1.5 Il gene Leafy Cotyledon1-like (L1L)
1.5.1 La famiglia genica Leafy Cotyledon
Lo sviluppo del seme nelle piante dicotiledoni può essere diviso in tre fasi principali: i) la morfogenesi, che va dalla fecondazione al termine della fase di crescita per divisione cellulare; ii) la fase di maturazione, in cui vengono sintetizzati i prodotti di riserva, quali amido, lipidi e proteine; iii) l’embriogenesi tardiva, che è caratterizzata dall’essiccamento del seme, l’inibizione della germinazione prematura e la dormienza.
Nella fase morfogenetica i geni LEC sono richiesti per il mantenimento dell’identità cellulare del sospensore e dell’identità dei cotiledoni. I mutanti lec, presentano un sospensore in grado di andare in contro ad una serie di divisioni cellulari, originando un’anomala struttura a più strati cellulari invece della classica fila a sei-otto cellule normalmente presente in Arabidopsis; questa proliferazione cellulare dà origine ad embrioni secondari (Lotan et al., 1998). Inoltre questi genotipi mutanti possono presentare sulla superficie adassiale delle foglie embrionali, tricomi che, in Arabidopsis, sono caratteristici delle foglie adulte e mostrare un’anatomia dei cotiledoni fenotipicamente intermedia tra una foglia embrionale e una foglia adulta. Tutto ciò dimostra che i geni LEC sono richiesti per la specificazione dell’identità cotiledonare e, in assenza della loro attività, i cotiledoni sono specificati in maniera incompleta e tendono ad essere simili agli organi fogliari. Ciò fa supporre che, durante le fasi di morfogenesi embrionale, le proteine LEAFY COTYLEDON svolgano più ruoli specifici (Harada, 1999; 2001). Altri studi hanno evidenziato che
l’RNA del gene LEC1 è accumulato molto precocemente, nei primi stadi embrionali, durante lo sviluppo del seme a livello dell’embrione, del sospensore e dell’endosperma, ma non in organi vegetativi (Lotan et al., 1998). Il fenotipo delle piante transgeniche che sovraesprimono il gene LEC1 è caratterizzato da una limitata vigoria che si manifesta sia nella parte epigea, sia in quella ipogea. Inoltre, le foglie non si espandono, sono prive di tricomi e non hanno un normale complemento in apparati stomatici (Lotan et al., 1998). E’ sorprendente come l’espressione ectopica di LEC1 sia sufficiente ad indurre la formazione di embrioni somatici sulla superficie ad assiale delle foglie (Lotan et al., 1998). Quest’ultimo fenotipo è ottenuto con frequenze superiori in seguito alla sovraespressione del gene LEC2 (Stone et al.,
2001). E’ necessario precisare che in questo caso, oltre alla differenziazione di veri
embrioni somatici, si osservano anche strutture di natura organogenetica e masse indifferenziate di callo. Queste osservazioni suggeriscono che quando nelle cellule somatiche si riattiva l’espressione di geni che codificano per proteine di tipo LEAFY COTYLEDON è possibile ottenere una profonda riprogrammazione del destino cellulare che può concludersi con la differenziazione di embrioni somatici (Koltunow
e Grossniklaus, 2003). Quindi, la capacità di LEC1 di indurre sia la fase
morfogenetica sia la fase di maturazione e di sopprimere lo sviluppo vegetativo fa supporre che esso stabilisca un ambiente cellulare idoneo allo sviluppo dell’embrione. Di conseguenza, un ambiente che promuove la competenza embriogenetica potrebbe anche coordinare le due fasi, morfogenetica e di maturazione, dello sviluppo embrionale (Harada, 2001).
