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RISULTATI E DISCUSSIONE
I test pre-trasfusionali per i profili indicati nel protocollo di convalida sono stati effettuati su entrambi gli strumenti IH-1000 Diamed in parallelo. Tutte le sedute analitiche relative alle prove di convalida sono state realizzate solo a fronte della verifica dei CQI eseguiti sugli strumenti. Nell’ambito della Performance qualification (QP) sono state eseguite prove finalizzate a dimostrare la performance strumentale in termini di accuratezza diagnostica. Si precisa che, a differenza dei test quantitativi come quelli relativi alla Qualificazione biologica (CQB), non è possibile stimare un CV che valuti la dispersione dei risultati di prove ripetute sugli stessi campioni nella stessa seduta analitica (precisione entro la serie) o in diverse sedute (precisione tra le serie), trattandosi di test semiquantitativi, se non prendendo in considerazione i quattro diversi gradi di score di reattività. Sembra, tuttavia, inutile elaborare una statistica fondata sul grado di reattività dal momento che non esiste un cut-off ed è sufficiente uno score di 1+ per identificare una positività.
Accuratezza diagnostica per la qualificazione degli analizzatori IH-1000
(DiaMed)
a) Sensibilità e specificità analitica
Per verificare i parametri di sensibilità e specificità analitica, come output atteso si è preso come riferimento la capacità da parte dei reagenti di identificare campioni con stessa specificità Anti-D, risultati positivi allo screening anticorpale. Come previsto dagli Standard del SIMTI “e’ auspicabile che la concentrazione del siero anti-D utilizzato per la convalida della procedura analitica sia ≤ 0,5 UI/ml per il test da eseguire per i donatori e ≤ 0,1 UI/ml per il test da eseguire per i pazienti, testato contro emazie D-eterozigoti (R1r, R2r)”. Essendo la nostra attività finalizzata all’assegnazione, per i pazienti, di sacche eritrocitarie concentrate, sono stati scelti campioni di siero positivi, con debole espressione anticorpale di anticorpi anti-D, diluiti in concentrazioni note a
39 partire da 0,1 UI/ml e concentrazioni di 0,05 UI/ml e 0,025 UI/ml, provenienti da ditta di produzione esterna. La seconda e terza concentrazione di analita non rientrano tra i criteri di accettabilità ma hanno lo scopo di far conoscere all’operatore i limiti del metodo analitico. Per saggiare la conformità dei reagenti alle specifiche tecniche riportate dal produttore, il campione contenente anti-D in concentrazione 0.05 UI/ml proveniente da ditta esterna, è stato processato in parallelo con campione contenente stessa concentrazione Anti-D della ditta Diamed.
Su tutti e dieci i campioni positivi scelti (uno di CQ Diamed e 9 di ditta esterna) i test di TCI e Panel-ID sono stati ripetuti in tre diversi cicli analitici su entrambi gli strumenti IH-1000. Alla concentrazione di 0,1 UI/ml vi è stata una concordanza di risultati del 100% per entrambe le tipologie di test (Fig.10 e 11). Alla concentrazione di 0,05 UI/ml vi è stata concordanza di risultati del 100% solo per il test TCI, mentre l’identificazione appare difficilmente interpretabile. Alla stessa concentrazione di siero Anti-D proveniente da ditta Diamed, invece, appare evidente anche l’identificazione (Fig.12), con reattività differente rispetto al campione proveniente da ditta esterna. Alla concentrazione di 0.025 UI/ml, ben al di sotto, quindi, di quella indicata dagli standard come limite di rilevabilità, solo in un due casi, rispettivamente al terzo e secondo ciclo di prova è risultata una debole reattività al TCI, mentre l’identificazione non è mai stato possibile effettuarla. Solo per un campione è stato necessario ripetere il test per volume di siero insufficiente una volta raggiunto il terzo ciclo di prova. Una sintesi dei risultati ottenuti è riportata in Tab.11.
40 Tab.11 Esito prove convalida: sensibilità e specificità dei test TCI e panel-ID. I campioni associati alle relative concentrazioni sono: 44000042/52/62 (0,1 UI/ml); 4400043/53/63 (0,05UI/ml); 44000044/54/64 (0,025 UI/ml); Diamed QC serum 1 (0,05 UI/ml).
Fig.10 Screening TCI a tre cellule eseguito per un campione a concentrazione anti-D di 0,1UI/ml
41 Fig.11 Esito di pannello di identificazione anticorpi antieritrocitari a 11 cellule
Fig.12 Identificazione anticorpale: come si può leggere dal pannello antieritrocitario vi è l’univoca identificazione della presenza di anticorpi anti-D.
