (IL-1α), IL-6 bei IL-2. Kadangi MAP daugiausiai auga makrogafuose, priešuždegiminis ir citotoksinis atsakas yra labai svarbus infekcijos kontrolėje organizme. Nepaisant to, esant vėlesnei subklinikinės MAP infekcijos fazei, 1 tipo priešuždegiminis imuninis atsakas dažniausiai nuslopsta. Vėlyvoje ligos stadijoje vyrauja 2 tipo uždegiminis atsakas, kurio metu padidėja G1 imunoglobulino (IgG1) gamyba. Šis dominuojantis imuninis atsakas, dažnai siejamas ir su ligos progresavimu iki klinikinių požymių pasireiškimo. Mechanizmas, dėl kurio prarandamas 1 tipo imuninis atsakas į MAP, nėra žinomas, bet siejamas su šeimininko genetiniais faktoriais, dėl kurių sukėlėjas išsilaiko makrofaguose (24).
Atliekant tyrimus su genetiškai modifikuotomis pelėmis įrodyta, kad citokinai vaidina svarbų vaidmenį šeimininko organizme prieš mikobakterijas. Pelės, su citokino IL-10 deficitu, sugeba geriau kontroliuoti MAP infekcija nei tos pelės, kuriose genas, atsakingas už IL-10 sintezę, nėra pašalintas (25). Pelėms, kurios pasižymi IL-4 trūkumu, pastebima didesnė mikobakterijų sukelta patologija. Taip pat ir pelės, kurioms trūksta alfa auglių nekrozės faktoriaus (TNF-α), jautresnės infekcijai. TNF-α dalyvauja jaunų makrofagų aktyvavime, o taip pat formuojantis granuliomoms, esant mikobakterijų infekcijoms. Granuliomos izoliuoja infekcijos židinį, sulaiko bakterijų plitimą ir tokiu būdu apsaugo, kad neatsirastų naujų židinių (24).
Progresuojant MAP, makrofagai pritraukiami į infekcijos vietą. Jei jie tinkamai suaktyvinami, tuomet MAP gali būti sėkmingai sunaikinta fagocitozės būdu (26). Tačiau nėra TNF-α signalo,
12
kuris dalyvautų makrofagų aktyvavime. Šis citokinas gali būti slopinamas pačios MAP, per kol kas neištirtus mechanizmus (24).
Aktyvuoti žarnyno makrofagai produkuoja didelius kiekius IL-1α. Kai kuriais atvejais IL-1α produkcija gali pasiekti ypatingai aukšta lygį (10 kartų didesnį, negu normalus), kas veda prie tikimybės, jog DL klinikinis pasireiškimas tiesiogiai susijęs su IL-1α toksiniu poveikiu (27). Šio interleukino padidėjimas sutrikdo su TNF receptoriais susijusį 1 faktorių (TRAF1), kuris turi įtakos kitų citokinų ir receptorių aktyvavime, kurie tarpininkauja ląstelės mirties mechanizme (28).
1.4. Paratuberkuliozės epidemiologija
MAP infekcija plinta fekaliniu-oraliniu būdu, kadangi didžiausia jos koncentracija yra būtent išmatose (taip pat, MAP aptinkama ir krekenose, piene, spermoje). Taip pat, tyrimų rezultatai rodo, jog negalima atmesti ir oro lašelinio bakterijos plitimo būdo (2). Infekcija gali plisti ir per užkrėtus spenius, kraiką, ganyklą, dirvožemį ar vandenį. MAP nuo užsikrėtusių suaugusių gyvūnų daugiausiai plinta jų jaunikliams, kurie yra jautriausi infekcijai (6). Kuo jaunesnis gyvūnas užsikrečia MAP, tuo greičiau jis pradeda platinti bakteriją su išmatomis bei tuo greičiau progresuoja liga iki klinikinių požymių pasireiškimo (29,30). Įmanomas ir vertikalus užsikrėtimas, kuris taip pat gana dažnas. Sergantys gyvūnai, dar neturintys klinikinių požymių, atsiveda jauniklius, kurie jau būna užsikrėtę (transplacentinis užsikrėtimas). Nustatyta, jog vaisiaus gimdoje užsikrėtimas yra 9 proc. ir 39 proc. esant subklinikiniams ir klinikiniams ligos simptomams, atitinkamai. Tačiau nežinoma ar gimdoje užsikrėtusiam vaisiui, po atvedimo klinikiniai simptomai progresuoja greičiau ir MAP pradedama išskirti su išmatomis taip pat greičiau (2).
Inkubacinis periodas gali trukti 2-10 metų, priklausomai nuo patekusių MAP bakterijų kiekio bei nuo organizmo gebėjimo kovoti su infekcija (6). Veršeliai yra jautriausi ligai ir jei užsikrečia, mažiausiai 2-5 metus platina MAP su išmatomis, pienu ar krekenomis, nerodydami jokių klinikinių požymių (7).
MAP labai atspari aplinkos veiksniams ir gali išgyventi vandenyje, dirvožemyje ar mėšle iki 1 metų (31). Skysčiuose, esant +50C temperatūrai, MAP gali išgyventi ilgiau nei 9 mėnesius, o esant +150C temperatūrai – mažiausiai 3-5 mėnesius. Esant nepalankioms sąlygoms MAP gali pereiti į ramybės būseną (9).
PTB išplitusi visame pasaulyje tarp naminių ir laukinių atrajotojų populiacijos (3). Liga serga pieniniai ir mėsiniai galvijai, avys, ožkos, elniai, kupranugariai. Tačiau net ir monogastriniai laukiniais gyvūnai, tokie kaip lapės, žebenkštys, varnos, žiurkės, miškinės pelės, triušiai, kiškiai, barsukai buvo nustatyti kaip ligos pernešėjai (6).
PTB pokyčiai, sukelti MAP atrajotojams ir kitiems gyvūnams, panašūs į Krono ligos, kuria serga žmonės, sukeliamus pokyčius. MAP vaidmuo sukeliant Krono ligą intensyviai tiriamas jau
13
kelis dešimtmečius (1). Daugelis genų, kurie nulemia jautrumą mikobakterijų infekcijai, siejami ir su Krono ligos atsiradimu. MAP pas Krono liga sergančius pacientus aptinkama žymiai dažniau lyginant su kontroline sveikų pacientų grupe (2). Tad neatmetama galimybė, jog ši infekcija gali būti ir zoonozė (1).
1.4.1. Paratuberkuliozės paplitimas galvijų populiacijoje
Liga egzistuoja praktiškai visur, kur yra plėtojama galvijininkystė. Liga endemiškai papiltusi Europoje ir Šiaurės Amerikoje, kuriose bandų užsikrėtimas sudaro daugiau nei 50 proc (32). Kanadoje 32 proc. pieninių karvių bandose mažiausiai 2 karvės yra seroteigiamos šiai ligai (33). JAV mėsinių galvijų bandų užsikrėtimas varijuoja tarp 8-63 proc., remiantis serologiniais specifinių antikūnų kraujo serume tyrimais (34).
