2 - MATERIALI E METODI 2.1 - Materiali

2 - MATERIALI E METODI

2.1 - Materiali

In questa tesi è stata studiata l’attività sui sottotipi recettoriali dopaminergici D2-like di un nuovo potenziale agente antipsicotico, il composto S33138 (Fig.12) sintetizzato e gentilmente fornitoci dall’Istituto di ricerca Servier (Parigi, Francia).

Fig.12 - Struttura dell’S33138

Tutti i composti messi a confronto con S33138 sono stati sintetizzati e gentilmente forniti dall’Istituto di ricerca Servier (Parigi, Francia).

Aloperidolo, clorpromazina, clozapina, dopamina, il materiale utilizzato per il terreno di coltura cellulare (DMEM, L-glutammina, aminoacidi non essenziali, penicillina e streptomicina, glucosio, timidine e ipoxantina, metotrexato, geneticina), il forskolin e il quinpirolo sono stati acquistati dalla Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA). Il siero fetale bovino è stato comprato da Celbio (Milano, Italia). La [2,8-3H]Adenina, utilizzata per lo svolgimento delle prove funzionali, e il [35S]GTPγS sono stati acquistati presso la PerkinElmer Life Sciences (Roma, Italia). La linea cellulare CHO DHFR(-) è stata gentilmente donata dall’Istituto Servier di Parigi.

2.2 - Costrutti plasmidici

I recettori D2h, D4h transfettati in cellule CHO DHFR(-) sono stati clonati in pcDNA3.1(+) (Invitrogen) e l’inserzione è stata effettuata tra i siti di restrizione EcoR (5') e Xho (3'). Il vettore contiene il gene per la resistenza alla Neomicina, per la selezione di linee cellulari che stabilmente esprimono il plasmide. La selezione è fatta con G418, che è un antibiotico aminoglucosidico analogo della Neomicina, che blocca la sintesi proteica nelle cellule di mammifero interferendo con la funzione ribosomale.

Il plasmide presenta un sito di riconoscimento per la replicazione batterica (pUCori), il promotore, il sito di origine e quello di poliadenilazione del virus SV40. Il promotore che permette l’espressione della proteina ricombinante inserita nel sito policlonale è quello del Citomegalovirus (Pcmv), mentre il sito di poliadenilazione per il distacco dell’enzima RNA polimerasi dal DNA è quello dell’ormone bovino della crescita (BGH pA).

Le cellule CHO DHFR(-) sono state ottenute da Servier in seguito a mutagenesi con Etil Metasulfonato e con raggi e sono state coltivate con mezzo di coltura arricchito di Ipoxantina-timidina 50x.

Il recettore D3h transfettato in cellule CHO è stato clonato nel vettore eucariotico derivato dal plasmide pSV contenente la sequenza per la Diidrofolatoreduttasi (Sokoloff et al., 1990), usando gli enzimi di restrizione Kpn e Bgl .

2.3 - Colture cellulari

Per studiare il comportamento dell’S33138 sui recettori dopaminergici D2-like sono state impiegate principalmente due linee cellulari: fibroblasti di rene di Scimmia (COS-7) e cellule di ovario di Criceto Cinese (CHO).

Le cellule COS-7 sono state transfettate transientemente con eterodimeri D3/D2Lh, con il recettore chimerico D3i3(D2), con i recettori D2Lh, D3h; inoltre, tutti gli altri recettori studiati sono stati transfettati stabilmente in cellule CHO. Tutte queste cellule sono state fatte crescere in un incubatore alla temperatura di 37°C in atmosfera di C O2 al 5%, utlizzando specifici mezzi di coltura.

Per le cellule COS-7 è stato utilizzato il terreno di coltura DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s Medium) supplementato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 2% di glutammina 200nM, 1% di aminoacidi non

essenziali (alanina, asparagina, acido aspartico, acido L-glutammico, glicina, L-prolina, L-serina) e l’1% di una soluzione di penicillina (100 unità/ml) e streptomicina (10mg/ml), utile per la prevenzione di contaminazioni batteriche.

