CAPITOLO 4: Parte sperimentale

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4.1 Materiale vegetale

Le parti aeree di Arcytophyllum thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl. sono state raccolte nei pressi di Riobamba, Provincia del Chimborazo, Ecuador nel mese di agosto 2013.

Un campione di materiale vegetale (voucher n. 8144 Arcytophyllum thymifolium/1) è stato depositato presso l’Herbarium Horti Botanici Pisani.

4.2 Estrazione

Il materiale vegetale (700 g) è stato sottoposto ad essiccazione all’aria, macinazione e successiva estrazione a temperatura ambiente con solventi a polarità crescente: n-esano, cloroformio, cloroformio-metanolo (9:1) e metanolo.

La droga è stata estratta attraverso macerazione statica in ogni solvente per circa tre settimane durante le quali il solvente è stato rinnovato ogni 72 h per un totale di quattro volte per ogni tipo di solvente, fino a macerazione esaustiva.

Gli estratti ottenuti ad ogni cambio di solvente sono stati evaporati a pressione ridotta e a temperatura inferiore ai 40 °C mediante rotavapor; ad estrazione finita si sono ottenute le seguenti rese (Fig. 4.1 e 4.2):

 Estratto n-esanico (RE): 9.01 g

 Estratto cloroformico (RC):18.16 g

 Estratto cloroformio-metanolo (RCM): 27.53 g

 Estratto metanolico (RM): 52.95 g

Fig. 4.1 Diagramma della procedura di estrazione di Arcytophyllum thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl.

Droga essiccata (parti aeree) 700 g R n-esanico (9.01 g) R cloroformico (18.16 g) R cloroformio-metanolo (27.53 g) R metanolico (52.95 g)

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Fig. 4.2 Risultati delle estrazioni delle parti aeree di Arcytophyllum thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl.

Sulla base di un’analisi preliminare degli estratti mediante cromatografia su strato sottile (TLC: Thin Layer Chromatography), si è deciso di studiare gli estratti cloroformico e metanolico.

4.2.1 Estrazione e precipitazione per la ricerca di alcaloidi

Come già menzionato (Cap. 1.1), gli alcaloidi sono metaboliti secondari caratteristici della famiglia delle Rubiaceae; anche in Hedyotis, genere strettamente imparentato con il genere Arcytophyllum è stata riscontrata la presenza di questi composti (Phuong et al., 1999). La seguente procedura generale per la separazione degli alcaloidi è stata dunque effettuata per riscontrarne la possibile presenza in A. thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl. (Fig. 4.3):

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Fig. 4.3 Procedimento per la separazione degli alcaloidi dalle parti aeree di Arcytophyllum thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl.

Droga macinata (30 g) macerazione con CHCl3 -NH4OH (3:1) imbuto separatore fase cloroformica (alcaloidi, resine, grassi, cere) + HCl 3% imbuto separatore fase acquosa (sali di alcaloidi, impurezze) + NH4OH imbuto separatore fase cloroformica (alcaloidi) residuo (2.7 mg) fase acquosa (impurezze) fase cloroformica (resine, grassi, cere) fase acquosa (acidi, glicosidi, zuccheri, pigmenti)

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Un’aliquota di droga essiccata e macinata (parti aeree, 30 g) è stata estratta con una miscela di CHCl3-NH4OH (3:1) attraverso macerazione dinamica per circa un’ora. Il filtrato basico

ottenuto è stato ripartito in una fase cloroformica ed in una acquosa per mezzo dell’imbuto separatore, allo scopo di separare i composti polari quali acidi, glicosidi, zuccheri e pigmenti dagli eventuali alcaloidi, presenti sottoforma di basi libere quindi solubili in solventi apolari. Dopodichè la fase cloroformica è stata acidificata mediante l’aggiunta di HCl al 3% e ripartita con acqua tramite imbuto separatore; in questo modo si è ottenuta una fase acquosa acida contenente i sali di alcaloidi eventualmente presenti e una fase cloroformica contenente impurezze quali resine, grassi e cere. Successivamente la fase acquosa è stata basificata per l’aggiunta di NH4OH e ripartita a sua volta con cloroformio arrivando ad avere

due fasi, una cloroformica contenente i possibili alcaloidi sottoforma di basi libere e una acquosa contenente impurezze. Infine la fase cloroformica è stata portata a secco con l’ausilio del rotavapor e il residuo ottenuto (2.7 mg) è stato sottoposto ad analisi spettroscopiche (1_{H-NMR) che non hanno però evidenziato la presenza di alcaloidi. Sulla}

base dei risultati ottenuti è stato dunque ipotizzato che tale classe di composti non sia caratteristica della specie A. thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl. o che le quantità di alcaloidi, se presenti, siano molto basse e quindi difficilmente riscontrabili.

4.3 Studio dell’estratto cloroformico (RC)

Il residuo cloroformico (RC) ottenuto per completa evaporazione del solvente, presentava

un peso complessivo di 18.16 g. Una parte di questo residuo (5.0 g), è stata disciolta in circa 20 ml di cloroformio, caricata su SNAP cartridge e lasciata essiccare sotto cappa. Il campione è stato sottoposto a cromatografia su colonna di gel di silice usando il sistema di purificazione flash Biotage® Isolera™ Spektra.

Il processo di purificazione è avvenuto secondo i seguenti parametri:  SNAP cartridge: 340 g di silice

 Volume colonna: 450 ml  Flusso: 100 ml/min

 Modalità di raccolta: collect all + UV1 (λ=254 nm) + UV2 (λ=320 nm)

 Modalità di rilevamento: scansione in tempo reale PDA  Frazioni da 27 ml

Sono state raccolte 379 frazioni utilizzando come eluenti, miscele di solventi a polarità crescente, da n-esano a metanolo, come illustrato in Tab. 4.1:

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Miscele eluenti Volumi colonna Frazioni n-esano-CHCl₃ (1:1) → CHCl₃ 4 1-77 CHCl₃ 3 78-134 CHCl₃ → CHCl₃-MeOH (98:2) 4 135-211 CHCl₃-MeOH (98:2) → CHCl₃-MeOH (95:5) 4 212-292 CHCl₃-MeOH (95:5) → CHCl₃-MeOH (9:1) 3 293-330 CHCl₃-MeOH (9:1) → MeOH 1 331-379

Tab. 4.1 Cromatografia flash con Biotage® Isolera™ _{Spektra di R} C

Le frazioni ottenute sono state successivamente raggruppate in 18 riunioni principali tenendo conto delle caratteristiche cromatografiche evidenziate dalla cromatografia su strato sottile (TLC) su lastra di gel di silice 60 F₂₅₄. Le fasi mobili utilizzate a tale scopo sono state diverse miscele di n-esano-cloroformio (8:2 e 1:1), cloroformio e infine diverse miscele di cloroformio-metanolo (98:2, 95:5 e 9:1). Le frazioni sono state rivelate con il reattivo universale spray solfato di cerio, che mette in evidenza la maggioranza dei metaboliti sia primari che secondari. Al termine si è ottenuto lo schema di riunione presentato in Fig. 4.4 eliminando le frazioni non significative (1-10; 80-86).

