Materiali e Metodi
2.5.b Sintesi in vitro dei trascritti da microiniettare
(Melton et al., 1985)
I trascritti da microiniettare devono contenere sequenze che ne aumentano la stabilità, sia l’efficienza di traduzione all’ interno della cellula.
Per questo si inserisce il cDNA dei geni da iniettare all’interno dei plasmidi che contengono elementi stabilizzanti l’ RNA. Inoltre per aumentare l’ efficienza di traduzione, si aggiunge alla miscela di trascrizione una “terminal CAP structure “(CAP) all’estremità 5’.
In questo modo si possono ottenere trascritti stabili, in grado di sopravvivere all’interno della cellula. Il CAP, tipico di molti RNA cellulari, consiste di una 7-metil-guanosina 5’ trifosfato, che si lega mediante un ponte fosfodiesterico 5’-5’ All’ RNA trascritto in vitro, rallentandone la degradazione in ambiente cellulare. Per ottenere trascritti forniti di CAP è sufficiente far avvenire la reazione di trascrizione in presenza di una concentrazione di GTP pari a 1/10 di quella del CAP, la cui concentrazione eguaglia quella di ATP, UTP e CTP.
I templati vengono di norma preparati digerendo 5-10 µg di DNA plasmidico, usando un sito di restrizione a valle della coda di poli-A o del sito di poliadenilazione virale. La reazione di trascrizione viene generalmente condotta in 50 µl.
Materiali e Metodi
Esempio:
DNA linearizzato 1-2 µg
Tampone per trascrizione 5 X 10 µl
DT 0.1 M 5 µl ATP 10mM 2,5 µl CTP 10mM 2,5 µl UTP 10mM 2,5 µl GTP10 mM 2,5 µl “CAP” 10mM 2,5 µl RNA-polimerasi 2 µl (50-100 UE) Rnase-Inhibitor 1 µl (20 UE) H2O RF fino a 5
La reazione procede a 37 °C per 2 ore, trascorse le quali, si idrolizza il DNA stampo aggiungendo 1-2 di DNAsi I RF e, incubando, sempre a 37 °C, per 15 minuti.
Il trascritto viene estratto con fenolo-cloroformio a pH 7,5 e precipitato in 2,5 V di etanolo assoluto più 0,1 V di CH3COONa 2,5-3 M a pH 5,2.
La concentrazione viene stimata su gel, confrontando un’ aliquota con tRNA a concentrazione nota