Altre caratteristiche dei mutanti lec indicano che questi geni hanno un ruolo critico anche nella fase di maturazione. In Arabidopsis thaliana, questo processo è controllato da una rete di fattori di trascrizione che comprendono LEAFY COTYLEDON1 (LEC1), LEC1-LIKE (L1L), LEAFY COTYLEDON2 (LEC2), FUSCA3 (FUS3), e ABSCICSIC ACID INSENSITIVE3 (ABI3) (To et al., 2006; Suzuki et al.,
2007). Mutazioni di questi geni producono diversi difetti nella maturazione dei semi,
come problemi nell’identità dei cotiledoni (lec1, lec2, and fus3), anomala degradazione della clorofilla (abi3), accumulazione anomala di antocianina (lec1, fus3, e lec2), intolleranza al diseccamento (lec1, fus3, e abi3), e difetti nello stoccaggio di oli e proteine (lec1, lec2, fus3, e abi3) (Yazawa e Kamada, 2007; Lotan et al., 1998;
Kwong et al., 2003). LEC2, FUS3, e ABI3 codificano fattori di trascrizione che legano
il motivo B3 DNA (Yazawa e Kamada, 2007; Stone et al., 2001). Questi fattori sono coinvolti nell’accumulazione di sostanze di riserva e lipidi, nella morfogenesi dell’embrione, fino alla maturazione e alla acquisizione della tolleranza al diseccamento (Yazawa e Kamada, 2007). LEC1 e L1L codificano proteine omologhe alle subunità NF-YB (o HAP3) del CCAAT-box-binding factor (CBF). LEC1 si pensa sia il regolatore chiave dello sviluppo embrionale (Lotan et al., 1998). Sebbene entrambi i geni LEC1 e L1L siano essenziali per lo sviluppo embrionale, essi hanno distinte funzioni endogene (Kwong et al., 2003). Recentemente, è stato riportato che LEC1 regola l’espressione di ABI3 e FUS3 (Yazawa e Kamada, 2007).
Lo sviluppo embrionale è controllato da strette e complesse interazioni tra i geni della classe LEC (LEC1, LEC2 e FUS3) e gli ormoni. Durante lo sviluppo embriogenico l’incremento di livello di acido abscissico (ABA) è importante per stabilire molte funzioni post-embrionali, mentre la concentrazione delle gibberelline (GA), relativamente bassa fino all’imbibizione del seme, incrementa rapidamente in questa fase interrompendo la dormienza indotta dall’ABA (Ogawa et al., 2003). A livello molecolare le GA e l’ABA influenzano l’espressione di molti geni coinvolti nello sviluppo del seme e nella germinazione (Ogawa et al., 2003). Per esempio i fattori di trascrizione LEC interagiscono direttamente con geni coinvolti nella risposta all’ABA. In particolare, FUS3 può coordinare l’azione ABA/GA nell’embriogenesi, mentre con un meccanismo a feedback questi ormoni regolano la stabilità della proteina FUS3 (Gazzarrini et al., 2004, Kagaya et al., 2005). Negli
embrioni zigotici la formazione di un gradiente di auxine gioca un ruolo cruciale nello stabilire la polarità dell’asse embrionale: come è stato dimostrato dall’analisi di mutanti quali monopteros e bodenlos, difettivi in geni coinvolti nella risposta alle auxine (Hamann et al., 2002). Durante la transizione da stadio globulare a stadio triangolare, le auxine si muovono attraverso il tessuto epidermico e vengono accumulate nei cotiledoni, successivamente l’auxina è mobilizzata verso la regione basale che formerà la futura radice embrionale (Benkova et al., 2003). La trascrizione di FUS3 è auxina-inducibile, perciò questi ormoni possono determinarne i siti di espressione. La formazione del gradiente dinamico di auxine può successivamente modulare i livelli di altri due ormoni GA e ABA nelle regioni da cui si origineranno i diversi organi nello sviluppo post-embrionale (Gazzarrini et al., 2004).
Il gene LEC2 interagisce direttamente con geni coinvolti nella risposta alle auxine (Braybook et al., 2006) mentre la penetranza del fenotipo del mutante turnip (tnp) di Arabidopsis, una mutante con acquisizione di funzione di LEC1, è fortemente aumentato dalla presenza di auxina esogena e zuccheri, e ridotto da trattamenti esogeni con citochinine (Casson e Lindsey, 2006). In particolare è stato proposto che il ruolo di LEC1 nel controllo del destino cellulare richieda auxine e saccarosio per promuovere la divisione cellulare e la differenziazione embrionale e che l’azione delle auxine e citochinine potrebbe concorrere nell’espressione di LEC2 e FUS3. Il trattamento con citochinine reprime questi due geni mentre auxine sintetiche inibiscono l’espressione di LEC2 ed incrementano la trascrizione di FUS3 (Casson e
Lindsey 2006). L’abilità delle citochinine a reprimere la penetranza di tnp può essere
in parte collegata al suo effetto su questi e altri regolatori dell’embriogenesi. Nel caso dell’auxina, l’incremento dei livelli di FUS3 potrebbe, tramite fattori sconosciuti, portare alla riduzione dei livelli di LEC2, questi dati supportano fortemente il ruolo dell’auxina come importante regolatore dell’identità attraverso effetti sui geni LEC e FUS (Casson e Lindsey 2006).