(7)

Fig. 4.4 Schema di riunione dell'estratto RC dopo cromatografia flash con Biotage® Isolera™ Spektra

La frazione RC/4 (37.2 mg) appariva come singola macchia giallastra su TLC, le analisi

spettroscopiche effettuate hanno portato all’identificazione di un composto noto a struttura cumarinica, hedyotiscone A (1).

I dati chimico-fisici del composto (1) sono i seguenti:

Composto (1): solido cristallino giallo; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3; Tab. 3.9); ESI-MS m/z 259}

[M+H]+_{, 539 [2M+Na]}+_.

(8)

4.3.1 Analisi della frazione RC/7

La frazione RC/7(1.22 g) appariva su TLC ancora piuttosto complessa, perciò è stata a sua

volta sottoposta a cromatografia su colonna di gel di silice usando il sistema di purificazione flash Biotage® Isolera™ Spektra con lo scopo di ottenere frazioni più semplici. La frazione è stata quindi disciolta in circa 5 ml di cloroformio, caricata su SNAP cartridge e lasciata essiccare sotto cappa. Successivamente il campione è stato sottoposto a cromatografia eluendo con miscele di solventi a polarità crescente quali n-esano, n-esano-cloroformio, cloroformio, cloroformio-metanolo e metanolo (Tab. 4.2).

Il processo di purificazione è avvenuto secondo i seguenti parametri:  SNAP cartridge: 100 g di silice

 Volume colonna: 66 ml  Flusso: 50 ml/min

 Modalità di raccolta: collect all + UV1 (λ=254 nm) + UV2 (λ=320 nm)

 Modalità di rilevamento: scansione in tempo reale PDA  Frazioni da 20 ml

Miscele eluenti Volumi

colonna Frazioni n-esano 1 1-8 n-esano → n-esano-CHCl₃ (1:1) 2 9-20 n-esano-CHCl₃ (1:1) → n-esano-CHCl₃ (3:7) 2 21-34 n-esano-CHCl₃ (3:7) → n-esano-CHCl₃ (1:9) 3 35-54 n-esano-CHCl₃ (1:9) → CHCl₃ 2 55-68 CHCl₃ 2 69-91 CHCl₃ → CHCl₃-MeOH (98:2) 1 92-101 MeOH 3 102-139

Tab. 4.2 Cromatografia flash con Biotage® Isolera™ Spektra di Rc/7

Sono state raccolte 139 frazioni, successivamente raggruppate in 13 riunioni principali sulla base delle caratteristiche cromatografiche evidenziate da cromatografia su strato sottile (TLC) su lastra di gel di silice 60 F₂₅₄. Le fasi mobili utilizzate a tale scopo sono state cloroformio e cloroformio-metanolo (99:1). Le frazioni sono state rivelate con il reattivo universale spray solfato di cerio.

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E’ stato dunque ottenuto lo schema di riunione presentato in (Fig. 4.5) eliminando le frazioni non significative (1-40; 102-104; 108-112; 121,122; 134-140).

Fig. 4.5 Schema di riunione dell'estratto RC/7 dopo cromatografia flash con Biotage® Isolera™ Spektra

4.3.1.1 Analisi della frazione RC/7/10-11

La frazione RC/7/10 (39.3 mg) è stata riunita con la frazione RC/7/11 (137.4 mg) sulla base

delle somiglianze riscontrate per mezzo della cromatografia su strato sottile (TLC). La frazione risultante (176.7 mg) è stata disciolta in 1.8 ml di MeOH-H2O (75:25) e centrifugata.

Il sovranatante è stato successivamente prelevato e portato a secco in un pallone tarato, ottenendo un campione di 52 mg che è stato ridisciolto in 600 µl di MeOH-H2O (75:25) e

sottoposto ad HPLC su colonna μ-Bondapak RP₁₈ (30 cm × 7.8 mm). La colonna è stata condizionata ed eluita con una miscela di MeOH-H2O (75:25) operando nelle seguenti

condizioni: Frazione Rc/7 1=41-46 (7.9 mg) 2=47-52 (15.5 mg) 3=53-55 (7.9 mg) 4=56-58 (9.3 mg) 5=59-62 (17 mg) 6=63-70 (60.9 mg) 7=71-79 (95.8 mg) 8=80-88 (128.8 mg) 9=89-94 (71.4 mg) 10=95-101 (39.3 mg) 11=104-107 (137.4 mg) 12=113-120 (352.9 mg) 13=123-133 (97.1 mg) Biotage® Isolera™ Spektra

(10)

 Attenuazione: 7x

 Eluente: MeOH-H2O (75:25)

 Velocità flusso: 2.0 ml/min  Iniettata: 100 µl

 Numero di iniettate: 6

Dalla cromatografia sono state ottenute 25 frazioni più quella derivata dal lavaggio della colonna con metanolo. Tali frazioni, dopo completa evaporazione del solvente, sono state disciolte nella minima quantità di metanolo e sottoposte a TLC su lastra di gel di silice 60 F₂₅₄ usando come fase mobile una miscela CHCl3-MeOH (99:1) e come reattivo spray di

rivelazione il solfato di cerio. Sulla base delle caratteristiche cromatografiche le frazioni sono state raggruppate in 9 riunioni principali eliminando quelle non significative (Fig. 4.6).

Fig. 4.6 HPLC della frazione RC/7/10-11

La frazione RC/7/10-11/5 (2 mg, tR= 7 min) su TLC si presentava come una singola macchia

marrone-gialla. Le analisi spettroscopiche hanno permesso la sua identificazione come

hedyotiscone B (2), un composto a struttura cumarinica già noto in natura. Frazione RC/7/10-11 10-11/1=5 10-11/2=6 10-11/3= 1-8,10,12,13,15-18 10-11/4=9 10-11/5=10 10-11/6=11 10-11/7=14 10-11/8=19-20 10-11/9=23-24 RP-HPLC MeOH-H₂O (75:25) Composto 3 Composto 2

(11)

La frazione RC/7/10-11/9 (1.2 mg, tR= 19 min) su TLC appariva come singola macchia gialla.

Le analisi spettroscopiche hanno portato alla sua identificazione come

7-O-(3''-metilbut-2''-enil)-ossi naringenina o 7-prenilossinaringenina (3), un composto noto con struttura

flavonoidica.

I dati chimico-fisici dei composti 2 e 3 sono i seguenti:

Composto 2: solido cristallino giallo; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.10); ESI-MS m/z 243}

[M-H]-_{, 199 [M-H-44]}-_.