Le linee cellulari CHO utilizzate differiscono per la presenza o meno del gene che codifica per l’enzima diidrofolato reduttasi (DHFR) responsabile della formazione di acido tetraidrofolico, cofattore richiesto per il trasferimento di singoli atomi di carbonio in varie reazioni biosintetiche (Urlaub G. et al., 1980).

Le cellule CHO-DHFR(-) sono state fatte crescere nel mezzo di coltura DMEM supplementato con 0,35% di glucosio, il 10% di FBS, l’1% di soluzione di penicillina (100 unità/ml) e streptomicina (10 mg/ml), il 2% di glutammina 200nM, l’1% di aminoacidi non essenziali e ipoxantina-timidina 50x. La selezione delle cellule CHO-DHFR(-) transfettate stabilmente con i recettori D2h (D2S e D2L) e D4h è stata ottenuta aggiungendo al mezzo di coltura l’antibiotico amino-glucosidico geneticina (G418) 0,9 mM.

Le cellule CHO-DHFR(+) sono state fatte crescere nel mezzo di coltura DMEM supplementato con 0,35% di glucosio, il 10% di FBS, l’1% di soluzione di penicillina (100 unità/ml) e streptomicina (10 mg/ml), l’1% di glutammina 200nM, l’1% di aminoacidi non essenziali. La selezione delle cellule CHO-DHFR(+) stabilmente transfettate con il recettore D3h è stata ottenuta aggiungendo al mezzo di coltura il metotrexato 150nM, mentre la selezione delle cellule CHO-DHFR(+) esprimenti l’eterodimero D3/D2Lh è stata ottenuta mediante l’utilizzo sia di G418 0,9 mM che metotrexato 150 nM.

2.4 - Transfezione

La transfezione cellulare è una metodica che consente l’introduzione di molecole di DNA esogeno in cellule riceventi in coltura; questo consente di studiare la funzione e i meccanismi di controllo delle molecole introdotte.

Il DNA, una volta transfettato, verrà mantenuto nel citoplasma da molte cellule per un determinato periodo di tempo, in genere 2-3 giorni (transfezione transiente), mentre solo in pochi casi verrà integrato nel genoma cellulare (transfezione stabile). L’isolamento di questi ultimi tipi cellulari e della loro progenie richiede la selezione di un gene marcatore presente nel DNA esogeno, che consente alle cellule transfettate di crescere in un terreno selettivo.

2.4.1 - Transfezione transiente delle cellule COS-7

Le cellule COS-7 sono inizialmente fatte crescere in fiasche da 150 cm2 e staccate dal substrato cui sono adese con tripsina 0,2% al raggiungimento dell’80% di confluenza. Successivamente le cellule sono seminate in piastre Petri da 100 mm ad una densità di circa 7,5x105 cellule per piastra in un volume minimo di 10 ml di mezzo di coltura. Ventiquattro ore dopo la semina nelle piastre Petri, le cellule COS-7 sono pronte per la trasfezione attraverso il metodo del DEAE-destrano/clorochina (Cullen, 1997; Luthman e Magnusson, 1983). Il DEAE-destrano è un carboidrato polimerico al quale è legato il di-etil-amino-etile (DEAE), un gruppo chimico carico positivamente che è in grado di interagire elettrostaticamente con i gruppi fosfato negativi del vettore plasmidico. In virtù di queste proprietà chimico-fisiche, le grosse particelle di destrano che contengono il DNA plasmidico possono aderire alla membrana plasmatica ed essere internalizzate in via endocitosica.

Il metodo consiste nel preparare una soluzione contenente 2 µg di DNA plasmidico, 540 µl di PBS (cloruro di calcio 0,133 g/l, cloruro di magnesio 0,1 g/l, cloruro di potassio 0,2 g/l, fosfato di potassio monobasico 0,2 g/l, fosfato di potassio dibasico 1,15 g/l, cloruro di sodio 8 g/l, pH 7,4) e 28 µl di DEAE-destrano. Il contenuto della soluzione è stato messo in provette da 1,5 ml ed è stato accuratamente agitato. Dopo aver lavato le cellule con una soluzione di cloruro di sodio 0,9% sterile si aggiunge in ogni piastra la soluzione descritta in precedenza e si procede con un’incubazione a 37°C per 30 minuti. Allo scadere d el tempo la

soluzione viene rimossa e per ogni piastra sono aggiunti 6 ml di medium fresco e 60 l di clorochina 8 mM con una successiva incubazione di 2,5 ore a 37°C.