Jungtinėje Karalystėje liga taip pat paplitusi endemiškai, o užsikrėtusios bandos sudaro tris ketvirtadalius galvijų bandų (32). Tirtas MAP paplitimas pagal skirtingus genotipus 7 Europos šalyse (Čekijoje, Suomijoje, Graikijoje, Olandijoje, Norvegijoje, Škotijoje ir Ispanijoje) ir tyrimo metu buvo nustatytas šiose šalyse labiausiai paplitęs MAP bakterijos genotipas (IS900-RFLP C1), kuris jau anksčiau buvo nustatytas visoje Europoje, atsižvelgiant į kitose šalyse atliktus tyrimus bei paskelbtus rezultatus. Šis genotipas taip pat paplitęs ne tik Europoje, bet ir JAV, Australijoje, Naujoje Zelandijoje. Iš Norvegijoje ir Olandijoje išskirtų genotipų, buvo nustatyta, jog tokie patys genotipai paplitę ir Vokietijos bei Argentinos regionuose. Naujojoje Zelandijoje atlikto tyrimo, kuriuo metu buvo tiriami atskiruose ūkiuose paplitę MAP genotipai, rezultatai parodė, jog MAP bakterijos plitimui didelės įtakos turi galvijų judėjimas ir pervežimas iš vienos fermos į kitą (10). Liga nustatoma taip pat ir Azijos šalyse. Indijoje atlikto tyrimo metu buvo nustatyta, jog B tipo MAP štamas plačiai paplitęs visoje šalyje, tuo tarpu C štamas aptiktas tik keliuose iš galvijų imtuose mėginiuose. S štamas neaptiktas (35). Pagal Pasaulinės Gyvūnų Sveikatos Organizacijos (PGSO) duomenis, liga pasireiškusi visuose žemynuose, išskyrus Antarktidą, tiek naminių atrajotojų (2 priedas), tiek laukinių gyvūnų (3 priedas)populiacijose (11).
1.4.2. Paratuberkuliozės paplitimas laukinių atrajotojų ir kitų laukinių gyvūnų populiacijoje MAP aptinkama ir įvairių laukinių atrajotojų tarpe, kas PTB likvidavimą ar labiau apsukina (36). Danieliai yra vieni labiausiai pasaulyje paplitusių ir migruojančių po įvairius regionus gyvūnų. Danieliai sutinkami ne tik Eurazijos, bet ir Šiaurės ir Pietų Amerikos žemynuose kaip ūkiniai gyvūnai, zoologijos sodų gyventojai bei kaip laukinė populiacija (12). MAP Ispanijoje pirmą kartą buvo diagnozuota laisvai gyvenančių danielių populiacijoje – Astūrijos regione, šiaurinėje Ispanijoje, kur PTB yra endemiškai paplitusi danielių ir galvijų populiacijoje. Danieliai su galvijais, avimis ir ožkomis dalinasi tomis pačiomis ganyklomis, geria iš tų pačių balų, tad yra įmanoma, jog naminiai atrajotojai gali būti infekcijos šaltinis danielių populiacijai (13). Užsikrėtę laukiniai gyvūnai dažniausiai buvo aptinkami tuose arealuose, kuriuose buvo didelis PTB paplitimas naminių
14
atrajotojų populiacijoje (28). Gyvūnai užsikrečia, kai išgeria MAP užkrėstą pieną, krekenas, vandenį, suėda pašarą. Net jei atrajotojai užsikrečia, turi praeiti keletas metų, kol atsiranda klinikiniai požymiai bei MAP pradedama išskirti su išmatomis. Tad tokiu būdu PTB dažnai yra nepastebima ir nediagnozuojama. Vis dėlto, keletas klinikinių ligos atvejų buvo aprašytas tarp jaunų (1-2 metų amžiaus) nelaisvėje gyvenančių danielių. Tad galima daryti prielaidą, jog klinikiniai požymiai jaunų gyvūnų tarpe būdingesni laukiniams, o ne naminiams atrajotojams (37). Elnių jautrumas MAP buvo nustatytas ir plačiai aprašytas šalyse (Naujojoje Zelandijoje, Kanadoje, JAV, keliose Europos šalyse), kuriose vykdomas intensyvus šių gyvūnų auginimas. Žinoma atvejų, jog PTB pasireiškė protrūkio forma tarp jaunų elnių ir briedžių, tad liga linkusi greičiau progresuoti tarp šių rūšių, lyginant su galvijais. (14).
MAP infekuoja daugelį laukinių gyvūnų, kurie tampa potencialiais MAP rezervuarais. Tokie gyvūnai gali užkrėsti kitus jautrius ligai gyvūnus ir tampa didele problema PTB kontrolėje. Visi gyvūnai, kurie turi kontaktą su MAP užkrėstomis išmatomis, prisideda prie PTB pasyvaus platinimo. Laukiniai atrajotojai ir kiškiažvėrių būrio gyvūnai užsikrėtę MAP, išskirti bakteriją į aplinką su išmatomis ir tokiu būdu užkrečia kitas jautrias rūšis (15). Potencialiai jie gali tapti laukinės gamtos rezervuaru. Kadangi infekcija perduodam ir vertikaliu būdu, laukiniai rezervuariniai gyvūnai išlaiko MAP savo populiacijoje (38,39).
Kitos laukinių gyvūnų rūšys galėtų būti skirstomos į plėšrūnus ir maitėdas, kurie užsikrečia liga nuo užkrėsto grobio. Tokiems gyvūnams nepasireiškia jokie PTB klinikiniai požymiai, o užsikrėtimą įmanoma nustatyti tik pagal histopatologinius tyrimus. Tačiau tokie gyvūnai neturi labai didelės reikšmės MAP tarprūšiniam perdavimui (15).
1.5. Diagnostikos metodai
Diagnostikos metodus galima suskirstyti į tuos, kurie skirti mikroorganizmui identifikuoti ir tuos, kurie skirti identifikuoti imunologinę organizmo reakciją į mikroorganizmą. Šių metodu dėka galima nustatyti, kurie gyvūnai užsikrėtę, o kurie – neužsikrėtę (6). Dažniausiai PTB diagnostikai naudojami serologiniai tyrimai (40).
1.5.1. Imunofermentinė analizė
Tai paprastas, greitas ir ekonomiškas būdas MAP infekcijos nustatymui. Komerciniai imunofermentinės analizės (IFA) testai, skirti DL diagnostikai, pasižymi dideliu specifiškumu (nuo 90 proc. iki 99 proc.), bet būdingas mažas jautrumas (13,5-42 proc.) (7).
Atliekant IFA, nustatomas optinis tankis (OT) kraujo serume ar piene, kuris koreliuoja su MAP antikūnais (6). Buvo nustatyta, jog esant labai mažam MAP išskyrimui iš išmatų, IFA jautrumas yra 5-7 proc., o esant dideliam MAP bakterijų išskyrimui iš išmatų – metodo jautrumas siekia 70-80 proc. (7). Dėl ilgo ligos inkubacinio periodo ir ilgai besiformuojančio imuninio atsako, bakterijas sunkiau aptikti kraujo serume, jų daugiau išskiriama su išmatomis, tad tai ir yra
15
pagrindinė priežastis, kodėl IFA metodas nėra toks jautrus, lyginant su bakterijų kultūrų metodu (6). Australijoje atlikto tyrimo metu, buvo nustatyta, jog IFA jautrumas tarp 2, 3 ir 4 metų amžiaus galvijų buvo 1,2 proc., 8,9 proc. ir 11,6 proc. atitinkamai, bet buvo 20-30 proc. vyresnėse amžiaus grupėse. Bendrai paėmus, visose amžiaus grupėse, jautrumas buvo 15 proc. (41). Kitų autorių teigimu (42) IFA jautrumas varijuoja tarp 7-94 proc., o specifiškumas tarp 40-100 proc.
Dauguma MAP bakterijų turi ir kitoms MAP bakterijoms būdingus antigenų epitopus, tad pasižymi kryžminiu reaktyvumu, kas lemia klaidingai neigiamus tyrimų rezultatus. Šis faktorius yra problema IFA metodu nustatant ne tik DL, bet nustatant ir kitas ligas, sukeliamas mikobakterijų (žmonių tuberkuliozę, galvijų tuberkuliozę) (7). Tad taikomi metodai, skirti sumažinti kryžminį jautrumą. Prieš tyrimą serumas apdorojimas naudojant Mycobacterium phlei baltymų lizatus, tokiu būdu sumažinant kryžminį jautrumą ir to pasekoje atsirandančius klaidingai neigiamus tyrimų rezultatus (43,44).