Composto 3: solido amorfo; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.17); ESI-MS m/z 339 [M-H]}-_,

341 [M+H]+_.

La frazione RC/9 (202.8 mg) è stata disciolta in circa 2 ml di una soluzione MeOH-H2O (55:45)

e centrifugata. Il sovranatante è stato portato a secco ottenendo un campione di 54.6 mg che è stato nuovamente disciolto in 600 µl di MeOH-H2O (55:45), centrifugato e sottoposto

a cromatografia ad alta pressione (HPLC) su colonna μ-Bondapak RP₁₈ (30 cm × 7.8 mm). La colonna è stata condizionata ed eluita con una miscela di MeOH-H2O (55:45) utilizzando le

seguenti condizioni:  Attenuazione: 7x

 Velocità di flusso: 2.0 ml/min  Iniettata: 100 μl

Dalla cromatografia sono state ottenute 17 frazioni più quella proveniente dal lavaggio della colonna con metanolo. Tali frazioni, dopo completa evaporazione del solvente, sono state disciolte nella minima quantità di metanolo e sottoposte a TLC su lastra di gel di silice 60 F254 usando come fase mobile una miscela CHCl3-MeOH (98:2) e come reattivo spray di

rivelazione il solfato di cerio.

Sulla base delle caratteristiche cromatografiche, sono state formate 8 riunioni principali eliminando quelle non significative (Fig. 4.7).

(12)

Fig. 4.7 HPLC della frazione RC/9

La frazione RC/9/1 (1.0 mg, tR= 7 min) su TLC si presentava come macchia pulita

marrone-chiara. Le analisi spettroscopiche hanno portato all’ identificazione del composto come

p-idrossiacetofenone (4), un composto fenolico semplice noto in natura.

La frazione RC/9/3 (2.5 mg, tR= 10 min) su TLC appariva come una singola macchia

bruno-chiara. Le analisi spettroscopiche hanno permesso la sua identificazione come

7-idrossi-8-(2'-idrossi-3'-metil-3'-butenil)-6-metossicumarina o cneorum-cumarina B (5), un

composto poco noto a struttura cumarinica.

Le frazioni RC/9/7 (11.1 mg, tR= 12 min) e RC/9/8 (2.1 mg, tR= 19 min) si presentavano

anch’esse su TLC come singole macchie. Le analisi spettroscopiche hanno permesso il loro riconoscimento rispettivamente come hedyotiscone B (2), composto isolato anche nella frazione RC/7/10-11/5 e hedyotiscone A (1), già caratterizzato nella frazione RC/4.

I dati chimico-fisici dei composti 4 e 5 sono i seguenti:

Composto 4: solido cristallino; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.26); ESI-MS m/z 135}

[M-H]-_.

Composto 5: solido cristallino; [α]D= -10 (c 0.16, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 346

(4.11), 209 (4.56); 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.11); ESI-MS m/z 275 [M-H]}-_{, 205}

[M-H-70]-_{, 190 [M-H-85]}-_{, 299 [M+Na]}+_{, 281 [M+Na-18]}+_. Frazione R_C/9 9/1=4-5 9/2=6-7 9/3=8 9/4=9 9/5=10 9/6=11,12bis,13 9/7=12 9/8=14,15 RP-HPLC MeOH-H₂O (55:45) Composto 4 Composto 5 Composto 2 _{Composto 1}

(13)

La frazione RC/12 (94.4 mg) è stata disciolta in circa 1 ml di una soluzione MeOH-H2O (55:45)

e centrifugata. Il sovranatante è stato portato a secco ottenendo un residuo di 30 mg che è stato nuovamente disciolto in 350 μl di MeOH-H2O (55:45), centrifugato, e sottoposto a

cromatografia ad alta pressione (HPLC) su colonna μ-Bondapak RP₁₈ (30 cm × 7.8 mm). La colonna è stata condizionata ed eluita con una miscela di MeOH-H2O (55:45) utilizzando le

seguenti condizioni:  Attenuazione: 7x

Dalla cromatografia sono state ottenute 27 frazioni più quella acquisita dal lavaggio della colonna con solo metanolo. Tali frazioni, dopo completa evaporazione del solvente, sono state disciolte nella minima quantità di metanolo e sottoposte a TLC su lastra di gel di silice 60 F₂₅₄ usando come fase mobile una miscela CHCl3-MeOH (95:5) e come reattivo spray di

Tenendo conto delle caratteristiche cromatografiche le frazioni sono state raggruppate in 8 riunioni principali eliminando quelle non rilevanti (Fig. 4.8).

Frazione RC/12 12/1=9 12/2=11 12/3=12-12bis 12/4=13-15 12/5=14 12/6=17 12/7=18-19 12/8=20-21 RP-HPLC MeOH-H₂O (55:45) Composto 6 Composto 2

(14)

La frazione RC/12/3 (1 mg, tR= 10 min) su TLC si presentava come singola macchia

marrone-gialla. Le analisi spettroscopiche hanno permesso la sua caratterizzazione come toddanina (6), un composto già noto in natura a struttura cumarinica.

Le analisi spettroscopiche delle frazione RC/12/7 (2.2 mg, tR= 12 min) hanno permesso la

sua identificazione come hedyotiscone B (2), precedentemente isolato nelle frazioni

RC/7/10-11/5 e RC/9/7.

I dati chimico-fisici del composto 6 sono i seguenti:

Composto 6: solido cristallino giallo-chiaro; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab.3.12); ESI-MS} m/z 277 [M+H]+_{, 575 [2M+Na]}+_{, 259 [M+H-18]}+_{, 205 [M+H-18-54]}+_.

La frazione RC/13 (319 mg) è stata disciolta in circa 3.2 ml di una soluzione di MeOH-H2O

(7:3) e centrifugata. Il sovranatante è stato portato a secco ottenendo un campione di 70 mg che è stato ridisciolto in 700 μl di MeOH-H2O (7:3) quindi centrifugato, ed in seguito

sottoposto a cromatografia ad alta pressione (HPLC) su colonna μ-Bondapak RP18 (30 cm ×

7.8 mm). La colonna è stata condizionata ed eluita con una miscela di MeOH-H2O (7:3)

utilizzando le seguenti condizioni:  Attenuazione: 7x

Dalla cromatografia sono state ottenute 21 frazioni più quella derivante dal lavaggio della colonna con metanolo. Tali frazioni, dopo completa evaporazione del solvente, sono state disciolte nella minima quantità di metanolo e sottoposte a TLC su lastra di gel di silice 60 F254 usando come fase mobile una miscela CHCl3-MeOH (95:5) e come reattivo spray di

Sulla base delle caratteristiche cromatografiche le frazioni più significative sono state raggruppate in 3 riunioni principali (Fig. 4.9) mentre le restanti sono state riunite con la frazione originaria RC/13.