Sono stati scelti, poi, 25 campioni tra donatori e donne partorienti, provenienti dal settore di Immunoematologia di base, distinti in 10 Rh francamente negativi, 10 Rh francamente positivi e 5 Rh negativi ma week D positivi. I campioni sono stati analizzati in parallelo su Neo-Galileo (Immucor) e i due strumenti IH-1000 (Diamed), con i reagenti e materiali disponibili in routine forniti dalle ditte Immucor e Diamed. L’unico test eseguito è stato quello del gruppo diretto (ABO/D), per verificare l’accuratezza del metodo in schedina in riferimento a campioni con debole espressione antigenica RH. A tal riguardo i tre cicli previsti sono stati effettuati per tutti i campioni considerati (Tab.12). I test effettuati su entrambi gli strumenti IH-1000 hanno rilevato, per uno dei campioni ritenuti critici, l’inequivocabile espressione di D parziale (D VI positivo),
42 mentre per un altro la ripetuta presenza di doppie popolazioni da probabile immunoprofilassi post-parto. Tuttavia, la rilevazione di clot ha portato al fallimento del test e alla necessità di ripeterlo due volte su due dei campioni, registrazione da valutare nell’ambito del successivo controllo statistico di processo.
Tab.12 Esito test di gruppo diretto: i primi cinque campioni sono quelli critici per la debole espressione dell’antigene D. Gli ultimi venti campioni sono i controlli, rispettivamente, dieci francamente positivi e dieci negativi all’Rh.
Su cinque campioni noti con espressione di gruppo debole, solo in un caso, ed in particolare in un paziente preospedalizzato proveniente dal settore di IE di Base, si è
43 riscontrata una discrepanza di gruppo (o meglio di sottogruppo) tra l’esecuzione del test in metodica Capture, in fase solida, e quella in metodica in schedina. Con la metodica in Capture il campione, pur risultato di gruppo A al test di gruppo diretto, ha mostrato la presenza al test indiretto di anticorpi anti-A1 (Fig.13) con probabile esito, quindi, di sottogruppo A2 del campione. La presenza di anticorpi anti-A1 non è stata rilevata, invece, con la metodica in schedina (Fig.14). Pur non essendo rilevante clinicamente, ciò dimostra che la presenza di anticorpi anti-A1 nel campione, sia stata al di sotto del limite di rilevabilità dell’analizzatore IH-1000, a differenza degli altri campioni.
Tab.13 Confronto tra gli esiti delle due metodiche su campione con debole espressione di gruppo A.
44 Fig. 13 Metodica in Capture: si evidenzia la presenza di anticorpi anti A1 al test di gruppo indiretto (score di 27.7).
Fig.14 La metodica in schedina non evidenzia la presenza di anticorpi anti A-1 al test di gruppo indiretto.
Attraverso una convalida retrospettiva sono stati scelti, infine, dieci campioni di pazienti ambulatoriali positivi al TCD, con specificità anticorpali differenti (Fig.15), sui quali sono state effettuate repliche in parallelo sui due strumenti IH-1000, con gli stessi lotti di schedine e reagenti. I campioni sono stati confrontati con altri dieci risultati negativi al TCD (Tab.14), usati come controllo.
45 Tab.14 Dati di archivio di pazienti ambulatoriali saggiati in parallelo sui due strumenti IH-1000 risultati positivi a Test di Coombs diretto per diverse specificità anticorpali e/o di fattori del complemento. Sono stati riportati anche dati di pazienti negativi al TCD, saggiati su entrambi gli strumenti, come controllo.
Fig.15 Esempio di paziente con diverse specificità anticorpali e fattori del complemento adesi alla superficie eritrocitaria.
b) Riproducibilità
Per verificare l’accuratezza diagnostica in termini di riproducibilità dei risultati, sono stati testati in parallelo sui due strumenti IH-1000, e non oltre le 24 ore dal loro arrivo
46 alla nostra Struttura Trasfusionale, 12 campioni di donatori e pazienti preospedalizzati provenienti dal settore di Immunoematologia di Base. I campioni sono stati scelti opportunamente, dopo essere stati saggiati con metodica in Capture, distinguendoli in tre di gruppo A, tre di gruppo B, tre di gruppo O e tre di gruppo AB, come prospettato
dalle linee guida internazionali9. Gli stessi campioni hanno, poi, subito delle repliche in
tre cicli in giorni diversi. L’ analisi è stata effettuata per gruppo completo, fenotipo e TCI (profilo di prima determinazione). Tutti i risultati hanno avuto esito congruente, con una concordanza del 100% sia per gruppo e fenotipo che per TCI (Tab.15). Solo in due casi è stato necessario ripetere il test, in uno dei quali a causa di errata lettura di barcode per etichetta sbiadita, eventualità già prospettata in sede di analisi del rischio mediante FMECA. Nonostante la qualificazione delle etichette sia avvenuta a monte di qualsiasi processo che ne implichi il loro utilizzo, un evento di questo tipo va inquadrato nel contesto di una non conformità, nel corso delle prove di convalida relative alla qualificazione delle etichette. Per tutti i test eseguiti sono stati utilizzati, su entrambi gli strumenti IH-1000, gli stessi lotti di schedine e di reagenti.