Su galvijų ir ožkų pieno mėginiais nustatyta, jog IFA metodas, skirtas antikūnams piene nustatyti yra tiek pat specifiškas, tačiau mažiau jautrus nei IFA metodas, skirtas antikūnams kraujo serume nustatyti (45,46).
1.5.2. Kiti serologiniai tyrimų metodai
Imunodizufijos agaro gelyje metodas (IDAG) naudojamas PTB patvirtinti, kuomet pasireiškę klinikiniai ligos požymiai galvijams, avims, ožkoms. Kai kurių tyrimų, atliktų Naujoje Zelandijoje ir Australijoje, duomenimis IDAG metodas smulkiems atrajotojams jautresnis ir specifiškesnis nei IFA (47,48,49). Specifiškumas ir jautrumas IDAG lyginant su histologinių tyrimų rezultatais buvo 99-100 proc. ir 38-56 proc. atitinkamai (49). Tačiau, tiriant galvijus, sergančius subklinikine PTB, IDAG metodo jautrumas buvo tik 18, 9 proc. Tad metodas labiau tinkamas naudoti gyvūnams, jau turintiems klinikinių PTB požymių (6).
Komplemento surišimo reakcija (KSR) daugelį metų buvo naudojama PTB diagnostikai, tačiau šį metodą pakeitė IFA (50). Vokietijoje KSR ir IDAG metodai diagnozuojant PTB nebetaikomi (43). Nepaisant to, IDAG metodą taikyti labiau verta nei KSR, nes IDAG metodas lengviau atliekamas bei paprastesnis rezultatų interpretavimas (51). Lyginant kelių IFA diagnostinių rinkinių ir KSR efektyvumą, buvo įrodyta, jog IFA pranašesnė, diagnozuojant PTB (52).
1.5.3. Bakteriologiniai tyrimų metodai
MAP audinių kultūros laikomos idealiu auksinio standarto metodu, nes netgi prieš tai, kai MAP pradedama išskirti su išmatomis ar kol pasireiškia imuninės sistemos atsakas, bakterijų kultūrose jau galima nustatyti MAP. Bakterijos augimą galima nustatyti paėmus mėginius iš žarnyno gleivinės, pogleivinės ir regioninių limfinių mazgų. Tačiau tai brangus metodas, audinių kultūrų mėginius surinkti sudėtingiau, tad dažiau kaip auksinio standarto metodas naudojamos bakterijų kultūrų auginimas iš išmatų (6).
16
Išmatų tepinėliai ar iš žarnyno gleivinės padaryti tepinėliai tiriami mikroskopiškai, nudažius Cylio-Nilseno dažymo būdu. Tačiau išvadų apie diagnozę daryti negalima, tiriant vien šiuo metodu. Šio tyrimo trūkumas tas, jog tepinėlyje neįmanoma diferencijuoti kokia tai mikobakterijų rūšis, ir tik nedaugeliu atveju, taikant vien tik šį metodą, galima patvirtinti diagnozę (42).
Daugybė skirtingų terpių naudojamos auginant MAP kultūras. Standartinė terpė, skirta MAP auginimui – Heroldo kiaušinio trynio terpė; tačiau iki pastebimas šios lėtai augančios bakterijos augimas terpėje, praeina dažniausiai 16 savaičių (6). Tai vienintelis metodas, kuris yra 100 proc. specifiškas ir negalimi klaidingai teigiami rezultatai. Tačiau teoriškai įmanoma, jog gaunami klaidingai teigiami rezultatai, jeigu bakterijos ant išmatų pateko nuo užterštų jomis daiktų, nors gyvūnas, kurio išmatų mėginiai imti, nėra užsikrėtęs (42).
1.5.4. Polimerazės grandininė reakcija
McFadden bei kiti mokslininkai nustatė geno IS9000 sritį, kuri būdinga MAP bakterijai (53). Palyginti su kultūrų metodu, polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra daug greitesnė. Vis dėlto, PGR mažiau jautrus metodas nei kultūrų metodas. Taip pat, manoma, jog IS9000 geno sritis nėra specifinė vien tik MAP bakterijai. IS9000 buvo nustatytas ir kitoje mikobakterijų štamuose, išskirtuose iš atrajotojų išmatų. PGR naudojamas kaip patvirtinamasis metodas, prieš tai atlikus tyrimus bakterijų kolonijų metodu. Jei PGR būtų naudojamas kaip vienintelis metodas, būtų gauta daug klaidingai teigiamų tyrimų rezultatų (6).
1.5.5. Skrodimas
Dažniausiai nebūna koreliacijos tarp klinikinių požymių ir pakitimų žarnyne. Žarnų gleivinė, ypač klubinės žarnos, turi būti ištirta ar nėra patologinių sustorėjimų ar gleivinės raukšlių. Elniams, sergantiems MAP skrodimo metu nustatomos žarnų gleivinės hiperemija, erozijos bei taškinės kraujosruvos. Dažnai būna mezenterinių limfmazgių padidėjimas ir edema (54).
1.6. Kontrolė
Infekcijos pasireiškimas pas kiekvieną gyvūną yra genetiškai nulemtų veiksnių (jautrumo ir atsparumo genai) bei aplinkos veiksnių (MAP koncentracija) derinys. Vykdant genetinę atranką, taip pat galima sumažinti gyvūnų skaičių, kurie jautrūs PTB (2). Bandoje, PTB kontrolės pagrindas – gera biosauga, užtikrinanti, jog MAP bakterija nepatektų. Kartą įdiegta biosaugos programa, nors ir brangi, tačiau garantuoja infekcijos prevenciją (34).
Austrijoje PTB ryškiai pasireiškė 2006 metais. Kontrolės programos labiausiai orientuotos į gyvūnus, kuriems pasireiškę klinikiniai ligos požymiai. Ūkiuose, kuriuose nustatyta MAP bakterija, įdiegtos valdymo priemonės, skirtos kontroliuoti MAP plitimą. Belgijoje, bandos, kuriose vykdomos PTB kontrolės programos, vyresni nei 30 mėnesių gyvūnai, tiriami serologiškai, imant kraują arba pieno mėginius. Danijos 29 proc. bandų ir 40 proc. karvių įtrauktos į kontrolės programas nuo 2009 metų birželio mėnesio. Visos šios bandos tiriamos 4 kartus per metus,
17
serologinių tyrimų metodais ir karvės klasifikuojamos į aukštos PTB rizikos ir žemos PTB rizikos grupes. Prancūzijoje skirtingos kontrolės programos taikomos skirtinguose šalies regionuose. Olandijoje bandos tiriamos mažiausiai 2 kartus per metus (55). Panašios priemonės, remiantis užsienio autorių duomenimis, taikomos ir kitose Europos šalyse (Jungtinėje Karalystėje, Vokietijoje), o taip pat ir Japonijoje bei Kanadoje (56,57).
Ūkių darbuotojai turėtų būti šviečiami apie MAP riziką ir infekcijos sukeliamus ekonominius nuostolius, tinkamą higieną bei biosaugos priemones. Šios priemonės nėra specifinės vien tik MAP bakterijai, bet taikomos, siekiant apsisaugoti ir nuo kitų patogenų. Ligos kontrolės programa susideda iš trijų elementų: švietimo, ūkių vadybos bei bandos klasifikavimo (34).