(15)

La frazione Rc/13/3 (1 mg, tR= 22 min) su TLC si presentava come singola macchia gialla. Le

analisi spettroscopiche hanno permesso la sua caratterizzazione come nuovo composto a struttura flavonoidica mai precedentemente isolato, 7-O-(3''-metillbut-2''-enil)-ossi

eriodictiolo o 7-prenilossieriodictiolo (7).

Composto 7: solido amorfo color arancio; [α]D= -37 (c 0.08, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε)

330 (4.51), 288 (3.79), 230sh (4.16); 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.18); HR-ESI-MS m/z}

379.1221 [M+Na]+_.

4.3.4.1 HPCPC della frazione RC/13

La frazione RC/13 riunita è stata successivamente sottoposta ad un altro tipo di

cromatografia, HPCPC (High Performance Centrifugal Partition Chromatography), in quanto la separazione HPLC sopra riportata non ha dato grossi risultati. Inoltre c’era anche l’intento di separare composti a struttura cumarinica, ritenuti essere i costituenti principali dell’estratto cloroformico RC. Presa visione della corsa delle macchie su TLC, il sistema

solvente trovato idoneo alla separazione dei presunti composti contenuti nella frazione RC/13 è il seguente: n-esano-AcOEt-MeOH-H2O (8:5:5:2); tale sistema solvente è stato

ripartito in due fasi per mezzo dell’imbuto separatore. La fase inferiore (polare) con densità maggiore è stata scelta come fase stazionaria, mentre quella superiore (apolare) con densità minore, come fase mobile. Successivamente la frazione RC/13 (300 mg) è stata

disciolta in 1 ml di fase superiore, centrifugata e il sovranatante è stato sottoposto a HPCPC. Sono state impiegate le seguenti condizioni:

Frazione Rc/13 13/1=7,8 13/2=15 13/3=17-18 RP-HPLC MeOH-H₂O (7:3) Composto 7

(16)

 Fase stazionaria: 5 ml/min  Fase mobile: 3 ml/min  Rotore: 700 rpm  Controflusso: 27  Frazioni= 6 ml

Sono state raccolte 95 frazioni a flusso di 3 ml/min di cui 65 in modalità ascendente, eluendo con la fase mobile e 30 in modalità discendente, eluendo con la fase stazionaria. A queste frazioni si è aggiunta quella derivante dal lavaggio del sistema effettuato con solo metanolo.

Le frazioni ottenute sono state successivamente raggruppate in 8 riunioni principali tenendo conto delle caratteristiche cromatografiche evidenziate dalla cromatografia su strato sottile (TLC) su lastra di gel di silice 60 F₂₅₄. La fase mobile utilizzata a tale scopo è stata la fase superiore della miscela n-esano-AcOEt-MeOH-H2O (8:5:5:2) e le frazioni sono

state rivelate con il reattivo universale spray solfato di cerio.

Al termine si è ottenuto lo schema di riunione presentato in (Fig. 4.10) eliminando le frazioni non significative (1-10; 16, 36-65, 83-95).

Fig. 4.10 HPCPC della frazione RC/13

Frazione RC/13 13/A=11-14 13/B=15 13/C=17-22 13/D=23-29 13/E=30-35 13/F=66,67 13/G=68-71 13/H=72-82 HPCPC n-esano:AcOEt:MeOH:H₂O (8:5:5:2)

(17)

La frazione RC/13/C (4.3 mg) si presentava come una macchia marrone-rossastra. Dalle

analisi spettroscopiche risulta trattarsi di un composto a struttura triterpenica, ma la sua struttura è ancora in corso di caratterizzazione.

In nessuna delle altre frazioni ottenute è stata riscontrata la presenza di composti a struttura cumarinica.

La frazione Rc/14 (292.3 mg) è stata disciolta in circa 3 ml di una soluzione MeOH-H2O

(45:55) e centrifugata. Il sovranatante è stato portato a secco ottenendo un campione di 60 mg che è stato nuovamente disciolto in 600 µl di MeOH-H2O (45:55), centrifugato e

con le seguenti condizioni:  Attenuazione: 7x

Sulla base delle caratteristiche cromatografiche le frazioni sono state raggruppate in 10 riunioni principali (Fig. 4.11) eliminando quelle non significative.

(18)

La frazione RC/14/2 (1.3 mg, tR= 10 min) si presentava su TLC come macchia pulita. Le analisi

spettroscopiche hanno confermato la purezza del composto ed hanno permesso la sua caratterizzazione come fraxetina (8), un composto noto a struttura cumarinica.

La frazione RC/14/9 (2.1 mg, tR= 17 min) su TLC appariva come singola macchia

marrone-gialla. Le analisi spettroscopiche hanno permesso la sua caratterizzazione come nuovo composto a struttura cumarinica mai precedentemente isolato,

4'-idrossi-2'-diidrotoddanina (9).

I dati chimico-fisici dei composti 8 e 9 sono qui riportati:

Composto 8: solido giallo aghiforme; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.13); ESI-MS m/z 207}

[M-H]-_{, 192 [M-H-15]}-_{, 209 [M+H]}+_.

Composto 9: polvere color giallo-chiaro; [α]D= -33 (c 0.08, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε)

345 (4.95), 304 (3.27), 270sh (4.66), 253 (3.82) nm; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.14);} HR-ESIMS m/z 291.0599 [M+H]+_{, 313.0467 [M+Na]}+_. Frazione R_C/14 14/1=5 14/2=9-10 14/3=11 14/4=12 14/5=13-14 14/6=15-19 14/7=20-21 14/8=22-23 14/9=24 14/10=26 RP-HPLC MeOH-H₂O (45:55) Composto 8 Composto 9

(19)

La frazione RC/17 (99.9 mg) è stata disciolta in 1 ml di una soluzione di MeOH-H2O (4:6),

centrifugata e il sovranatante è stato portato a secco. E’ stato ottenuto un campione di 40 mg che è stato disciolto in 500 µl di MeOH-H2O (4:6), quindi nuovamente centrifugato e

alle seguenti condizioni:  Attenuazione: 7x

Sulla base delle caratteristiche cromatografiche le frazioni sono state raggruppate in 4 riunioni principali eliminando quelle non rilevanti (Fig. 4.12).

Frazione RC/17 17/1=8 17/2=10-10bis 17/3=11 17/4=12-13 RP-HPLC MeOH-H₂O (4:6) Composto 10

(20)

La frazione RC/17/4 (2 mg, tR= 23 min) su TLC si presentava come singola macchia

marroncina. Le analisi spettroscopiche hanno portato alla caratterizzazione di un nuovo composto a struttura cumarinica mai precedentemente isolato,

7-idrosssi-8-[2',3'-diidrossiisopentil]-6-metossicumarina (10)

Composto 10: solido cristallino; [α]D= -6 (c 0.15, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 345 (4.80),

257sh (3.31), 230sh (4.10); 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.15); HR-ESI-MS 317.0852}

[M+Na]+_{, m/z 293.1160 [M-H]}-_{, 278.1078 [M-H-15]}-_{, 205.0723 [M-H-88]}-_{, 190.0440}

[M-H-15-88]-_{; ESI-MS m/z 292 [M-H]}-_{, 278 [M-H-88]}-_{, 205 [M-H-88]}-_{, 190 [M-H-88-15]}-_.