La clorochina, che peraltro rappresenta un noto farmaco antimalarico, ha la funzione di stabilizzare la membrana lisosomiale impedendo il rilascio di enzimi degradativi che possono digerire il DNA plasmidico. Al termine dell’incubazione, le cellule sono nuovamente lavate per due volte con NaCl 0,9% sterile e, dopo l’aggiunta di 10 ml di terreno di coltura, coltivate per ulteriori 24 ore a 37°C.

2.4.2 - Transfezione stabile delle cellule CHO

La transfezione stabile delle cellule CHO è stata realizzata tramite il metodo del calcio fosfato (Jordan et al., 1996). A tale scopo cellule CHO DHFR(-) o DHFR(+) sono seminate ad una densità di 5x105 cellule a piastra e incubate a 37°C per circa 24 ore. Il giorno successivo viene preparata, per ogni plasmide da transfettare, una soluzione contenente 50 µl di CaCl2 2,5 M, 10 µg del DNA plasmidico e 450 µl di tampone TE Buffer (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,6). Una volta agitata, a questa soluzione vengono aggiunti 500 µl di HEPES 2x (NaCl 140 mM, Na2HPO4 1,5 mM, HEPES 50mM, pH 7,05). La soluzione è incubata per 30 secondi a temperatura ambiente e immediatamente distribuita goccia a goccia sulle cellule seminate. In seguito le piastre così transfettate sono poste nell’incubatore a 37°C in atmosfera di CO2 al 5%.

Dopo circa 48 ore dalla transfezione, il mezzo di coltura viene sostituito con mezzo fresco contenente uno specifico selezionante che consente alle sole cellule che ne presentano la resistenza di poter crescere.

In seguito ogni tre giorni le piastre vengono lavate con NaCl 0,9% sterile in modo da allontanare i precipitati di CaCl2 e le cellule non selezionate presenti in sospensione. Col passare dei giorni, è possibile osservare la presenza di gruppi di cellule resistenti che si accrescono sempre di più fino al raggiungimento di uno stato di semi-confluenza.

Le cellule vengono così tripsinizzate, contate e distribuite in una piastra multiwells in modo da disporre una singola cellula a pozzetto e ottenere così uno specifico clone il quale una volta accresciuto viene saggiato mediante metodica di binding per appurare che il recettore sia espresso.

2.5 - Metodica per gli studi di binding dei recettori

Il binding viene utilizzato per lo studio dell’interazione diretta tra un farmaco e un recettore e consiste nella valutazione quantitativa della competizione del farmaco in studio con un ligando marcato con un isotopo radioattivo.

La tecnica comporta l’incubazione di una preparazione contenente il recettore in esame con il ligando specifico per quel recettore marcato con un isotopo radioattivo. Gli esperimenti all’equilibrio si fanno, tenendo il tempo, la temperatura e il pH costanti. Durante il periodo di incubazione, una frazione del radioattivo forma con il recettore un complesso ligando-recettore; al termine dell’incubazione, con metodi opportuni si separa il ligando radioattivo non legato da quello in complesso con il recettore e si misura la radioattività di quest’ultimo.

Per gli studi di binding recettoriali, il primo passaggio importante è la preparazione delle membrane cellulari. Le cellule da testare, transientemente o stabilmente transfettate, vengono lavate per due volte con soluzione fisiologica e staccate con 2 ml di tampone ipotonico freddo(Na+-HEPES 1mM, EDTA 2 mM). Dopo 15 minuti di incubazione a 4°C, le cellule sono state staccate e omogeneizzate con un politronizzatore a velocità di rotazione 1000 giri/min per circa di 30 secondi. Il politronizzato è stato recuperato in opportune provette e successivamente centrifugato a 17000 rpm per 15 minuti a 4°C. Una volta eliminato il surnatante, il pellet è stato risospeso in tampone Binding Buffer (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 155 mM, acido ascorbico 0,025%).