1.6.1. Neužkrėstų bandų kontrolė
Į bandas, kurios dar nėra infekuotos MAP, nereiktų atsivežti galvijų iš bandų, kuriose patvirtinta MAP infekcija. MAP užkrėstų bandų valdymas turėtų vykti derinant šia tris strategijas: naujai užsikrėtusių gyvūnų prevencija (biosauga, higiena, bandos valgymo strategijos), jau užsikrėtusių gyvūnų tvarkymas (tyrimų atlikimas, brokavimas) ir atsparumo PTB didinimas (vakcinavimas, genetinė atranka). Šios strategijos gali būti naudojamos įvairiai, atsižvelgiant į tai ar siekiama stabilizuoti, ar sumažinti paplitimą, ar likviduoti ligą (2). Norint, jog būtų gautas pageidaujamas efektas, kontrolės programa turi būti bandai specifinė ir bandos savininkas turi prisiimti atsakomybę, jog šios programos būtų laikomasi. To galima pasiekti, sudarius ūkiui skirtą rizikos vertinimo ir valdymo planą (RVVP). (58,59) Nors šiai programai svarbios informacijos rinkimas užima daug laiko ūkyje, tačiau tai kontrolės programos pagrindas (60). Užsikrėtusios bandos valdymas užima ilgą laikotarpį (10 ir daugiau metų) ir reikalauja nuolatinio monitoringo, jog kontrolės programa būtų nuolat vykdoma. Tyrimų duomenys rodo, jog taikant ilgalaikes kontrolės strategijas DL gali būti labai sėkmingai kontroliuojama (61).
1.6.2. Jauniklių kontrolė
Jautriausi infekcijai gyvūnai bandose – ką tik gimę veršeliai bei jauni gyvūnai, tad šiose gyvūnų grupėse kontrolės programos itin svarbios (2). Ūkiai, kontroliuojantys DL, turėtų išbrokuoti veršelius, kuriuos atsivedė karvės, turinčios klinikinių ligos požymių. Ūkiai, mėginantys visiškai likviduoti DL, turėtų išbrokuoti jauniklius, kurie gimė prieš metus iki karvėms pasireiškė klinikiniai požymiai, taip pat išbrokuoti gyvūnus, gimusius subkliniškai infekuotoms karvėms (62). Infekcijos perdavimą lengviausia sustabdyti naujagimius veršelius ir jaunus gyvūnus atskyrus nuo suaugusių galvijų, jog nebūtų kontakto su pastarųjų išmatomis. Patartina atskirti ne tik ką tik gimusius veršelius nuo karvių, bet ir veršelių auginimui skirtas patalpas, nuo patalpų, kuriose laikomi suaugę galvijai. Laikant gyvūnus atskirose patalpose, užkertamas kelias MAP plisti oro lašeliniu būdu (kartu su dulkėmis). Taip pat, turėtų būti naudojami ir atskiri pašarų skirstymo, mėšlo valymo įrenginiai (2).
18
1.6.3. Užsikrėtusiu gyvūnų kontrolė
Užsikrėtusių gyvūnų kontrolė turėtų būti vykdoma pagal RVVP, kuris specifinis kiekvienam ūkiui. Į RVVP įeina ekonomiškai nenuostolingi diagnostikos metodai, skirti nustatyti gyvūnų užsikrėtimą ir leidžiantys klasifikuoti juos į tam tikras grupes. Komercinėje pieninių galvijų bandoje, kurioje MAP infekcijos paplitimas >5 proc., ir kurioje siekiama infekcijos paplitimą sumažinti, galvijai turėtų būti skirstomi į 3 grupes:
1. įtariant ligą iš klinikinių požymių – išbrokuojama nedelsiant.
2. didelė užsikrėtimo galimybė, patvirtinta tyrimais (aukšta IFA tyrimo OT reikšmė): išbrokuojama nedelsiant.
3. vidutinė užsikrėtimo galimybė bei abejotini tyrimų rezultatai – išbrokuojami, jeigu yra ir kitų problemų arba išbrokuojami laktacijos pabaigoje, neveisiami.
4. maža užsikrėtimo galimybė bei neigiami tyrimų rezultatai (žema IFA tyrimo OT reikšmė) – neveisti, išbrokuoti kitos laktacijos pabaigoje, nenaudojamos krekenos (2). Nekomerciniuose ūkiuose dažniausiai nenorima brokuoti užsikrėtusių gyvūnų. Tačiau būtina atsižvelgti į keliamą tokių gyvūnų pavojų (2). Panaši kontrolės programa vykdoma Olandijoje. Bandos suskirstomos į: MAP neigiamas; MAP teigiamas, kuriose visi teigiami gyvūnai pašalinami iš bandos; MAP teigiamas, kuriose gyvūnai nėra pašalinami iš bandos (55).
1.6.4. Vakcinavimas
Pirmą kartą vakcinavimas prieš PTB aprašytas 1926 metais. Vakcina pripažinta gera priemone, siekiant kontroliuoti šią ligą tarp galvijų ir smulkių atrajotojų. Pietinėse Europos šalyse bei Australijoje, vakcinacija sėkmingai naudojama DL kontrolei, ypatingai avių ir ožkų ūkiuose (63). Galvijams vakcinos rečiau naudojamos daugelyje šalių. Tai lemia tai, jog gali būti klaidingai interpretuojami galvijų tuberkuliozės tyrimai, kadangi gali įvykti kryžminė reakcija (64). JAV naudojama Mycopar vakcina, kuri yra vienintelė, skirta nuo PTB. Vakcina pagaminta iš MAP negyvų ląstelių ir aliejinio adjuvanto. Tyrimais įrodyta, kad dauguma atvejų vakcina apsaugo nuo klinikinių požymių progresavimo pas galvijus, kurie jau užsikrėtę. Vakcinavimas yra svarbi RVVP dalis. Labiau pasiteisinęs yra avių vakcinavimas. Australijoje vakcinacija 90 proc. sumažino ligos paplitimą avių bandose. Tad vakcinacija Australijoje tapo reikšminga DL kontrolės dalimi (2).
19
2. MEDŽIAGOS IR METODAI
PTB paplitimo Lietuvoje tyrimui atlikti buvo naudoti galvijų ir laukinės faunos gyvūnų kraujo serumo mėginiai. Šie mėginiai buvo rinkti 2006-2015 metais, įvairiuose Lietuvos ūkiuose bei iš pavienių gyvūnų laikytojų. Mėginiai buvo rinkti 44 Lietuvos regionuose. Buvo imti veršelių, telyčių, buliukų, pieninių galvijų, mėsinių galvijų, laukinės atrajotojų faunos kraujo mėginiai. Iš viso PTB atžvilgiu tirti 15970 galvijų, 1779 danielių, 2749 elnių, 310 muflonų, 19 stumbrų, 1 antilopės ir 1 alpakos kraujo serumo mėginių.
Visi kraujo serumo mėginiai buvo tiriami Nacionaliniame maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institute (NMVRVI), Jono Kairiūkščio g. 10, Vilniuje, Serologinių tyrimų skyriuje. Mėginiai buvo pristatomi kartu su lydraščiais, kuriuose buvo nurodyta informacija apie gyvūnų rūšį, veislę, lytį, amžių, ūkį, rajoną, nurodytas tyrimo tikslas.
Į laboratoriją pristatyti kraujo mėginiai pirmiausiai registruojami. Kraujo serumui gauti mėginiai centrifuguojami. Serumas laikomas šaldytuve +2-80C temperatūroje, mėgintuvėliuose, kurie sudėti į stovus. Šaldytuve įmontuotose termometruose rodoma temperatūra, kuri kasdien tikrinama ir registruojama. Tokiu būdu kraujo serumo mėginiai laikomi iki 5 dienų. Mėginiai, kurių rezultatai buvo abejotini arba teigiami, saugomi iki 1 mėnesio. Jeigu kraujo serumas laikomas ilgesnį laiką, negu 5 dienas, tuomet laikoma -200C temperatūroje.
