I
Indice
INDICE... I TAVOLA DEGLI ACRONIMI... IV RIASSUNTO E SCOPO DELLA TESI ... V CAPITOLO 1: INTRODUZIONE
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1.1 ENZIMI MAO-A E MAO-B ...1
1.1.1 Generalità ...1
1.1.2 La struttura ...2
1.1.3 Le reazioni di mono-ossigenazione enzimatica...3
1.1.4 Meccanismo catalitico delle MAO ...5
1.1.5 Substrati ...8
1.1.6 Inibitori della MAO-A ...10
1.2 ENZIMI IMMOBILIZZATI...12
1.2.1 Introduzione ...12
1.2.1.1 Adsorbimento ...13
1.2.1.2 Legame covalente ...14
1.2.1.3 Reticolazione ...14
1.2.1.4 Intrappolamento ...14
1.2.1.5 Incapsulazione ...15
1.2.2 IMERs (“Immmobilized Enzyme Reactors”) ...15
1.3 BIBLIOGRAFIA DEL CAPITOLO 1...17
II
CAPITOLO 2: RISULTATI E DISCUSSIONI... 19
2.1 IMMOBILIZZAZIONE DELLA MAO-A ...19
2.1.1 La fase stazionaria IAM...19
2.1.2 Preparazione dell’IMER contenente MAO-A...20
2.1.3 Valutazione della resa di immobilizzazione ...21
2.2 ATTIVITÀ DELLA MAO-A NON IMMOBILIZZATA...23
2.2.1 Valutazione dell’attività enzimatica ...23
2.2.2 Studio dell’attività della MAO-A con il substrato chinuramina (2)...24
2.2.3 Studio dell’attività della MAO-A con il substrato adrenalina (6)...27
2.3 STUDIO DELL’ATTIVITÀ DELLA MAO-A IMMMOBILIZZATA ...31
2.3.1 Cinetica della chinuramina (2) ...31
2.3.1.1 Studio dell’attività catalitica con il substrato adrenalina (6)...33
2.3.1.2 Studio della stabilità del bioreattore...35
2.3.1.3 Studio del consumo di ossigeno...35
2.3.2 Studio dell’inibizione della MAO-A immobilizzata ...37
2.3.3 Studio dell’inibizione con il substrato chinuramina (2)...38
2.4 BIBLIOGRAFIA DEL CAPITOLO 2...43
CAPITOLO 3: CONCLUSIONI ... 44
CAPITOLO 4: PARTE SPERIMENTALE... 46
4.1 SOLVENTI E REAGENTI ...46
4.2 MISURE ANALITICHE E CHIMICO-FISICHE ...47
4.3 METODI CROMATOGRAFICI...47
4.3.1 Analisi della miscela chinuramina/4-idrossichinolina...47
4.3.2 Analisi della miscela adrenalina/DOPEGAL...48
4.4 IMMOBILIZZAZIONE DELL’ENZIMA ...48
4.4.1 Determinazione dell’attività catalitica dell’enzima non immobilizzato...48
4.4.1.1 Substrato: chinuramina...49
4.4.1.2 Substrato: adrenalina...49
4.4.2 Determinazione dell’attività catalitica dell’enzima immobilizzato...50
4.5 PROVE DI INIBIZIONE ...50
4.5.1 Prove di inibizione “on-line”...50
4.5.2 Prove di inibizione “in batch” ...51
4.6 ANALISI DEL CONSUMO DELL’OSSIGENO ...51
4.7 ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DELL’EUGENOLO ...51
APPENDICE A: CINETICA ENZIMATICA ... 53
A.1 ASPETTI GENERALI ...53
III
APPENDICE B: MECCANISMI DI INIBIZIONE ... 57 B.1 INIBIZIONE DELL’ATTIVITÀ ENZIMATICA...57 B.1.1 Inibizione competitiva e non competitiva...58
IV
Tavola degli acronimi
MAO: monoammino ossidasi
PBS: “Phosphate buffered saline”, soluzione di tampone fosfato (soluzione di KH2PO4 e K2HPO4, se non diversamente specificato 50mM, pH=7,5)
Kyn: “kynuramine”, chinuramina
4HQ: “4-hydroxyquinoline”, 4-idrossichinolina FAD: Flavin-adenin-dinucleotide
NAD: Nicotinamide adenine dinucleotide
IAM: “Immobilized Artificial Membrane”, membrana artificiale immobilizzata MAOIs: “MAO inibitors”, inibitori delle MAO
Km: costante di Michaelis-Menten Vmax: velocità massima
IMERs: “Immobilized Enzyme Reactors”, reattori con enzimi immobilizzati BSA: “Bovine Serum albumin”, sieroalbumina bovina
V
Riassunto e Scopo della Tesi
La monoammino ossidasi (MAO) è un enzima localizzato nella membrana mitocondriale esterna e distribuito in vari tessuti, che catalizza la deamminazione ossidativa di ammine primarie, secondarie e terziarie. Nei mammiferi esistono due forme della MAO, la MAO-A e la MAO-B, che differiscono nella specificità e sensibilità verso substrati e inibitori. Inibitori selettivi della MAO-A sono ad esempio usati nel trattamento della depressione e dell’ansia, mentre gli inibitori della MAO-B vengono somministrati nella cura del Parkinson e dell’Alzheimer.
L’importanza da un punto di vista farmacologico e terapeutico della ricerca di composti che agiscano come inibitori della MAO richiede lo sviluppo di metodi efficaci per studiare l’attività enzimatica e l’inibizione e per identificare rapidamente questi composti in miscele complesse.
Un approccio promettente è rappresentato dalla possibilità di immobilizzare l’enzima su un supporto cromatografico per creare un bioreattore (“Immobilized Enzyme Reactor”, IMER).
L’immobilizzazione degli enzimi infatti pemette di superare alcuni svantaggi legati all’uso di enzimi quali la scarsa stabilità, la difficoltà di recupero dalla miscela di reazione ed il costo elevato ed ha reso possibile l’utilizzo dei biocatalizzatori sia in processi industriali che in campo medico.
Scopo di questa tesi è stato l’immobilizzazione della MAO-A e lo studio della sua attività catalitica.
VI
L’enzima proveniente da fonti commerciali è stato immobilizzato mediante legame non covalente su una fase stazionaria cromatografica contenente una membrana artificiale, impaccata in una colonna per HPLC. La resa di immobilizzazione è stata determinata mediante misure spettrofotometriche. Le propietà dell’enzima supportato sono state studiate in termini di attività enzimatica ed è stato fatto un confronto con le proprietà dell’enzima libero nelle stesse condizioni sperimentali. Sono stati inoltre determinati quantitativamente i parametri cinetici utilizzando uno dei substrati standard noti per questo enzima.
Per seguire l’andamento delle prove catalitiche è stato messo a punto un metodo che ha permesso la determinazione rapida della concentrazione del substrato e del prodotto mediante HPLC. E’ stata inoltre valutata la stabilità nel tempo dell’enzima immobilizzato.
E’ stato infine messo a punto un sistema accoppiato bioreattore-rivelatore fluorimetrico che ha permesso la valutazione diretta “on line” di fenomeni di inibizione in presenza di composti di varia struttura.