1.5.2 Il gene Leafy Cotyledon1-Like
In Arabidopsis il peptide codificato dal gene LEAFY COTYLEDON1-LIKE (L1L), risulta necessario per il normale sviluppo embrionale e presenta l’83% d’identità di sequenza con la proteina LEC1 (Kwong et al., 2003; Lotan et al.,1998). L’accumulo dell’mRNA del gene L1L è paragonabile a quello di LEC1, ma presenta alcune differenze peculiari. L’espressione del gene LEC1 si evidenzia soprattutto in stadi precoci dell’embriogenesi vegetale mentre elevati livelli di mRNA di L1L si riscontrano in stadi più avanzati. Prima dello stadio a torpedine, L1L si esprime a bassi livelli, nell’embrione, nel sospensore e nell’endosperma; la sua espressione, nell’embrione e nei tessuti cellulari più esterni, diviene simile alla distribuzione dei trascritti di LEC1 solo allo stadio cotiledonare (Lotan et al., 1998; Kwong et al., 2003). Contrariamente a LEC1, il gene L1L, anche se a livelli bassi, si esprime anche in tessuti di organi vegetativi. Dall’analisi fenotipica dei mutanti l1l, è emerso come questo gene sia essenziale per lo sviluppo embrionale. Il suo silenziamento, mediante le tecniche dell’interferenza ad RNA, causa l’arresto dello sviluppo dell’embrione zigotico già allo stadio globulare (Kwong et al., 2003). Inoltre, studi funzionali hanno evidenziato che sebbene i livelli endogeni di mRNA di L1L non possano sostituire completamente la funzione del gene LEC1, la sua espressione ectopica è sufficiente a complementare la mutazione lec1, inducendo la formazione di embrioni tolleranti alla disidratazione ed in grado di germinare. Il fenotipo delle piante che sovraesprimono L1L, sebbene sia paragonabile a quello descritto nelle piante transgeniche per il gene LEC1, non è caratterizzato da fenomeni di epifillia (Kwong
et al., 2003). Complessivamente, i dati raccolti in A. thaliana dimostrano che le singole
ridondante ed è quindi probabile che ciascuna proteina, pur essendo implicata in modo diretto nella embriogenesi zigotica, presenti anche altri ruoli peculiari. Ciò trova conferma nella presenza, per niente sporadica, di trascritti al di fuori dell’embrione. Sono proprio i ruoli non direttamente riconducibili all’embriogenesi quelli meno conosciuti al momento (Kwong et al., 2003). Alla loro comprensione potrebbe contribuire in modo decisivo l’identificazione delle sequenze bersaglio visto che, complessivamente, i geni citati codificano per fattori di trascrizione sebbene di diversa natura molecolare (Lotan et al., 1998; Stone et al., 2001; Kwong et al., 2003).
1.5.3 Le proteine Leafy Cotyledon1 e Leafy
Cotyledon1-Like: subunità altamente specializzate del fattore NF-Y
Rispetto a lieviti e vertebrati, nelle piante il meccanismo funzionale del complesso NF-Y è poco conosciuto, ed è inoltre complicato dal fatto che vi sono numerosi geni multipli codificanti ognuna delle proteine (Gusmaroli et al., 2001, 2002). In Arabidopsis le famiglie geniche di NF-Y (dette AtNF-YA1-10, NF-YB1-10, e NF-YC1-9) sono formate da diversi membri genici, alcuni ubiquitari ed altri espressi in tessuti specifici come fiori o silique (Gusmaroli et al., 2001, 2002). In riso (Oryza sativa, Os), sono stati identificati attraverso clonaggi di cDNA e ricerche in database 11 geni NF-YB, di questi, quattro sono stati caratterizzati: OsHAP3A–C e OsNF-YB1, ed è emerso che l’ultimo di questi è coinvolto nella regolazione dello sviluppo dei cloroplasti (Miyoshi et al., 2003). In grano (Triticum aestivum) sono stati individuati tramite screening in database dieci NFYA, 11 NF-YB, 14 NF-YC, identificati come: TaNFYA1- 10, TaNF-YB1-11, TaNF-YC1-14 e TaDr1A-B (Stephenson et al., 2007).