PTB specifiniams antikūnams kraujo serume nustatyti buvo naudoti IFA diagnostiniai rinkiniai „IDEXX MAP Ab Test“, „IDEXX Paratuberculosis Screening Ab Test“, „IDEXX Paratuberculosis Verification Ab Test“. Tyrimai buvo atlikti, laikantis IFA diagnostinių rinkinių gamintojų nurodytų metodinių reikalavimų. Prieš atliekant tyrimą, jam skirti reagentai yra laikomi kambario temperatūroje, o baigus tyrimą – sudedami atgal į tam skirtus šaldytuvus, kurių temperatūra +2-80C. IFA tyrimui NMVRVI, Serologinių tyrimų skyriuje, naudojami apžvalginis ir
patvirtinamasis diagnostiniai rinkiniai. Patvirtinamasis rinkinys jautresnis ir specifiškesnis, tuo tarpu atliekant tyrimą vien su apžvalginiu diagnostiniu rinkiniu – įmanomos kryžminės reakcijos ir dėl to gaunami galimai klaidingi rezultatai (65).
2.1. Imunofermentinės analizės metodo principas
Mikroplokštelėje yra 96 šulinėliai, padengti MAP antigenu. Metodo esmė – MAP bakterijos ir kraujo serume susidariusių specifinių bakterijai antikūnų reakcija, kurios metu susidaro antikūno-antigeno kompleksas. Šis kompleksas lieka mikroplokštelės šulinėliuose, o nesurištos pašalinės medžiagos išplaunamos. Įpilamas konjugatas, kuris reaguoja su šulinėlyje esančiu antigeno-antikūno kompleksu ir tokiu būdu jį išryškina. Konjugatas yra specifinis, savo sudėtyje turintis fermentą – krienų peroksidazę. Daromas plovimas, po kurio pilama substrato – tetrametilbenzidino (TMB), kuris skaldo konjugato fermantą ir spalva pasikeičia į mėlyną. Reakcija stabdoma „STOP“
20
tirpalu. Tuomet spalva pasikeičia iš mėlynos į geltoną. Kuo intensyvesnė geltona spalva, tuo daugiau specifinių antikūnų yra kraujo serumo mėginyje. Toliau matuojamas optinis tankis spektofotometru, esant 450 nm bangos ilgiui.
Siekiant užtikrinti, jog nebūtų kryžminės reakcijos, dėl kurios būtų gauti klaidingai teigiami tyrimo rezultatai, pačioje tyrimo pradžioje naudojamas M. phlei ekstraktas. Prieš išpilstant mėginius į mikroplokštelių šulinėlius, padengtus MAP antigenu, mėginiai praskiedžiami skiedimo buferiu, su M. phlei ekstraktu ir inkubuojami. Pasibaigus inkubacijai, mėginiai pernešami į MAP antigenu padengtos mikroplokštelės šulinėlius (65).
2.1.1. Apžvalginė imunofermentinė analizė
Kraujo serumas praskiedžiamas skiedimui skirtu buferiniu tirpalu santykiu 1:20. Sukratoma specialia purtykle ir inkubuojama nuo 15 minučių iki 2 valandų, +18-260C temperatūroje. Po
inkubavimo, mėginiai perkeliami į antigenu padengtą mikroplokštelę. Atliekami tokie pernešimai: 100 μl praskiesta neigiama kontrolė (N) pernešama į A1 šulinėlį;
100 μl praskiestos teigiamos kontrolės (T) pernešama į B1, C1 šulinėlius;
po 100 μl kiekvieno praskiesto mėginio (šiuo atveju – kraujo serumo) pernešama į atskirus šulinėlius (D1, E2, F3 ir t.t.) (65).
Šaltinis: http://www.bio-rad.com/frfr/product/empty-microplates/diamed-ihmp-microplates
1 pav. Mėginių išpilstymo seka mikroploštelėje apžvalginiu IFA metodu
Mikroplokštelės turinys sumaišomas lengvai pakračius purtykle. Mikroplokštelė uždengiama dangteliu ir inkubuojama 45 minutes (±5 min.), +18-260C temperatūroje arba per naktį (16-24
valandas), +2-80C temperatūroje (65).
Po inkubavimo, į šulinėlius pilama 300 μl plovimo tirpalo. Mikroplokštelę kratant, plovimo tirpalas išpilamas. Tuomet procesas kartojamas. Iš viso atliekami 3-5 plovimai. Atlikus paskutinį plovimą, mikroplokštelės turinys stipriai išpurtomas į sugeriamą popierių (65).
21
Į kiekvieną šulinėlį pilama 100 μl konjugato tirpalo. Priklausomai nuo to, kiek laiko bus inkubuojama, pasirenkami skirtingi konjugato ir skiedimo buferio santykiai. Jei inkubuojama 30 minučių (±5 min.), +18-260C temperatūroje, tai konjugatas turi būti skiedžiamas su skiedimo
buferiu santykiu 1:100. Jei inkubuojama per naktį (16-24 val.), +2-80C temperatūroje – skiedžiama
santykiu 1:200. Atskiestas skiedimo buferiu konjugatas išpilstomas į kiekvieną šulinėlį po 100 μl. Mikroplokštelė uždengiama dangteliu ir inkubuojama (65).
Po inkubavimo, į šulinėlius pilama 300 μl plovimo tirpalo. Ir plovimo procesas kartojamas taip pat, kaip ir aprašyta prieš tai, plaunant 3 kartus. Išpurčius paskutinį plovimo tirpalą, negalima leisti išdžiūti šulinėliams, tyrimas turi būti nedelsiant tęsiamas (65).
Toliau į kiekvieną šulinėlį po 100 μl pilamas substrato tirpalas – TMB. Inkubuojama tamsoje 10 minučių (±3 min.), +18-260C temperatūroje. Po inkubavimo reakcija sustabdoma, įpilant 100 μl
„STOP“ tirpalo į kiekvieną šulinėlį. Švelniai papurtant mikroploštelę, jos turinys išmaišomas. Atliekamas OT matavimas spektrofotometru (šviesos bangos ilgis 450 nm) (65).
2.1.2. Patvirtinamoji imunofermentinė analizė
Patvirtinamasis metodas taikomas, siekiant paneigti arba patvirtinti diagnozę. Metodo principas ir atlikimas tokie patys, kaip ir tiriant apžvalginiu IFA metodu. Vienintelis skirtumas – kraujo serumo mėginių pilstymo tvarka mikroplokštelėje:
100 μl praskiesta neigiama kontrolė (N) pernešama į A1 ir A2 šulinėlius;
100 μl praskiestos teigiamos kontrolės (T) pernešama į B1, B2, C1 ir C2 šulinėlius; po 100 μl praskiesto kiekvieno mėginio (šiuo atveju – kraujo serumo) pernešama į
atskirus šulinėlius (pirmas mėginys į šulinėlius D1, D2, antras mėginys – į šulinėlius E1, E2 ir t.t.) (65).
Šaltinis: http://www.bio-rad.com/fr-fr/product/empty-microplates/diamed-ihmp-microplates
22
2.1.3. Rezultatų skaičiavimas
Apskaičiuojamas procentinis santykis – inhibicijos procentas (IP), pagal formulę: M/T=100x(mėginio OT450 – neigiamos kontrolės OT450) / teigiamos kontrolės OT450 vidurkis –
neigiamos kontrolės mėginio OT450). Šioje formulėje M – koreguoto mėginio OT450 reikšmė; T –
koreguoto teigiamos kontrolės vidurkio OT450 reikšmė. Formulė suvesta į spektrofotometrą, tad kai
matuojamas mikroplokštelėje esančių mėginių OT450, apskaičiuojamas ir inhibicijos procentas bei
rezultatai. Pastarieji atspausdinami, baigus matavimus (65).