Gli esperimenti di binding sono stati condotti su cellule CHO transfettate stabilmente con i recettori dopaminergici umani D2, D3, D4 utilizzando il radioligando [3H]spiperone; la determinazione del binding aspecifico è avvenuta in presenza di dopamina 2mM.

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in un volume finale di 1 ml. L’incubazione è stata effettuata a temperatura ambiente per 1 ora e, per separare il radioligando legato al tessuto da quello non legato, i campioni di tessuto sono stati raccolti utilizzando lo strumento “Brandel Cell Harvester” e filtri a fibre di vetro (Whatmann, GF/B). I filtri sono stati lavati tre volte con tampone freddo (Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, NaCl 155 mM) e successivamente trasferiti in tubi contenenti 4 ml di liquido di scintillazione. La radioattività associata al recettore è stata valutata mediante un – counter.

L’isoterma è stata analizzata con la regressione non lineare usando il PRISM per determinare i valori di IC. Questi vengono poi trasformati in valori di Ki secondo l’equazione di Cheng-Prusoff: Ki= IC50/(1+L/KD), dove L corrisponde alla concentrazione del radioligando e KD è la costante di dissociazione.

2.6 - Binding con [

S]GTP S

La tecnica del binding con [35S]GTP S, nucleotide idrolisi-resistente, permette di monitorare l’efficacia del meccanismo di trasduzione attraverso la misurazione dell’attività funzionale delle proteine G, dopo stimolazione recettoriale con specifici agonisti.

Utilizzando questa tecnica sono state valutate le proprietà antagoniste del composto S33138 sui recettori dopaminergici D3h, D2Lh e D2Sh a concentrazione proteica rispettivamente di 15, 2.2, 1.6 pmol/mg. [35S]GTP S è stato utilizzato ad una concentrazione pari a 1.0 nM per i recettori D3h e 0.1 nM per quelli D2Lh e D2Sh, in condizioni di pH 7.4 e a 22°C per 40 minuti di incubazione. Il buffer di risos pensione dei tessuti è

costituito da HEPES (20 mM), NaCl (150 mM per i recettori D3h e 100 mM per quelli D2Lh e D2Sh), GDP (3µM) e MgCl2 (3 mM per i recettori D3h e 10 mM per quelli D2Lh e D2Sh).

Per studiare l’azione di S33138, le membrane recettoriali sono state incubate con concentrazioni crescenti di S33138 per 15 minuti prima di aggiungere il [35S]GTP S. Invece, per valutare le proprietà antagoniste dell’S33138 sono state utilizzate concentrazioni fisse di dopamina: 1µM per i recettori D3h, 10 µM per i siti D2Lh e infine 3 µM per quelli D2Sh.

Inoltre, la curva concentrazione-risposta per il binding con [35S]GTP S indotto dalla dopamina verso i recettori D3h è stata valutata utilizzando concentrazioni crescenti o fisse di S33138 e con il plot di Schild è stato trovato il valore di pA2. Tutti gli esperimenti sono stati portati a termine con una rapida filtrazione attraverso filtri a fibre di vetro (Whatmann, GF/B). I filtri sono stati lavati tre volte con tampone freddo (Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, NaCl 155 mM) e successivamente trasferiti in tubi contenenti 4 ml di liquido di scintillazione. La radioattività associata al recettore è stata valutata mediante un –counter. I valori di KB per l’inibizione del binding dell’S33138 con [35S]GTP S indotto dalla dopamina è stato calcolato con la formula di Cheng e Prusoff (1973) che è la seguente:

50 50 1 agonista EC IC K_i + =

dove IC50 equivale all’IC50 dell’S33138, l’agonista corrisponde alla concentrazione della dopamina e EC50 rappresenta il valore di EC50 dalla dopamina da sola.

2.7 - Tecnica del western blot

Gli esperimenti di western blotting per la determinazione di MAP chinasi fosforilate (ERK-1, ERK-2) sono stati condotti essenzialmente come descritto da Lavoie et al. (2002). Brevemente, cellule CHO D2Lh

DHFR(-) e CHO D3h DHFR(+) sono fatte crescere in piastre multiwells fino al raggiungimento della semi-confluenza. Le cellule sono state private overnight del siero, sostituendo quest’ultimo con semplice mezzo di coltura. Il giorno della prova, le cellule sono state preincubate con il composto S33138 per 20 min e successivamente esposte all’azione della dopamina 0,1 µM per 5 min a 37°C.

