87
Abbreviazioni utilizzate nel testo
2-AG: 2-arachidonoil glicerolo
A1: recettore adenosico A1
AA: acido arachidonico
AACOCF3: arachidonil trifluorometil chetone
ACEA: arachidonil-2
'-cloroetilamide
AEA: anandamide
CB1
: recettore cannabinoide di tipo 1
CB2
: recettore cannabinoide di tipo 2
COX-1: prostaglandin-endoperossido sintetasi 1 o ciclossigenasi 1
COX-2: prostaglandin-endoperossido sintetasi 2 o ciclossigenasi 2
DAGL α/β: diacilglicerol lipasi α/β
DEPC: dietilpirocarbonato
DMSO: dimetilsolfossido
ECS: sistema endocannabinoide
EDTA: acido etilendiamminotetraacetico
FAAH: fatty acid amide hydrolase
FBS: siero fetale bovino
GAPDH: gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi
GPR55: G protein-coupled receptor 55
88
KW-3902: rolofillina
LPI: α-lisofosfatidilinositolo
MAGL: monoacilglycerol lipasi
MetAEA: metanandamide
NAPE-PLD: N- arachidonoil fosfatidiletanolamina fosfolipasi D
NArPE o NAPE: N-arachidonoil fosfatidiletanolamina
OA: acido oleico
OAE: virodamina
PA: acido palmitico
PEA: palmitoil etanolamide
PG: prostaglandine
PLA
2: fosfolipasi A
2PPAR : peroxisome proliferator-activated receptor
RF: RNase Free
RT-PCR: reverse transcriptase-polymerase chain reaction
TNM: Tumor Node Metastases
TRPV1: transient receptor potential cation channel (subfamily V
member 1)
89
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Indice figure
Figura 1: Tipologie di melanoma extracutaneo... 5 Figura 2. Struttura della pelle. In dettaglio: strato basale dell'epidermide e
disposizione dei melanociti rispetto alle cellule che lo compongono. ... 6 Figura 3. Istotipi di melanoma (classificazione utilizzata dalla World Health
Organization, WHO). ... 9 Figura 4. Variazione dell’incidenza del melanoma cutaneo in Stati selezionati dal 1965 al 2005. ... 11 Figura 5. Tasso di incidenza globale del melanoma in entrambi i sessi, range di età 0-85.* ... 12 Figura 6. Curve di sopravvivenza rispetto a: A) le diverse categorie T, B) stadi I e II diagnosticati (dati ottenuti da American Joint Committee on Cancer Melanoma
Staging Database). ... 19 Figura 7. Curve di sopravvivenza rispetto a: C) le diverse categorie N, D) stadio III diagnosticato (dati AJJC Melanoma Staging Database). ... 20 Figura 8. Rappresentazione schematica dei signalling pathway associati all'attivazione dei recettori cannabinoidi indotta da CB agonisti. ... 24 Figura 9. Strutture dei recettori umani cannabinoidi CB1 e CB2. ... 26 Figura 10. Strutture chimiche dei composti endocannabinoidi individuati fino ad oggi. ... 28 Figura 11. Rappresentazione schematica dell’inattivazione degli endocannabinodi (Fowler C.J., 2007). ... 29 Figura 12. Principali signalling pathways coinvolti nell’azione anticancro esercitata da agonisti cannabinoidi (Oesch S. and Gertsch J., 2009). ... 33 Figura 13. Possibili target di composti cannabinoidi e principali signalling pathways coinvolti nell’azione anticancro. ... 35 Figura 14. Signalling pathway individuati fino ad oggi innescati dal GPR55. ... 37 Figura 15. Strutture dei composti utilizzati nello studio. ... 45 Figura 16. Fotomicrografica delle cellule A375 a bassa densità (sinistra) ed alta densità (destra) di crescita. ... 46 Figura 17. A: Bioconversione del substato WST-1 in sale di formazano solubile. B: risultato di un esperimento visualizzato con WST-1. 1) indica i pozzetti che
contengono solo cellule e mezzo, 2) indica pozzetti che contengono mezzo, cellule e WST-1: più scuro è il colore, più forte è l’attività metabolica delle cellule. ... 53 Figura 18. Elettroforesi su gel di agarosio per il prodotto di PCR con primer relativi alla GAPDH. ... 65 Figura 19. Elettroforesi su gel di agarosio per il prodotto di PCR con primer relativi ai recettori CB1 e CB2. ... 66