Interpretuojami gauti duomenys ir vertinamas IP pagal gautą M/T reikšmę. Esant neigiamam rezultatui (M/T ≤ 60%), vertinama, kad gyvūnas neužsikrėtęs MAP. Esant abejotinam rezultatui (M/T > 60% - <70%), vertinama, jog nėra aišku ar gyvūnas užsikrėtęs MAP. Tokiu atveju atliekamas pakartotinis tyrimas. Esant teigiama rezultatui (M/T ≥ 70%), vertinama, jog gyvūnas užsikrėtęs MAP (65).
2.1.4. Statistinė duomenų analizė
Tyrimo rezultatai ir statistiniai duomenys apskaičiuoti naudojant kompiuterinę programą „Microsoft Office Excel 2013“. Visi duomenys apie gyvūnus buvo sugrupuoti pagal gyvūno rūšį, veislę, amžių, lytį; taip pat duomenys grupuoti pagal rajonus, mėginių ėmimo tikslą, mėginių grupę, tyrimo paskirtį, metus – kada imti mėginiai. Buvo apskaičiuoti statistinių duomenų aritmetiniai vidurkiai (x), standartinis nuokrypis (), vidurkio paklaida (Sx), variacijos koeficientas (Cv,%), pasikliautinis intervalas (95%PI). Skirtumas buvo laikomas statistikai patikimas, jei p<0,05 jei p>0,05 – laikoma, jog duomenys nepatikimi ir statistiškai nereikšmingi.
23
3. TYRIMO REZULTATAI
Specifinių antikūnų tyrimai PTB atžvilgiu bei gautų rezultatų analizė atlikta 2006-2015 metų laikotarpyje.
3 pav. Bendras galvijų ir laukinių atrajotojų skaičius, tirtas 2006 – 2015 metais paratuberkuliozės atžvilgiu1
Vertinant surinktus Lietuvos duomenis apie atliktus PTB tyrimus skirtingoms gyvūnų rūšims, nustatyta, kad 2006, 2007 ir 2010 metais tyrimas buvo atliekamas tik galvijams. Antikūnų tyrimai nuo 2008 metų parodė, kad PTB atžvilgiu jie buvo atliekami ir laukiniams gyvūnams – danieliams ir elniams (3 pav.) Nuo 2012 metų PTB tyrimai pradėti atlikti ir muflonams, taip pat pastebimas šių tyrimų didėjimas nuo 2012 iki 2015 metų - atliekamų tyrimų muflonams padidėjo 12 ± 1 proc. (p<0,05)
Atliekamų tyrimų didėjimas tai pat buvo nustatytas danieliams ir elniams. Nuo 2008 metų, kai pradėtas PTB tyrimas elniams, iki 2015 metų, tyrimų skaičius padidėjo 5,4 ± 0,01 karto. Lyginant 2014 ir 2015 metus pastebima, kad elniams atliekama 2 kartus mažiau tyrimų, o danieliams atliekamų tyrimų skaičius nuo 2008 metų iki 2014 metų padidėjo 8 ± 0,2 karto. Kaip ir elniams atliekamų tyrimų skaičius paskutiniais metais sumažėjo, taip ir danieliams atliekamų tyrimų skaičius sumažėjo 3,4 ± 0,01 kartus. Daugiausiai PTB tyrimų galvijams buvo atlikta 2012 metais,
1 Analizėje neįtrauktas 21 mėginys (1 – Antilopės (2008 m.), 1 – Alpakos (2009 m.), 19 – stumbro (18 mėg. 2013 m., 1
mėg. 2014 m.) 0% 20% 40% 60% 80% 100% 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 0 0 0 0 0 0 88 30 92 100 960 334 451 67 1131 3658 5740 1217 1395 1017 68 56 488 451 555 161 125 24 335 223 1361 681
24
mažiausiai – 2009 metais; danieliams daugiausiai – 2014 metais, mažiausiai – 2009 metais; elniams daugiausiai – 2014 metais, mažiausiai – 2011 metais; muflonams – daugiausiai 2015 metais, mažiausiai – 2013 metais. (p<0,05)
Vertinant bendrą PTB specifinių antikūnų pasiskirstymą gyvūnų populiacijose nuo 2006 metų iki 2015 metų, galvijų tarpe tokių antikūnų buvo nustatyta 1,7 ± 0,01 proc. (95%PI 78-2,22). Muflonų nuo 2006 metų iki 2015 metų antikūnų buvo nustatyta buvo 4,19 ± 0,01 proc. (95%PI 1,35-6,65), elnių antikūnų buvo nustatyta nuo 2006 metų iki 2015 metų 0,14 ± 0,1 proc. (95%PI 0,002-0,95).
4 pav. Galvijų paratuberkuliozės atžvilgiu specifinius antikūnus turėjusių kraujo serumo mėginių pasiskirstymas 2006-2015 metų laikotarpyje
PTB atžvilgiu teigiamų galvijų skaičius nuo 2006 iki 2007 metų padidėjo 11 kartų, tačiau 2008 metais serologiškai teigiamų PTB nebuvo nustatyta. Laikotarpyje nuo 2009 iki 2015 metų PTB atžvilgiu teigiamų galvijų buvo nustatyta reikšmingai daugiau lyginant su 2006-2008 metų laikotarpiu (p<0,05). Taip pat 2014 metais buvo daugiausiai registruota teigiamų DL atvejų: tirti 38 galvijai, o antikūnų buvo rasta 5,9 proc. ± 0,1 proc. (95%PI 0,04 11,64). 2012-2013 metų laikotarpyje PTB specifinius antikūnus turėjusių galvijų serumo mėginių padidėjo iki 44,8 ± 0,01 proc. (95%PI 43,83-46,17).Ir labai panašiame lygyje (44,7 proc. ± 0,01 proc.; 95%PI 43.09-46.91) išliko ir 2013 – 2014 metais. 2 22 0 2 2 20 32 58 82 52 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 T eigi am ų m ėgin ių sk aičiu s Metai
25
1 lentelė. Teigaimų galvijų paratuberkuliozės atžvilgiu mėginių pasiskirstymas tarp Lietuvoje laikomų galvijų veislių 2006 – 2015 metais
Metai LŽ LJ AA AB DJ DŽ ŽH H LI VB Veislė nenurodyta Viso 2006 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2007 17 0 0 0 0 0 0 1 4 0 0 22 2008 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2009 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 2 2010 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 2 2011 3 9 0 0 1 1 0 1 4 0 1 20 2012 1 9 0 0 7 0 0 9 2 0 4 32 2013 0 4 1 0 0 0 0 45 4 1 3 58 2014 4 27 0 1 0 0 2 22 10 0 16 82 2015 6 29 0 0 0 1 1 7 8 0 0 52 Viso 31 78 1 1 8 2 3 85 35 1 27 272
Lyginant galvijų veisles nuo 2006 iki 2015 metų pastebima, kad PTB specifiniai antikūnai dažniausiai nustatomi Lietuvos juodmargėms ir Holšteinams (1 lentelė). Rečiausiai antikūnai buvo nustatyti Vietiniams baltanugariams, Angusams ir Aubrakams, tačiau šie duomenys negali būti laikomi labai patikimais, nes tyrimams pavyko surinkti nevienodus ir nedidelius galvijų serumo mėginių kiekius.
Daugiausia Holšteinų veislės galvijams paratuberkuliozės antikūnai buvo nustatyti 2013 metais, o Lietuvos juodmargių veislės galvijams – daugiausiai teigiamų atvejų užregistruota 2015 metais.