4.4 Studio dell’estratto metanolico (RM)

Il residuo metanolico (RM), dopo completa evaporazione del solvente, presentava un peso

complessivo di 52.5 g. L’estratto è stato ripartito tramite l’imbuto separatore con una miscela n-BuOH-H2O (1:1), in una porzione n-butanolica RBu (9.4 g) ed in una porzione

acquosa (27.08 g) al fine di eliminare la parte zuccherina e facilitare la successiva identificazione dei metaboliti secondari. Il residuo butanolico RBu è stato quindi disciolto in

circa 32 ml di MeOH, centrifugato e il surnatante è stato sottoposto a cromatografia ad esculsione molecolare su una colonna di Sephadex LH-20 (i.d.= 5.0 cm), eluendo con metanolo a flusso costante di 1.5 ml.

Sono state raccolte 154 provette del volume di 10 ml ciascuna e 4 beute di circa 150 ml (I- IV). Ciascuna frazione è stata sottoposta a TLC su gel di silice 60 F254 usando come eluenti

le miscele CHCl3-MeOH-H2O (80:18:2), n-BuOH-CH3COOH-H2O (60:15:25) (BAW) e la

miscela toluene-HCOOH-AcOEt (5:1:4). La rivelazione è stata effettuata con il reattivo spray solfato di cerio. Sulla base delle caratteristiche cromatografiche, le frazioni sono state raggruppate in 16 riunioni principali mentre quelle non significative al fine di ulteriori indagini, sono state eliminate (101, 121-126, 134,135). Lo schema di riunioni è di seguito riportato (Fig. 4.13).

(21)

Fig. 4.13 Schema di riunione dell’estratto RM dopo cromatografia ad esclusione molecolare su Sephadex LH-20 in MeOH

Le frazioni RM/13, RM/15 e RM/16 si presentavano su TLC come singole macchie arancioni;

le analisi spettroscopiche ne hanno permesso il riconoscimento come flavonoidi già noti in natura, rispettivamente: quercetina-3-O-D-galattopiranoside (26),

quercetina-7-O-metiletere o ramnetina (27) e quercetina (28). RM parti aeree (9.4 g) 1=1-19 (71.3 mg) 2=19-27 (233.2 mg) 3=28-36 (234 mg) 4=37-43 (235 mg) 5=44-47 (200.3 mg) 6=48-49 (122 mg) 7=50-53 (132.5 mg) 8=54-61 (188.6 mg) 9=62-65 (127 mg) 10=66-70 (146 mg) 11=71-79 (189.4 mg) 12=80-94 (48 mg) 13=95-120 (331 mg) 14=127-151 (209.7 mg) 15=153-153 (225.3 mg) 16=154 (153 mg) Sephadex LH-20 MeOH Composto 28 Composto 26 Composto 27

(22)

I dati chimico-fisici dei composti 26, 27 e 28 sono i seguenti:

Composto 26: polvere color giallo intenso; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.21); ESI-MS} m/z 463 [M-H]-_{, 487 [M+Na]}+_.

Composto 27: polvere color giallo intenso; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.22); ESI-MS} m/z 315 [M-H]-_.

Composto 28: polvere color giallo intenso; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.23); ESI-MS} m/z 301 [M-H]-_.

4.4.1 Analisi della frazione RM/4

La frazione RM/4 (235 mg) è stata disciolta in 2.4 ml di MeOH-H2O (3:7) e centrifugata. Il

sovranatante è stato successivamente prelevato e sottoposto ad HPLC su colonna μ-Bondapak RP18 (30 cm × 7.8 mm). La colonna è stata condizionata ed eluita con una miscela

di MeOH-H2O (3:7) operando nelle seguenti condizioni:

Dalla cromatografia sono state ottenute 19 frazioni alle quali se ne è aggiunta una derivata dal lavaggio della colonna con metanolo. Tali frazioni, dopo completa evaporazione del solvente, sono state disciolte nella minima quantità di metanolo e sottoposte a TLC su lastra di gel di silice 60 F254 usando come fase mobile una miscela CHCl3-MeOH-H2O (70:30:3) e

come reattivo spray di rivelazione il solfato di cerio. Sulla base delle caratteristiche cromatografiche le frazioni sono state raggruppate in 9 riunioni principali (Fig. 4.14) eliminando quelle non significative.

(23)

Fig. 4.14 HPLC della frazione RM/4

La frazione RM/4/3 (2.5 mg, tR= 4 min) su TLC si presentava come singola macchia

marrone-chiara. Le analisi spettroscopiche hanno portato all’identificazione del composto come

acido asperulosidico (11), un composto a struttura iridoide noto in natura.

La frazione RM/4/6 (1.2 mg, tR= 9 min) su TLC appariva come una singola macchia

bruno-scura. Le analisi spettroscopiche hanno permesso la sua identificazione come estere

metilico dell’acido deacetil asperulosidico o deacetil daphylloside (12), un composto noto

a struttura iridoide.

Anche la frazione RM/4/9 (5.4 mg, tR= 32 min) su TLC si presentava come singola macchia

bruno-scura. Le analisi spettroscopiche hanno permesso la sua caratterizzazione come

estere metilico dell’acido asperulosidico o daphylloside (13), un altro composto noto a

struttura iridoide.

Composto 11: polvere amorfa; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.1); ESI-MS m/z 431}

[M-H]-_{, 251 [M-H-180]}-_{, 455 [M+Na]}+_{, 275 [M+Na- 180]}+_. Frazione R_M/4 4/1=1 4/2=2,7,8, 4/3=3,4 4/4=5,6 4/5=9,9bis 4/6=10,11 4/7=12,12bis 4/8=13,16 4/9=14,15 RP-HPLC MeOH-H₂O (3:7) Composto 11 Composto 13 Composto 12

(24)

Composto 12: polvere gialla; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.2); ESI-MS m/z 427}

[M+Na]+_{, 265 [M+Na-162]}+_{, 807 [2M-H]}-_.

Composto 13: solido amorfo giallo-bruno; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.3); ESI-MS} m/z 469 [M+Na]+_{, 307 [M+ Na- 162]}+_{, 891 [2M-H]}- _.