Il confronto delle sequenze NF-YB in grano ha permesso di identificare tre motivi condivisi, al di fuori del dominio conservato:
1. Un residuo di sei amminoacidi (REQDRF) adiacente al lato N-terminale del core è interamenente conservato nei quattro resuidi centrali.
2. Un motivo di 10 residui ritrovato in otto subunità proteiche NF-YB localizzato circa a 10 amminoacidi dal residui C-terminale della regione core. 3. Un motivo polare e idrofobico, composto da 5 amminoacidi, localizzato
Sulla base della conservazione e sull’identità di sequenza del domino centrale B, in Arabidopsis thaliana, la famiglia genica che codifica per le subunità HAP3 è suddivisa in due distinte classi: una di “tipo non-LEC1” (NB) e l’altra di “tipo-LEC1” (LB). Il dominio LB è stato trovato in Phaseolus coccineus, Daucus carota, Triticum aestivum e Oryza sativa. In A. thaliana, esso è presente nelle proteine codificate dai geni LEC1 e L1L, e differisce dal dominio B di tipo “non-LEC1” per 16 residui amminoacidici conservati. Il dominio di “tipo-LEC1” è richiesto per il corretto funzionamento del fattore NF-Y, è sufficiente ad indurre lo sviluppo embrionale da cellule vegetali già differenziate ed è in grado di regolare l’embriogenesi (Harada 2001; Lotan et al.,
1998). Infatti ad esempio, il mutante lec1-1, che non è in grado di germinare poiché
intollerante alla disidratazione, è revertito al fenotipo normale dalle HAP3 di “tipo-LEC1”. Inoltre, con l’utilizzo di proteine chimeriche in mutanti omozigotici lec1-1, è stato confermato il ruolo nell’embriogenesi del dominio LB e sono stati identificati aminoacidi specifici, critici per la sua attività. La soppressione della mutazione lec1, in piante transgeniche di A. thaliana, si ha solo con l’espressione di costrutti che codificano proteine contenenti il dominio LB, mentre le piante con proteine chimeriche con i domini A e/o C sempre di “tipo-LEC1” non sono in grado di germinare, esplicitando quindi, che il recupero del fenotipo selvatico nei mutanti avviene solo e soltanto grazie al dominio LB. In particolare, mediante la sostituzione di specifici aminoacidi del gene LEC1 con quelli conservati nelle medesime posizioni delle HAP3 di “tipo non-LEC1”, è emerso che l’aspartato in posizione 55 (D55) (figura 1) è essenziale per l’attività embriogenetica dei geni LEC ed inoltre è sufficiente a conferire una parziale attività di tipo LEC ai domini B di “tipo non-LEC1” (Lee et al., 2003).
Fig. 1.5.1. Allineamento delle sequenze aminioacidiche del dominio B delle subunità HAP3 di Arabidopsis, lievito, ratto. In giallo sono mostrati i residui identici. In rosso sono evidenziati i residui aminoacidi specifici di LEC1 e L1L. Le linee continue e tratteggiate in azzurro indicano rispettivamente le posizioni delle a−eliche e le anse nel motivo di ripiegamento istonico. I numeri indicano le posizioni degli aminoacidi all’interno di LEC1. (Lee et al., 2003).
Fig. 1.5.2. Consenso delle sequenze del core delle subunità NF-YB di Arabidopsis, riso, e grano ottenuto con il programma “logos”. Il consenso “logos” è stato creato dal confronto di 13 sequenze di riso, 10 di Arabidopsis e 11 di grano. Le sequenze di riso e Arabidopsis sono membri non-ridondanti di RisoTFDB e ArabTFDB. L’altezza delle lettere indica la frequenza relativa del corrispondente residuo. Sotto il “logos” c’è una rappresentazione testuale dei maggiore consenso tra le tre specie. Gli amminoacidi sono colorati in accordo con le proprietà chimiche: verdi per for polar (G,S,T,Y,C,Q,N), blu per i basici (K,R,H), rossi per gli acidi (D,E) e nero per idrofobici (A,V,L,I,P,W,F,M).