5 pav. Paratuberkuliozės atžvilgiu serologiškai teigiamų galvijų procentas 2006-2015 metų laikotarpiu 0,21 6,59 0,00 2,99 1,56 4,20 0,56 4,77 5,88 5,11 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 P ar atub er k u li oz ės n u stat ym as p roc . Metai
26
Didžiausias PTB teigiamų galvijų kraujo serumo mėginių procentas (6,59 ± 0,01 proc.; 95%PI 0,26-13,74) buvo nustatytas 2007 metais (5 pav.). Imunologinio tyrimo metu buvo nustatyta, kad nuo 2012 iki 2014 metų buvo fiksuojamas serologiškai teigiamų PTB mėginių didėjimas. Specifinių antikūnų nustatymo tendencijos mažėjimas buvo fiksuojamas 2008 metais (lyginant su praėjusiais metais teigiamų ligos pasireiškimų sumažėjo 6,59 proc.) ir 2012 metais (lyginat su 2011 metais PTB teigiamų atvejų sumažėjo 3,64 proc.) Vertinant paskutiniuosius tiriamuosius metus, pastebimas teigiamų PTB atžvilgiu galvijų skaičiaus sumažėjimas 0,77 proc. (p<0,05)
2 lentelė. Galvijų paratuberkuliozės serologinių tyrimų rezultatai Lietuvos apskrityse 2006 – 2015 m (proc.)2 Apskritys Metai 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 Alytus 3,92 4,32 0 9,09 0 1,29 1,03 4,2 2,45 0 Ignalina 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 Joniškis 0 0 0 0 39 0 4 0 12,3 17,8 Kėdainiai 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 Kelmė 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 Kretinga 0 0 0 0 2,12 0 0 0 0 0 Lazdijai 0 0 0 0 0 0 1,67 6,13 3,89 0 Marijampolė 0 0 0 0 0 0,57 0 0 0 0 Mažeikiai 0 0 0 0 0 8,3 0 0 0 0 Molėtai 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7,14 Panevežys 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,43 Prienai 0 0 0 0 0 2,08 0 0 0 0 Raseiniai 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 Rokiškis 0 0 0 0 0 0 0 0 16,5 10,9 Šakiai 0 0 0 0 0 0 80 0 55,5 37,5 Šiauliai 0 0 0 0 0 0,85 0,31 0 0 0 Šilalė 0 0 0 0 0 0,42 0 0 0 0 Šilutė 0 0 0 0 0 0,22 0,45 0 0 0
Dažniausiai PTB specifiniai antikūnai buvo nustayti Alytaus, Joniškio, Lazdijų, Šakių apskrityse surinktuose galvijų kraujo serumo mėginiuose (2 lentelė). PTB atžvilgiu teigiamų galvijų 2009 metais buvo nustatyta 9,09 ± 0,01 proc. (95%PI 11,14-7,04) nuo visų tirtų mėginių Alytaus apskrityje. Rečiausiai paratuberkuliozės atžvilgiu teigiamų galvijų buvo nustayta nustatyta Šilalės apskrityje. Molėtų ir Panevėžio apskrityse nuo 2006 iki 2014 metų nebuvo registruoja serologiškai
2 Lentelėje neįtraukti apskričių teigiami atvejai tirti dėl ligos įtarimo (2007 metais Alytaus apskrities – 14 mėginių,
2009 metais Utenos apskrities – 1 mėginys, 2012 metais Lazdijų apskrities – 2 mėginiai ir 2013 metais – 1 mėginys, 2014 metais Šakių apskrities 2 mėginiai, 2015 metais Šakių apskrities – 1 mėginys, Molėtų apskrities – 2 mėginiai, Jovavos apskrities – 1 mėginys).
27
teigiamų galvijų, tačiau vertinat paskutinius metus šiose apskrityse nustatyta teigiamų mėginių. 7,14 proc. ir 0,43 proc. (p<0,05)
2012 metų Kretingos, Marijampolės, Mažeikių, Prienų ir Šilalės apskrityse nebuvo nustatyta specifinių antikūnų prieš PTB. Pagal 2 – ąją lentelę matome, kad 2006 – 2015 metų laikotarpiu didžiausias PTB atžvilgiu serologiškai teigiamų galvijų procentas buvo užregistruotas Šakių apskrityje, kur skirtingais metais 37-80 proc. tirtų mėginių turėjo PTB specifinius antikūnus (p<0,05).
6 pav. PTB teigiamų galvijų kraujo serumo mėginių tyrimų rezultatų pasiskirstymas pagal lytį 2006-2015 metai3
Analizuojant galvijų teigiamus mėginius matome, kad daugiausiai serologiškai teigiamai reagavusių galvijų yra patelės. Vertinant paskutinius 4 metus matyti, kad patelių teigiamų mėginių procentas nuo visų teigiamų mėginių buvo didžiausias 2012 metais, 2013 metais ir 2014 metais. 2015 metais visi teigiami mėginiai buvo patelių.
Vertinant teigiamai reagavusių patinų mėginius, daugiausiai jų nustatyta 2012 metais (p<0,05).
Nuo 2011 metų teigiamų serologiškai atvejų daugėjo iki 2013 metų. 2014 metais bendras teigiamų mėginių skaičius sumažėjo 13,7 ± 0,1 proc., tačiau 2015 metais bendras PTB nustatymas padidėjo 3,84 ± 0,01 proc. lyginant su 2014 metais.
3 Paveikslėlyne neįtraukti 2014 metais gauti 32 teigiami mėginiai, dėl nenurodytos lyties.
2 17 2 2 12 20 56 48 52 0 1 0 0 0 4 2 2 0 0 10 20 30 40 50 60 70 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 T eigi am as m ėgin ių sk aičiu s Patinai Patelės
28
Tyrimais nustatyta, kad nuo 2006 metų iki 2015 metų bendras patelių teigiamų mėginių skaičius sudarė 95,9 ± 0,01 proc. (95%PI 93,41-98,59), o patinų bendras skaičius – 4,09 ± 0,01 proc. (95%PI 1,41-6,59) (p<0,05).
7 pav. Teigiamų galvijų kraujo serumo mėginių tyrimų rezultatų pasiskirstymas pagal amžiaus grupes 2006-2015 metai4
Teigiami galvijų kraujo serumo mėginiai dažniausiai buvo nustatomi amžiaus grupei nuo 2,1 metų iki 6 metų. 2007 metais šios grupės mėginiai sudarė 86,36 ± 0,01 proc. (95%PI 71,5-100), 2011 metais – 60 ± 0,01 proc. (95%PI 38,53-81,47), 2012 metais – 53,33 ± 0,01 proc. (95%PI 35,71-70,29), 2013 metais – 58,97 ± 0,01 proc. (95%PI 43,56-74,44), 2014 metais – 82 ± 0,01 proc. (95%PI 71,35-92,65), 2015 metais – 75 ± 0,01 proc. (95%PI 63,23-86,77). (p>0,05)
Amžiaus grupei nuo 6,1 metų iki 10 metų tik nuo 2012 metų buvo nustatomi teigiami mėginiai PTB atžvilgiu.
4 Paveikslėlyne neįtraukti 2013 metais gauti 19 teigiami mėginių ir 2014 metais gautų 32 teigiamų mėginių, dėl
nenurodytos amžiaus grupės.
