Università degli Studi di Pisa
Scuola di Dottorato in Fisiologia Clinica e Scienze del Farmaco Programma di Dottorato in Virologia Fondamentale e Clinica
“Sviluppo e
un vaccino contro herpes genitale”
Presidente:
Chiar.mo Prof. Luca Ceccherini
Relatore:
Prof. Mauro Pistello
Università degli Studi di Pisa
Scuola di Dottorato in Fisiologia Clinica e Scienze del Farmaco Programma di Dottorato in Virologia Fondamentale e Clinica
“Sviluppo e validazione in vivo di
un vaccino contro herpes genitale”
Chiar.mo Prof. Luca Ceccherini-Nelli
Candidata:
Prof. Mauro Pistello
Flavia Chiuppesi
ANNI ACCADEMICI 2008/2010
SSD MED/07
Università degli Studi di Pisa
Scuola di Dottorato in Fisiologia Clinica e Scienze del Farmaco Programma di Dottorato in Virologia Fondamentale e Clinica
validazione in vivo di
un vaccino contro herpes genitale”
Candidata:
Flavia Chiuppesi
Sommario
1 Riassunto ... 6 2 Abstract ... 8 3 Introduzione ... 10 3.1 Herpes simplex... 10 3.1.1 Classificazione ... 10 3.1.2 Morfologia ... 11 3.1.3 Organizzazione Genomica ... 12 3.1.4 Ciclo Replicativo ... 14 3.1.5 Trasmissione ... 17 3.1.6 Patologia e Patogenesi ... 183.1.6.1 Gengivostomatite erpetica primaria ... 18
3.1.6.2 Herpes oro-facciale ricorrente ... 19
3.1.6.3 Herpes genitale ... 20
3.1.6.4 Herpes neonatale ... 21
3.1.6.5 Altre forme di infezione erpetica ... 21
3.1.6.6 Infezione erpetica nell’ospite immuno-compromesso ... 22
3.1.7 Epidemiologia ... 23 3.1.8 Terapia ... 24 3.2 Sistema Immunitario ... 28 3.2.1 Immunità Innata ... 28 3.2.2 Immunità Specifica ... 30 3.3 Immunità ai Virus ... 33
3.3.1 Immunità Innata ai Virus ... 34
3.3.2 Immunità Acquisita ai Virus... 34
3.4.1 Vaccini attenuati ed inattivati ... 37
3.4.2 Vaccini con antigeni purificati (a subunità) ... 38
3.4.3 Vaccini Sintetici ... 38
3.4.4 Vaccini a DNA ... 39
3.4.5 Vettori Virali ... 40
3.4.5.1 Vettori Retrovirali ... 42
3.4.5.2 Vettori Lentivirali ... 43
3.4.5.3 FIV e Vettori FIV derivati ... 44
3.5 Vaccinazione contro HSV ... 48
4 Scopo della Tesi ... 52
5 Materiali e Metodi ... 53
5.1 Biologia Cellulare e Molecolare ... 53
5.1.1 Linea Cellulare ... 53
5.1.2 Produzione del vettore mediante trasfezione ... 53
5.1.3 Lettura al citofluorimetro ... 54
5.1.4 Trasduzione ... 54
5.1.5 Western Blot ... 54
5.1.6 Saggio ELISA p25 ... 55
5.1.7 Saggio ELISA RT ... 56
5.1.8 Quantificazione dell’RNA del vettore ... 57
5.1.9 Produzione di HSV-1 ed HSV-2 ... 58
5.1.10 Titolazione in vitro del virus ... 58
5.2 Esperimenti in vivo e saggi correlati ... 59
5.2.1 Protocollo vaccinale ... 59
5.2.2 Intracellular Staining (ICS) ... 59
5.2.4 Saggio di neutralizzazione ... 61
5.2.5 Titolazione in vivo del virus ... 62
5.2.6 Challenge ... 62
5.2.7 PCR su tampone vaginale ... 63
5.2.8 Western Blot siero post-challenge ... 64
5.2.9 Immunosoppressione ... 64
6 Risultati ... 66
6.1 Esperimento pilota ... 66
6.1.1 Risultati preliminari in vitro ... 66
6.1.2 Risultati preliminari in vivo ... 67
6.1.2.1 Risposta cellulo-mediata ... 67 6.1.2.2 Risposta umorale ... 68 6.1.2.3 Challenge con HSV-1 ... 69 6.2 Esperimento di vaccinazione ... 71 6.2.1 Risposta cellulo-mediata ... 72 6.2.2 Anticorpi neutralizzanti ... 74 6.2.3 Challenge ... 77 6.2.4 Test post-challenge: PCR e WB ... 79
6.2.5 Test post-challenge: immunosoppressione ... 81
6.3 Vaccinazione seguita da challenge con una DL100 di HSV-2... 84
6.4 Esperimento di vaccinazione combinata FIV-MVA ... 85
7 Discussione ... 88
8 Bibliografia ... 97