La frazione RM/5 (200.3 mg) è stata disciolta in 2 ml di MeOH-H2O (35:65), centrifugata e il

campione è stato sottoposto ad HPLC su colonna μ-Bondapak RP18 (30 cm × 7.8 mm). La

colonna è stata condizionata ed eluita con una miscela di MeOH-H2O (35:65) operando

nelle seguenti condizioni:  Attenuazione: 7x

Dalla cromatografia sono state ottenute 23 frazioni più quella ottenuta dal lavaggio della colonna con il solo metanolo. Tali frazioni dopo completa evaporazione del solvente, sono state disciolte nella minima quantità di metanolo e sottoposte a TLC su lastra di gel di silice 60 F254 usando come fase mobile una miscela di CHCl3-MeOH-H2O (70:30:3) e come reattivo

spray di rivelazione il solfato di cerio.

Sulla base delle caratteristiche cromatografiche le frazioni sono state raggruppate in 13 riunioni principali eliminando quelle non significative (Fig. 4.15).

(25)

La frazione RM/5/1 (1 mg; tR= 5 min) appariva su TLC come una singola macchia

bruno-chiara. Le analisi spettroscopiche hanno portato all’identificazione di un iridoide già noto in natura, scandoside (14).

La frazione RM/5/4 (2.5 mg, tR= 7 min) dalle analisi spettroscopiche è risultata essere l’acido asperulosidico (11), composto isolato anche nella frazione RM/4/3

Le frazioni RM/5/6 (14.6 mg; tR= 8 min) e RM/5/9, (0.6 mg; tR= 13 min) si presentavano su

TLC come singole macchie bruno-scure. Le analisi spettroscopiche hanno portato all’identificazione di un altro iridoide noto: asperuloside (15).

La frazione RM/5/11 (0.6 mg, tR= 14 min) su TLC si presentava come singola macchia color

bruno-scuro. Le analisi spettroscopiche hanno permesso la sua identificazione come

daphylloside (13), composto isolato anche nella frazione RM/4/9.

I dati chimico-fisici dei composti 14 e 15 sono qui riportati:

Composto 14: solido amorfo color arancio; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.4); ESI-MS} m/z 389 [M-H]-_{, 227 [M-H-162]}-_{, 413 [M+Na]}+_. Frazione RM/5 5/1=2 5/2=3 5/3=4,5,6 5/4=7,8 5/5=9 5/6=10 5/7=11 5/8=12,13 5/9=15 5/10=16 5/11=17 5/12=18 5/13=20,21,22 RP-HPLC MeOH-H2O (35:65) Composto 14 Composto 11 Composto 15 Composto 15 Composto 13

(26)

Composto 15: solido aghiforme incolore; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.5); ESI-MS m/z}

413 [M-H]-_{, 437 [M+Na]}+_{, 275 [M+Na-162]}+_. 4.4.3 Analisi della frazione RM/6

La frazione RM/6 (122 mg) è stata disciolta in 1.2 ml di una miscela MeOH-H2O (25:75). Il

surnatante è stato prelevato e portato a secco ottenendo un residuo di circa 80 mg circa che è stato a sua volta disciolto in 900 μl di MeOH-H2O (25:75), centrifugato, sottoposto a

cromatografia ad alta pressione (HPLC) su colonna μ-Bondapak RP18 (30 cm x 7.8 mm). La

colonna è stata condizionata ed eluita con una miscela di MeOH-H2O (25:75) utilizzando le

seguenti condizioni:  Attenuazione: 7x

 Eluente: MeOH-H2O (25:75)

 Velocità flusso: 2.0 ml/min  Iniettata: 100 μl

 Numero iniettate: 8

Dalla cromatografia sono state ottenute 13 frazioni più quella ottenuta dal lavaggio della colonna con il solo metanolo. Tali frazioni dopo completa evaporazione del solvente, sono state disciolte nella minima quantità di metanolo e sottoposte a TLC su lastra di gel di silice 60 F254 usando come fasi mobili una miscela di n-BuOH-AcOH-H2O (60:15:25) e una di CHCl3

-MeOH-H2O (70:30:3) e come reattivo spray di rivelazione il solfato di cerio.

(27)

La frazione RM/6/2 (2.4 mg, tR= 5 min) su TLC si presentava come singola macchia marrone

che in seguito ad analisi spettroscopiche è stata riconosciuta essere l’iridoide scandoside (14) isolato anche nella frazione RM/5/1.

Anche la frazione RM/6/8 (1.9 mg, tR= 6 min) che su TLC appariva come una singola macchia

di color bruno-chiaro, è risultata essere un iridoide isolato nella precedente frazione, l’asperuloside (15).

La frazione RM/7 (132.5 mg) è stata sciolta in 1.3 ml di una soluzione MeOH-H2O (4:6),

centrifugata e il campione è stato sottoposto a cromatografia ad alta pressione (HPLC) su colonna μ-Bondapak RP18 (30 cm x 7.8 mm). La colonna è stata condizionata ed eluita con

una miscela di MeOH-H2O (4:6) utilizzando le seguenti condizioni:

 Velocità flusso: 2.0 ml/min  Iniettata: 100 μl

 Numero iniettate: 9

Dalla cromatografia sono state ottenute 25 frazioni più quella ottenuta dal lavaggio della colonna con il solo metanolo. Tali frazioni dopo completa evaporazione del solvente, sono

Frazione R_M/6 6/1=1 6/2=2 6/3=3 6/4=4 6/5=5 6/6=7 6/7= 8,10 6/8=9 6/9=11 6/10=12 RP-HPLC MeOH-H2O (25:75) Composto 14 Composto 15

(28)

state disciolte nella minima quantità di metanolo e sottoposte a TLC su lastra di gel di silice 60 F254 usando come fase mobile una miscela di CHCl3-MeOH-H2O (80:18:2) e come reattivo

spray di rivelazione il solfato di cerio.

La frazione RM/7/2 (1.8 mg, tR= 7 min) si presentava su TLC come singola macchia color

bruno- scuro. Le analisi spettroscopiche hanno portato al suo riconoscimento come

asperuloside (15), un iridoide isolato anche nelle frazioni RM/5/6, RM/5/9 e RM/6/8, quindi

molto abbondante nell’estratto metanolico.

La frazione RM/7/5 (1 mg, tR= 11 min) su TLC appariva come singola macchia bruno-scura.

Sulla base delle analisi spettroscopiche risulta trattarsi di un altro iridoide ma la sua struttura è ancora in fase di caratterizzazione.

La frazione RM/7/8 (1.3 mg, tR= 25 min) su TLC si presentava come macchia pulita

bruno-scura. Le analisi spettroscopiche hanno permesso la sua identificazione come estere

metilico del 10-O-p-idrossibenzoilscandoside (17) un composto di natura iridoide già noto

in letteratura. Frazione RM/7 7/1= 7 7/2=8,9 7/3=10,11 7/4=12,13,17,2 2,30 7/5=15,16 7/6=18 7/7=23 7/8=24,25 7/9=26,27,28 7/10=29 7/11=4 7/12=5 RP-HPLC MeOH-H2O (4:6) Composto 15 Composto 16 Composto 17 Composto 18 Composto 19

(29)

La frazione RM/7/10 (1 mg, tR= 32 min) su TLC si mostrava anch’essa come singola macchia

bruno-scuro. Le analisi spettroscopiche ne hanno permesso la caratterizzazione come

estere metilico dell’acido 10-O-p-idrossibenzoildeacetil asperulosidico (18), un nuovo

derivato naturale a struttura iridoide.

