Riassunto
Uno dei parametri ambientali che hanno maggiormente condizionato l’evoluzione degli organismi viventi è la luce; infatti, grazie alla capacità di convertire l’energia luminosa in energia chimica, alcuni essere viventi possono sintetizzare molecole organiche ex novo.
Tra gli eventi biologici indotti e/o regolati dalla luce, di particolare interesse sono quelli basati sull’abilità di alcuni microorganismi di utilizzare lo stimolo luminoso non come sorgente di energia, bensì come fonte di informazione sull’ambiente circostante.
Il nostro studio si è focalizzato su Blepharisma japonicum, un ciliato eterotrico che normalmente vive sul fondo di acque dolci stagnanti, dove ci sia assenza di luce. L’obbiettivo della tesi è quello di caratterizzare e purificare la cromoproteina fotorecettrice responsabile della risposta fotomotoria, una risposta fotofobica di step-up che induce il microorganismo ad accumularsi in aree buie; il cromoforo (blefarismina) della cromoproteina appartiene ad una nuova classe di fotorecettori sensoriali analoghi dell’ipericina.
Se irraggiata sia in vivo che in vitro per lunghi periodi di tempo, la blefarismina (di colore rosso, con picco di assorbimento a 580 nm) va incontro ad una fotoossidazione convertendosi in ossiblefarismina (di colore blu, con picco di assorbimento a 590 nm); la fotoconversione del cromoforo, quando ottenuta in vivo, non ne inficia la capacità di provocare la risposta fotofobica nel ciliato.
Il lavoro di tesi si è basato sull’utilizzo di cellule blu di B. japonicum, in quanto dopo la fotoconversione il cromoforo è più saldamente legato alla proteina e non si distacca dall’apoproteina neanche a seguito di passaggio in colonna cromatografica. Questo permette di avere una resa di cromoproteina maggiore a seguito dei passaggi di purificazione.
La fase iniziale della tesi ha previsto l’affinamento delle tecniche di estrazione della proteina fotorecettrice facendo uso di diversi tipi di
detergenti e metodiche di lisi cellulare (quali sonicazione, congelamento). In un secondo tempo, si è cercato di purificare la cromoproteina mediante l’utilizzo di colonne cromatografiche. A questo scopo si è fatto uso di cromatografia su idrossiapatite e su sephadex.
Mediante tecniche elettroforetiche è stato possibile verificare il grado di purificazione raggiunto nell’isolare la proteina; tramite elettroforesi si è cercato inoltre di saggiare alcune caratteristiche biochimiche della cromoproteina in esame.
Infine, i campioni ottenuti sono stati sottoposti ad analisi spettrofotometrica per studiarne le proprietà di assorbimento e di fluorescenza.