Terminata l’incubazione, le cellule sono state lisate con una opportuna soluzione denaturante (Tris 50 mM, pH 7.5, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, NIAPROOF 0,1%) contenente inibitori delle proteasi (1,5 µM pepstatina, 4 µM leupeptina, 300 nM aprotinina, 0,1 mM PMSF). I campioni sono stati successivamente incubati a 4°C per 30 minuti e centrifugat i per 15 minuti a 17000 rpm. La concentrazione delle proteine presenti nel surnatante è stata misurata con BIO-RAD protein assay kit. Le proteine sono state fatte correre su SDS PAGE (10%) e l’entità della fosforilazione di ERK-1 e ERK-2 (MAP chinasi 44 kDa e 42 kDa) determinata attraverso immuno-blotting con anticorpo monoclonale di mouse anti MAP-chinasi difosforilato (diluito 1:1000). L’anticorpo secondario è di rabbit anti-IgG di mouse (diluito 1: 5000) coniugato con l’enzima perossidasi. Le immagini delle bande presenti sulla membrana sono state rilevate tramite uno scanner Kodak e i relativi dati analizzati con software Kodak.

2.7.1 - Studi delle proprietà antagoniste dell’S33138 sui recettori

D

h e D

h tramite western blotting

Le cellule CHO transfettate con recettori D3h o D2Lh sono fatte crescere in multiwells da 24 pozzetti fino al raggiungimento di una confluenza del 90% e lasciate overnight in un mezzo di coltura senza siero. S33138 è stato diluito nel mezzo e aggiunto ad ogni pozzetto alla concentrazione desiderata. Per studi di antagonismo, le cellule sono preincubate con S33138 per 20 minuti, poi sono esposte alla dopamina (0.1 µM) per 5 minuti. Dopo il periodo di incubazione con la dopamina, è

aggiunto il Laemmli sample buffer contenente 200 mM di ditiotreitolo. Dopo denaturazione a 95° per 3 minuti le cellule lisa te (20 µg) vengono caricate su gel di poliacrilammide al 10%. Le forme fosforilate di pp44 map-chinasi

(ERK-1) e pp42map-chinasi (ERK-2) sono messe in evidenza con l’uso di un anticorpo monoclonale di topo anti map-kinasi attivato (ERK1/2 difosforilato) diluito 1:1000 e un anticorpo secondario di rabbit anti-IgG di topo (diluizione 1:5000) che consente una rilevazione chemiluminescente per coniugazione alla perossidasi. Le forme fosforilate di ERK 1/2 sono state quantificate tramite software Kodak per la rilevazione d’immagini. L’isoterma è analizzata con una regressione non lineare tramite PRISM; i valori di KB sono calcolati seguendo l’equazione di Cheng-Prusoff.

2.8 - Saggio dell’adenilato ciclasi

E’ una metodica che consiste in una prova funzionale che valuta la quantità di cAMP prodotto dalle cellule in coltura a seguito del trattamento con diverse sostanze rispetto al basale. Il metodo utilizzato per lo svolgimento di questo saggio prevede l’uso di colonne cromatografiche di due tipi secondo il protocollo descritto da Avidor-Reiss (1995) e Johnson e Salomon (1991).

Sostanzialmente, con questa prova

funzionale, si fornisce al sistema cellulare adenina triziata che verrà convertita prima in [3H]ATP e quindi in [3H]cAMP attraverso l’enzima adenilato ciclasi.

Ciò che si valuta è esattamente la quantità di cAMP marcato che viene prodotta rispetto al basale (cioè rispetto alle cellule non trattate): se ad esempio la sostanza in analisi ha la proprietà di indurre in qualche modo l’attività della ciclasi

si osserverà un aumento della quantità di [3H]cAMP, mentre se dovesse avere un’azione inibitoria la quantità [3H]cAMP rispetto al basale sarebbe inferiore.