Le analisi spettroscopiche della frazione RM/7/12 (1.7 mg, tR= 5 min) hanno condotto all’

identificazione di un altro composto di natura iridoide già noto in letteratura, deacetil

asperuloside (19).

Composto 17: polvere amorfa; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.6); ESI-MS m/z 523 [M-H]}

-, 547 [M+Na]+_{, 385 [M+Na-162]}+_.

Composto 18: solido amorfo giallo-bruno; UV (MeOH) λmax (log ε): 252 (4.11), 340 sh (3.94); 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.7); HR-ESI-MS m/z 523.1158 [M-H]}- _{547.1179 [M+ Na]}+_;

ESI-MS m/z 361 [M- H-162]- _{, 523 [M-H]}-_{, 547 [M+Na]}+_{, 385 [M+ Na-162]}-_.

Composto 19: polvere amorfa; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.8); ESI-MS m/z 371 [M-H]}

-, 395 [M+Na]+_{, 351 [M+Na-144]}+_{, 233 [M+Na-162]}+_.

La frazione RM/9 (127 mg) è stata sciolta in circa 1.3 ml di una soluzione MeOH-H2O (4:6) e

centrifugata. Il sovranatante è stato prelevato e portato a secco; il residuo di 80 mg ottenuto è stato quindi nuovamente disciolto in 800 µl di soluzione MeOH-H2O (4:6) quindi

centrifugato e sottoposto a cromatografia ad alta pressione (HPLC) su colonna μ-Bondapak RP18 (30 cm x 7.8 mm). La colonna è stata condizionata ed eluita con una miscela di

MeOH-H2O (4:6) utilizzando le seguenti condizioni:

Dalla cromatografia sono state ottenute 30 frazioni più quella ottenuta dal lavaggio della colonna con il solo metanolo. Tali frazioni dopo completa evaporazione del solvente, sono state disciolte nella minima quantità di metanolo e sottoposte a TLC su lastra di gel di silice 60 F254 usando come fase mobile una miscela di CHCl3-MeOH-H2O (80:18:2) e solo CHCl3, il

reattivo spray di rivelazione è stato il solfato di cerio.

(30)

bruno-scura. Dalle analisi spettroscopiche (1_{H-NMR) risulta trattarsi di un altro composto di natura}

iridoide ma l’elucidazione della sua struttura è ancora in corso.

La frazione RM/10 (146 mg) è stata sciolta in circa 1.5 ml di una soluzione MeOH-H2O (4:6)

e centrifugata. Il sovranatante è stato prelevato e portato a secco; il residuo di 40 mg ottenuto è stato quindi nuovamente disciolto in 500 µl di soluzione MeOH-H2O (4:6) quindi

centrifugato e sottoposto a cromatografia ad alta pressione (HPLC) su colonna μ-Bondapak RP18 (30 cm x 7.8 mm). La colonna è stata condizionata ed eluita con una miscela di

MeOH-H2O (4:6) utilizzando le seguenti condizioni:

 Velocità flusso: 2.0 ml/min  Iniettata: 100 μl Frazione RM/9 9/1=11 9/2=13,16,17,2_2,29 9/3=14 9/4=15 9/5=19,20 9/6=21 9/7=23 9/8=26 9/9=27 9/10=28 9/11=30 13/12=31 RP-HPLC MeOH-H2O (4:6) Composto 20

(31)

Dalla cromatografia sono state ottenute 27 frazioni più quella ottenuta dal lavaggio della colonna con il solo metanolo. Tali frazioni dopo completa evaporazione del solvente, sono state disciolte nella minima quantità di metanolo e sottoposte a TLC su lastra di gel di silice 60 F254 usando come fase mobile due diverse miscele di CHCl3-MeOH-H2O (80:18:2),

(70:30:3) e una miscela di CHCl3-MeOH (9:1), il reattivo spray di rivelazione è stato il solfato

di cerio.

Frazione RM/10 10/1=2 10/2=3 10/3=6 10/4=10,11 10/5=12 10/6=13 10/7=14 10/8=15 10/9=16,17 10/10=19 10/11=20,21 10/12=22,23 10/13=24,25 10/14=26,27 RP-HPLC MeOH-H2O (4:6) Composto 21 Composto 22 Composto 23 Composto 2

(32)

La frazione RM/10/5 (1 mg, tR= 10 min) si configurava come singola macchia gialla dopo

cromatografia su TLC, e questo ha sollecitato l’ulteriore investigazione. Le analisi spettroscopiche hanno permesso la sua identificazione come acido 3-O-caffeoilchinico-metilestere o estere metilico dell’acido neoclorogenico (21) un metabolita secondario di

natura fenolica noto nel regno vegetale.

La frazione RM/10/7 (1 mg, tR= 15 min) su TLC si presentava anch’essa come una macchia

pulita marrone-gialla. Le analisi spettroscopiche hanno permesso la sua caratterizzazione come 6-demetil-4'-idrossi-2'-diidrotoddanina o 2',4'-diidrossibnorbrailina (22) una molecola con struttura cumarinica mai precedentemente isolata.

La frazione RM/10/11 (1.5 mg, tR= 24 min) su TLC si presentava come una singola macchia

marrone. Grazie alle analisi spettroscopiche è stata identificata come kaempferolo

3-O-β-D-glucopiranosil-(1→2)-β-D-galattopiranoside (23) un composto con struttura

flavonoidica già noto ma raro all’interno del regno vegetale.

La frazione RM/10/13 (1 mg, tR= 34 min) su TLC si presentava come una singola macchia

marrone-gialla che è stata identificata come hedyotiscone B (2), composto isolato più volte nell’estratto cloroformico RC, precisamente nelle frazioni RC7/10-11/5, RC9/7 e RC12/7.

I dati chimico-fisici dei composti 21, 22, 23 sono i seguenti:

Composto 21: solido giallo aghiforme; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.24); ESI-MS m/z}

367 [M-H]

-Composto 22: solido cristallino; UV (MeOH) λmax (log ε) 345 (3.44), 304 (4.76), 270sh 253

(4.13); 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.16); HRESIMS m/z 277.0578 [M+H]}+_{; ESI-MS m/z}

275 [M-H]–_{, m/z 245 [M-H-30]}–_{, 201 [M-H-30-44]}-_.