4 4 2 3 2 8 8 6 4 7 19 2 12 16 23 41 39 4 3 5 6 3 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 G alvi jų sk aičiu s virš 10 metų
nuo 6,1 iki 10 metų nuo 2,1 metų iki 6 metų nuo 7 mėnesių iki 2 metų iki 6 mėnesių
29
8 pav. Teigiamų galvijų kraujo serumo mėginių tyrimų rezultatų pasiskirstymas pagal mėginių grupes 2006-2015 metais
Dažniausiai paratuberkuliozės tyrimams buvo pristatomi einamieji mėginiai (8 pav.), tačiau 2007 metais stebėsenos mėginiai sudarė didesnę dalį – 77,27 ± 0,01 proc. (95%PI 71,98-82,02) (p<0,05).
9 pav. Teigiamų galvijų kraujo serumo mėginių tyrimų rezultatų pasiskirstymas pagal tyrimo paskirtį 2006-2015 metais
Analizuojant PTB teigiamus mėginius pagal tyrimo paskirtį, buvo nustatyta, kad nuo 2011 metų kontrolinių mėginių skaičius didėjo iki 2014 metų.
2 5 0 1 2 20 30 58 82 52 0 17 0 1 0 0 2 0 0 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 T eigiam ų m ėgin ių sk aič iu s EinamiejiStebėsena 2 2 14 8 3 14 1 2 1 2 4 4 5 20 57 80 45 4 1 2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 T eigi am ų m ėgin ių sk aičiu s Eksportas Įtariant ligą Kontroliniai Pakartotiniai
30
2007, 2012 ir 2013 metais buvo pristatyti galvijų mėginiai, kuriems buvo įtarta paratuberkuliozė, o vėliau nustaytas ir pats PTB sukėlėjas. Eksporto grupės teigiamų mėginių daugiausiai nustatyta 2014 metais. Tačiau nuo 2012 metų eksporto mėginiuose teigiamų atvejų skaičius mažėjo.
10 pav. Teigiamų laukinių atrajotojų kraujo serumo mėginių tyrimų rezultatų pasiskirstymas pagal gyvūno rūšį 2012 metais
Laukinių atrajotojų serologiniai tyrimų rezultatai parodė, kad PTB atžvilgiu teigiamų buvo nustatyta tiek muflonų, tiek elnių populiacijose tik 2012 metais. Pastebėtina tai, kad 76 proc. (95%PI 55,7-96,3) 2012 metais laukinių gyvūnų mėginių, teigiamai reagavusių PTB ligos atžvilgiu, buvo muflonų ir 24 proc. (95%PI 3,7-44,3) – elnių.
Iš tirtų kitų laukinių atrajotojų kraujo serumo mėginių nuo 2006 metų iki 2015 metų danieliams, stumbrams, alpakoms ir antilopėms nebuvo nustatytas nė vienas teigiamas kraujo serumo mėginys. Visi teigiami muflonų mėginiai buvo iš Joniškio apskrities, o elnių teigiami mėginiai nustatyti Mažeikių apskrityje.
Muflonas 13 Elnias 4
31
11 pav. Teigiamų laukinių atrajotojų kraujo serumo mėginių tyrimų rezultatų pasiskirstymas pagal gyvūno rūšį ir amžių 2012 metais
Didesnę dalį teigiamų mėginių pavyko nustatyti vyresnių nei 2,1 metų amžiau grupėje. Muflonų vyresnių kaip 2,1 metų teigiamų mėginių skaičius sudarė 92,3 ± 0,1 proc. (95%PI 77,25-100) (p<0,05), o elnių – 75 ± 0,1 proc. (95%PI 32,57-77,25-100).
1 1 12 3 0 2 4 6 8 10 12 14 Muflonas Elnias T eigi am ų m ėgin ių sk aičiu s iki 2 metų nuo 2,1 metų
32
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Tirtuoju dešimties metų laikotarpiu, vien tik tarp galvijų, PTB sukėlėjo paplitimas Lietuvoje buvo nuo 0,21 proc. iki 6,59 proc. Keletą metų serologiškai teigiamų galvijų kiekis svyravo tarp 1-4 proc. Šie rezultatai panašūs į 2009 metais atlikto tyrimo Airijoje (66) rezultatus, kurie parodė, jog bendras PTB paplitimas šalyje tarp tirtų galvijų yra 2,86 proc. Pakistano galvijų populiacijoje 2011 metais seroteigiamų galvijų aptikta 6,67 proc (67). Gauti rezultatai labai panašūs ir į Meksikoje 2010-2012 metais atlikto PTB paplitimo tyrimo rezultatus (68), kurių metu buvo nustatyta, jog PTB paplitimas šalyje yra 5 proc. tarp galvijų ir 48 proc. tarp galvijų bandų. 2007 metais buvo surinkti ir ištirti 334 galvijų kraujo serumo mėginiai, iš jų 6,59 proc. buvo teigiami PTB. Panašus rezultatas gautas ir Tanzanijoje: ištyrus 207 galvijų kraujo serumo mėginius, 5,26 proc. buvo teigiami PTB (69). 3,125 proc. PTB paplitimas nustatytas Indijoje, Panjabo regione, ištyrus 736 galvijų kraujo serumo mėginius (70).
2012 metais analizuojant muflonų kraujo serumo mėginius (n=88), 12,5 proc. buvo aptikti antikūnai prieš MAP. 2009 metais paskelbtoje publikacijoje (71) apie atliktą tyrimą Ispanijoje, iš 101 tirto muflono tik 1,0 proc. buvo seroteigiamas MAP. 2008-2012 metais atlikto tyrimo metu (69) Pietų Prancūzijoje buvo nustatyta, jog elnių užsikrėtimas MAP yra 0,9 proc., kas yra gana artima mūsų gautų tyrimų rezultatams. 2013-2014 metais Kinijoje atliktas PTB paplitimo tarp dėmėtųjų elnių (n=247) tyrimas parodė, jog Jilino provincijoje ligos paplitmas yra 17,64 proc. (73). 2011-2012 mūsų tyrime buvo nustatyti tik 4 teigiami atvejai iš tirtų 359 mėginių, kas sudarė 1,1 proc. Lyginant su minėtu Kinijoje atliktu tyrimu, Lietuvoje PTB elnių populiacijoje nėra taip smarkiai paplitusi. Ištyrus 519 stirnų Pirėnų pusiasalyje, buvo nustatyta, jog DL paplitimas yra 9,2 proc (74). Mūsų tyrimas 2012-2013 metais ištyrus panašų skaičių elnių (n=558), atskleidė, jog PTB paplitimas siekia vos 0,72 proc. Lyginant mūsų tyrime nagrinėtus seroteigiamus laukinius gyvūnus ir galvijus, matoma, jog seroteigiamų galvijų yra žymiai daugiau. Tad galima daryti prielaidą, kad laukinių gyvūnų tarpe PTB sukėlėjas paplitęs rečiau nei kitose šalyse.
Vertinant ligos pasireiškimo kitimą 2008-2014 metų laikotarpyje, pastebėjome, jog atsirado tolygus ligos didėjimas. Galima daryti prielaidą, jog tokie rezultatai rodo, kad buvo atliekama netinkama arba neveiksminga ligos prevencija. Lyginant su užsienio šalimis, kuriose plėtojama intensyvi galvijininkystė, ligos pasireiškimas nuo 2011 iki 2013 metų didėjo Kanadoje (75) bei nuo 2008 iki 2011 metų didėjo Danijoje. Tačiau Danijoje nuo 2011 iki 2015 metų pastebimas PTB paplitimo mažėjimas (76).
Pasaulyje PTB egzistuoja visur, kur išplėtota galvijininkystė. Endemiškai liga išplitusi Europoje, Šiaurės Amerikoje. Šiose žemynuose yra 50 proc. užsikrėtusių bandų (32) Kanadoje 32 proc. pieninių galvijų bandose bent jau 2 karvės yra seroteigiamos PTB (34). JAV mėsinių galvijų