Il primo tipo di colonne utillizzato ha come fase stazionaria la resina

Dowex 50 (AG 50W – X4 resin, 200-400 mesh, hydrogen form Bio-Rad

Laboratories) che contiene gruppi solfonici caricati negativamente. Il passaggio attraverso queste colonne garantisce la separazione dei prodotti che vengono dal metabolismo dell’adenina triziata: [3H]ATP, [3H]ADP, il [3H]cAMP. Mentre [3H]ATP e [3H]ADP sono eluiti per volumi di fase mobile minori in quanto hanno rispettivamente tre e due gruppi fosfato carichi negativamente, il [3H]cAMP viene eluito per volumi di fase mobile maggiori. Il secondo tipo di colonne, invece, ha una fase stazionaria di Allumina (Sigma) che non lega il cAMP ma lega gli altri nucleotidi carichi negativamente. Questa caratteristica consente, attraverso opportuni lavaggi con la fase mobile di imidazolo 0,1 M, una più accurata separazione del [3H]cAMP dagli altri nucleotidi. Il [3H]cAMP eluito verrà poi raccolto in vials precedentemente riempite di liquido di scintillazione.

2.8.1 - Protocollo del saggio di adenilato ciclasi

Dopo 24 ore dalla semina delle cellule nelle piastre a 24 pozzetti, è possibile procedere con il saggio per la determinazione dell’attività dell’adenilato ciclasi. La prova è stata eseguita in triplicato per ogni campione, come descritto da Avidor-Riess et al., 1995

La soluzione “A” è così costituita:

• 200 l di medium x n°di pozzetti da trattare • 4,16 l di [3H] adenina x n° di pozzetti da trattare

Il mezzo di coltura presente nei pozzetti è aspirato e 200 l della soluzione A sono aggiunti in ognuno di essi. La piastra a 24 pozzetti cosi trattata è posta in incubazione per 2 ore a 37°C in p resenza di CO2 al 5%. Durante il periodo di incubazione è preparata una soluzione “B”

contenente due sostanze inibitori delle attività fosfodiesterasiche. Come è noto questi enzimi sono preposti all'idrolisi del cAMP portando alla formazione di 5'-AMP. Ne consegue che l'aggiunta di queste sostanze previene la degradazione dell’cAMP. Gli inibitori utilizzati per questo scopo sono il Ro 20-1274 [4-(3-butossi-4-metossi-benzoil)-2-imidazolidinone] 0,5 mM e l’IBMX (3-isobutil-1-metil-xantina) 1mM. La soluzione “B” è suddivisa in tante provette quante sono le sostanze da analizzare o in base alle concentrazioni di una stessa sostanza così da poter ottenere una curva dose/effetto.

La soluzione “B” è composta da:

• DMEM

• HEPES pH 7,4 20 mM • Ro 0,5 mM

• IBMX 1mM

Ogni provetta è portata ad un volume finale di 5 ml. A ciascuna provetta sono aggiunte le sostanze e gli agonisti necessari per la stimolazione recettoriale (quinpirolo per i recettori e forskolin per adenilato ciclasi V e V/VI). Concluse le due ore di incubazione, la soluzione “A” è aspirata dai pozzetti e sostituita con 250 l della soluzione “B” per realizzare una stimolazione di 10 minuti. Al termine del periodo di stimolazione, il contenuto dei pozzetti è aspirato e sostituito con 1 ml di una soluzione di acido perclorico per lisare le membrane plasmatiche e liberare così il contenuto cellulare di cAMP. La soluzione acida è lasciata agire per un'ora a 4°C, dopo di che l’estratto cellula re è caricato direttamente sulla prima colonna cromatografia.