Composto 23: polvere amorfa giallo-chiara; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.19); ESI-MS} m/z 609 [M-H]-_{, 285 [M-H-162-162]}-_{, 633 [M+Na]}+_.

La frazione RM/11 (189.4 mg) è stata disciolta in 1.9 ml di MeOH-H2O (45:55), centrifugata

e sottoposta ad HPLC su colonna μ-Bondapak RP18 (30 cm × 7.8 mm). La colonna è stata

condizionata ed eluita con una miscela di MeOH-H2O (45:55) operando nelle seguenti condizioni:

(33)

Dalla cromatografia sono state ottenute 24 frazioni più quella derivata dal lavaggio della colonna con il solo metanolo. Tali frazioni dopo completa evaporazione del solvente, sono state disciolte nella minima quantità di metanolo e sottoposte a TLC su lastra di gel di silice 60 F254 usando come fasi mobili una miscela di n-BuOH-AcOH-H2O (60:15:25) e una di CHCl3

-MeOH-H2O (70:30:3) e come reattivo spray di rivelazione il solfato di cerio.

La frazione RM/11/2 (10 mg, tR= 5 min) si presentava su TLC come singola macchia giallastra.

Le analisi spettroscopiche hanno permesso il suo riconoscimento come acido

5-caffeoilchinico o acido clorogenico (24) un metabolita secondario di natura fenolica conosciuto nel regno vegetale.

Frazione R_M/11 11/1=2 11/2=3 11/3=4,5 11/4=7,8,9 11/5=10,11,12 11/6=14 11/7= 15,15bis 11/8= 17,,18,19 11/9=20 RP-HPLC MeOH-H2O (45:55) Composto 24 Composto 23 Composto 8 Composto 2

(34)

I dati chimico-fisici dei composto 24 sono i seguenti:

Composto 24: solido giallo; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.25); ESI-MS m/z 353 [M-H]}-_.

Nelle frazioni RM/11/4 (10 mg, tR= 6 min), RM/11/7 (3.4 mg, tR= 19 min) e RM/11/8 (1.4 mg,

tR= 29 min) sono stati invece ritrovati composti già individuati in precedenza,

rispettivamente fraxetina (8), kaempferolo 3-O-β-D-glucopiranosil-(1→2)-β-D-galattopiranoside (23) e hedyotiscone B (2).

In particolare, il composto (8) è stato isolato anche nella frazione RC/14/2, il composto (23)

nella frazione RM/10/11 mentre il composto (2) in numerose frazioni quali RC/7/10-11/5,

RC/9/7, RC/12/7, RM/10/13, mettendo in evidenza la sua abbondanza nella specie

Arcytophyllum thymifolium (Ruiz & Pav.) Standl.

La frazione RM/12 (48 mg) è stata sciolta in 500 µl di una soluzione MeOH-H2O (45:55),

centrifugata e il campione ottenuto è stato sottoposto a cromatografia ad alta pressione (HPLC) su colonna μ-Bondapak RP18 (30 cm x 7.8 mm). La colonna è stata condizionata ed

eluita con una miscela di MeOH-H2O (45:55) utilizzando le seguenti condizioni:

Dalla cromatografia sono state ottenute 23 frazioni più quella proveniente dal lavaggio della colonna con metanolo. Tali frazioni dopo completa evaporazione del solvente, sono state disciolte nella minima quantità di metanolo e sottoposte a TLC su lastra di gel di silice 60 F254 usando come fase mobile due diverse miscele di solventi, la prima costituita da

CHCl3-MeOH-H2O (70:30:3) e la seconda da CHCl3-MeOH (9:1), il reattivo spray di

rivelazione è stato il solfato di cerio.

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verde-giallastra. Le analisi spettroscopiche hanno permesso la sua identificazione come fraxetina (8) composto già isolato più volte, precisamente nelle frazioni RC/10/2 e RM/11/4.

La frazione RM/12/2 (6.9 mg, tR= 10 min) dalle analisi spettroscopiche si è rivelata essere

un composto noto a struttura flavonoidica, quercetina

3-O-β-D-glucopiranosil-(1→2)-β-D-galattopiranoside (25).

I dati chimico-fisici del composto (25) sono di seguito riportati:

Composto 25: polvere amorfa gialla; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab. 3.20); ESI-MS m/z 650}

[M+Na]+_{, 488 [M+Na-162]}+_. Frazione RM/12 12/1=7,8,9 12/2=11,12,13 12/3=17 12/4=18 12/5=19,20 12/6=21 12/7=22 12/8=24-26 RP-HPLC MeOH-H2O (45:55) Composto 8 Composto 25

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4.5 Attività biologica: inibizione enzima lattato deidrogenasi (LDH)

I composti 1, 2, 3, 6, 8 e 15 sono stati saggiati al fine di valutarne possibili proprietà inibitorie nei confronti dell’isoforma 5 purificata dell’enzima deidrogenasi lattato umana (hLDH5). I test effettuati s’inseriscono in un progetto di ricerca che coinvolge il Dipartimento di Farmacia dell’Università di Pisa, volto all’identificazione di agenti che mostrano un’attività inibitoria verso questo enzima; in letteratura sono riportate numerose piccole molecole di natura fenolica in grado di interagire con la LDH, in particolare il flavonoide luteolina 7-O-β-D-glucoside (Phlomis kurdica Rech.f. Lamiaceae) è stato recentemente trovato avere un IC50 significativa, comparabile con quella del composto di riferimento galloflavina, tanto da

suscitare interesse per programmi futuri di ricerca (Bader et al., 2015). La IC50 dei composti

è stata dunque calcolata in comparazione con quella del flavonoide galloflavina, secondo il procedimento descritto nel Cap. 5.3.1. I risultati sono riportati in Tab. 4.3. I composti testati che mostravano un’elevata fluorescenza a 340 nm (1, 2, 6 e 8) sono stati ulteriormente saggiati tramite un saggio accoppiato per evitare che tale fluorescenza interferisse con la misurazione dei dati di IC50. Nessuno dei composti testati ha mostrato valori significativi di

IC50; in particolare i composti 1, 2, 8 e 15 risultano essere completamente inattivi mentre i

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Composto hLDH5a IC50 μM Hedyotiscone A (1) Inattivo Fluorescente (saggio DR) Hedyotiscone B (2) Inattivo Fluorescente (saggio DR) 7-prenilossinaringenina (3) 40% a 500 μM > 500 Toddanina (6) 48% a 500 μM > 500 Fluorescente (saggio DR) Fraxetina (8) Inattivo Fluorescente (saggio DR) Asperuloside (15) Inattivo Galloflavina 103 ± 22.6 (201)b

Tab. 4.3 Attività inibitoria dei composti 1, 2, 3, 6, 8 e 15 nei confronti dell’enzima LDH a _{I dati sono riportati come valore ± SD di tre o più esperimenti indipendenti,}b _{Valore riportato in}