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Figura 20. Elettroforesi su gel di agarosio per il prodotto di PCR con primer relativi al GPR55 e al TRPV1... 67 Figura 21. Elettroforesi su gel di agarosio dell’amplificato ottenuto con primer per PPARα e PPARγ. ... 68 Figura 22. Elettroforesi su gel di agarosio per il prodotto di PCR per l'amplificazione della COX-1 e della COX-2. ... 68 Figura 23. Elettroforesi su gel di agarosio per il prodotto di PCR ottenuto con primer relativi al recettore A1. ... 69 Figura 24. Riduzione della vitalità cellulare della linea A375, dopo trattamento con AEA (sinistra) e 2-AG (destra), in un range di concentrazione 0,1-100 μM, dopo 48h di esposizione, DMEM+1% di siero. ... 71 Figura 25. Riduzione della vitalità sulla linea cellulare A375, inseguito a trattamento con capsaicina, 48 ore di esposizione, 1% FBS. ... 73 Figura 26. Rappresentazione schematica del ruolo del FAAH, MAGL e COX-2 sul metabolismo di AEA, 2-AG e altri endocannabinoidi (Fowler C.J., 2007)... 73 Figura 27. Riduzione della vitalità cellulare della linea A375, dopo trattamento con AEA, a concentrazioni variabili (0,1-100μM), e Rofecoxib (1μM). In rosso: curva dell'AEA (0,1-100μM). In nero: curva AEA+ Rofecoxib. ... 74 Figura 28. Riduzione della vitalità cellulare sulla linea A375, dopo trattamento con Met-AEA (sinistra) e ACEA (destra) nel range di concentrazione 0,1-100μM, 48h di esposizione. ... 75 Figura 29. Riduzione della vitalità cellulare della linea A375, dopo trattamento con JWH133 (0,1-100μM), 48 ore di esposizione, 1% FBS. ... 76 Figura 30. Riduzione della vitalità cellulare della linea A375, dopo trattamento con AM251 nel range di concentrazione 0,1-50 μM, per 48 ore di esposizione, 1% di FBS. ... 77 Figura 31. Riduzione della vitalità cellulare sulla linea A375, dopo trattamento con AACOCF3, nel range di concentrazioni 0,1-100μM, con tempi di esposizione di 48h (sinistra) e 72h (destra), in presenza dell'1% di FBS. ... 78 Figura 32. Effetto sulla vitalità cellulare della contemporanea somministrazione di AACOCF3 e AM251. A) Effetto sulla vitalità dopo 48h di esposizione, 1%FBS. B) Effetto sulla vitalità dopo 72h di esposizione, 1% FBS. ... 79 Figura 33. Effetto sulla vitalità cellulare di composti COX-inibitori, dopo 48h di esposizione, 1% FBS. A) Riduzione della vitalità cellulare dopo somministrazione di celecoxib, range di concentrazione 0,1-150μM. B) Effetto sulla vitalità cellulare dopo somministrazione di rofecoxib, 0,1-100μM. C) Effetto sulla vitalità cellulare dopo somministrazione di indometacina, 0,1-100μM. ... 82
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Indice tabelle
Tabella 1. Incidenza del melanoma in Stati selezionati, comparata tra uomini e donne, periodo 1998-2002 [MacKie R.M., 2009]. ... 13 Tabella 2. Fattori di rischio suddivisi in base alle evidenze ottenute riguardo il loro coinvolgimento nell'eziologia della malattia [Markovic S.N. et al., 2007]. ... 14 Tabella 3. TNM staging categories: categorie di stadiazione del melanoma cutaneo, secondo il TNM staging system aggiornato al 2009. ... 16 Tabella 4. Classificazione AJCC stadi anatomici del melanoma cutaneo, aggiornata al 2009. ... 18 Tabella 5. Composti cannabinoidi e relativa azione sui recettori CB1, CB2, GPR55.38 Tabella 6. Profili sui recettori CB dei composti cannabinoidi saggiati. ... 43 Tabella 7. Sequenze dei primer utilizzati. Tutti gli oligo sono stati forniti dalla Sigma Genosys. ... 48 Tabella 8. Protocolli di PCR utilizzati e lunghezza degli amplificati attesi. ... 62 Tabella 9. Profilo di espressione qualitativa di target valutati tramite RT-PCR. Simboli: + : espresso - : non espresso ... 70