2.8.2 - Caricamento su colonna

La prima operazione da eseguire è l'equilibratura delle colonne Dowex che è effettuata con due lavaggi di acqua distillata da 8 ml ciascuno. Per le colonne di Allumina i lavaggi sono di imidazolo 0,1 M. Un’aliquota di 900 l del campione trattato con acido perclorico a 4°C è p osta in una provetta

contenente 100 l di soluzione basica allo scopo di neutralizzare l'acido. La provetta è centrifugata per due minuti a 14.000 rpm, in modo da eliminare qualsiasi residuo cellulare non solubilizzato, e 850 l del surnatante sono caricati nella colonna Dowex 50. Sono quindi effettuati due lavaggi di acqua distillata da 1 ml ciascuno per eliminare i nucleotidi di- e tri-fosfati. Al termine di questa operazione le colonne Dowex 50 sono poste in serie con quelle di Allumina in modo tale che l’eluato delle prime colonne sia direttamente convogliato sulle seconde. Entro un volume di 5 ml di acqua tutta la quantità di [3H] cAMP passa dalle colonne Dowex alle sottostanti colonne di Allumina. Conclusa l'eluizione, le colonne Dowex sono rimosse dalla loro postazione e le colonne di Allumina lavate con 1,5 ml di imidazolo. In ultimo, tutto il [3H] cAMP è eluito con 4 ml di imidazolo in vials precedentemente posizionati sotto le colonne di allumina. Ogni vial contiene 10 ml di liquido di scintillazione. Le colonne Dowex sono infine lavate con 4 ml di HCl 1 M per eluire l'adenina triziata, mentre quelle di Allumina sono lavate con 8 ml di imidazolo.

2.8.3 - Valutazione dell’attività antagoniste dell’S33138 sui

recettori D

h, D

h, D

/D

h e D

tramite saggio

funzionale.

Le cellule COS-7 sono state fatte crescere in quattro piastre Petri ad una densità di 7,5x105 a 37°C. Dopo circa 24 ore, ogni piastra è stata transfettata transientemente con il metodo del DEAE-dextrano/clorochina con un DNA plasmidico contenente AC-V e il recettore D3h oppure con AC-V/VI chimerico e i recettori D3h o D2Lh o D3h e D2Lh o il recettore chimerico D3i3(D2) rispettivamente.

In quest’ultimo costrutto chimerico, la sequenza del recettore D2h (dall’aminoacido 327 fino al 338 della porzione C-terminale del terzo loop) è stata inserita nel recettore D3h, tra gli aminoacidi 312 e 323; questa sostituzione consente il mantenimento sia del profilo di riconoscimento del ligando sia dell’espressione della superficie cellulare tipiche recettore D3h wild-type.

Dopo 24 ore dalla transfezione, le cellule sono state tripsinizzate e seminate in multiwells da 24 pozzetti. Trascorse altre 24 ore dalla semina, le cellule sono state saggiate tramite la tecnica dell’adenilato ciclasi descritta nei paragrafi precedenti.

2.9 - Statistica

I dati sono stati presentati come media +/- l’errore standard di almeno tre esperimenti. Le curve di saturazione sono state interpolate dall’equazione n n X K X B a + ∗ = max (1)

per derivare il coefficiente di Hill (n) e dall’equazione

X K X B a d + ∗ = max (2)

per ottenere la costante di dissociazione Kd e la capacità massima di binding Bmax.

I valori di a e di X nelle due equazioni precedenti rappresentano rispettivamente la quantità di [3H]spiperone legato specificatamente al tessuto e la concentrazione dello stesso non legato.

Il coefficiente K nell’equazione (1) rappresenta una costante generica che per n = 1 coincide con la Kd. I dati degli esperimenti di inibizione sono stati interpolati usando l’equazione

n n X K X a + ∗ − =100 100 (3)

X IC X a + ∗ − = 50 100 100 (4)

per calcolare il valore di IC50.

La IC50 rappresenta la concentrazione dell’inibitore che sposta il 50% del radioattivo legato specificatamente ai recettori. I valori di IC50 sono stati trasformati in Ki con la formula di Cheng e Prusoff (1973) che è la seguente: d i K F IC K + = 1 50 ₍₅₎

dove F rappresenta la concentrazione della [3H]-spiperone usata nell’esperimento d’inibizione.

Quando il coefficiente di Hill era diverso da 1, come nel caso di tutti gli agonisti, il valore di IC50è stato trasformato in IC50corretto (IC50 corr) grazie alla formula di Cheng e Prusoff. Il programma usato per calcolare tutte le costanti è stato ORIGIN con un computer IBM-compatibile.