Tab.15 Esito prove di comparazione tra due metodiche e i due strumenti IH-1000 sui 12 campioni scelti.
47 Per l’assegnazione delle sacche mediante “Type and Screen”, il processo analitico, in termini di riproducibilità, è stato convalidato mediante convalida retrospettiva. Sono stati utilizzati dati di archivio di 20 pazienti ambulatoriali afferenti direttamente al Centro Sangue di Careggi. Il profilo oggetto di studio di riproducibilità è stato, in questo caso, quello relativo al controllo di gruppo e TCI (ABD+TCI). I campioni dei pazienti erano stati saggiati su entrambi gli strumenti IH-1000 con gli stessi lotti di reagenti e schedine. Su due dei venti pazienti, la presenza di doppie popolazioni (Fig.16), in assenza di un test indiretto per il tipo di profilo considerato, non ha permesso la determinazione di gruppo e, comunque, in tutti i casi i due analizzatori IH-1000 hanno evidenziato risultati totalmente sovrapponibili (Tab.16). Essendo una valutazione fatta su dati di archivio, inoltre, si può disporre dell’esito finale ma non viene espresso il numero di volte un cui un test è fallito o ripetuto.
Tab.16 Riproducibilità per profilo di controllo di gruppo e TCI
48 Fig. 16 Presenza di doppie popolazioni su due campioni, rispettivamente per anti-A e anti-B che rendono non interpretabile la tipizzazione di gruppo diretta.
c) Adeguatezza al Turn Around Time (TAT)
Nel valutare l’adeguatezza ai tempi analitici ed, in particolare, il ritardo nell’evasione delle richieste urgenti, sono state simulate prove di campioni in urgenza, esclusivamente per i profili previsti dalle normative vigenti (determinazione di gruppo mediante prima determinazione in caso di paziente non conosciuto e controllo di gruppo e TCI per paziente già noto con TCI non più valido). Sono stati testati 10 campioni per profilo di prima determinazione in urgenza e 10 campioni per profilo di conferma di gruppo e TCI (ABD+TCI). I rispettivi test sono stati ripetuti in tre diversi cicli analitici su entrambi gli strumenti IH-1000 e in diverse modalità di carico degli analizzatori. Si è verificato che i tempi tecnici di risposta dell’analizzatore in urgenza non dovessero essere superiori ai 45’ stabiliti dalla ST. Su 60 ripetizioni complessive di prime determinazioni, eseguite sia con analizzatore a vuoto che a medio carico, solo in due casi, la necessità di ripetere i test su siero per TCI e tipizzazione di gruppo indiretta, ha dato una risposta di poco superiore ai tempi attesi (48’). In un altro caso, invece, non è stato possibile eseguire il test al terzo ciclo per esaurimento del volume minimo necessario (Tab. 17)
49 Tab.17 Tempi di risposta rispettivamente per IH-1000 0200082 e per IH-1000 0200118 per il profilo di prima determinazione in urgenza.
Nella simulazione di test per controllo di gruppo e TCI in urgenza, l’esecuzione delle prove ha dato esito temporale positivo in 58 ripetizioni su 60 con una variabilità di tempi più ristretta e con un tempo più frequente di risposta di 32’ misurato sia con analizzatore a vuoto che a medio carico. Tuttavia, due urgenze caricate insieme al terzo ciclo su uno dei due IH-1000, hanno riportato un tempo di risposta superiore a quello atteso di 45’ (Tab. 18). La causa principale del ritardo è risultata essere la presenza, durante l’attività di routine, di 20 test in corso, di cui molte urgenze non montate in un unico batch ma singolarmente in tempi diversi e successivi al caricamento di quelle utilizzate per le prove di convalida, incorrendo nel rischio già preliminarmente riportato in corso di analisi FMECA. In un altro caso, la ripetizione del
50 test non ha comunque avuto ripercussioni sulla tempistica, avendo fornito l’output all’interno dei criteri di accettazione.
Tab.18 Tempi di risposta rispettivamente per IH-1000 0200082 e per IH-1000 0200118 per il profilo di controllo di gruppo e TCI.
GESTIONE CONTROLLATA NEL CAMBIAMENTO DELLA SOP
Nell’ambito di una modifica della procedura del trattamento preanalitico dei campioni dei pazienti, che ha previsto la variazione dei tempi e della velocità di centrifugazione dagli iniziali 10 minuti a 3.000 rpm agli attuali 5 minuti a 4.300 rpm, sono state eseguite prove finalizzate a dimostrare che le modalità operative siano rimaste sotto controllo, senza alcun impatto che queste modificazioni possano aver avuto sul rischio clinico. A tal fine sono stati scelti dieci campioni provenienti dall’Immunoematologia di Base, di cui due negativi al TCI, quattro positivi alla ricerca di anticorpi antieritrocitari, due con espressione debole dell’antigene D (Fig.17), uno positivo all’antigene Kell ed uno con tipizzazione di gruppo incerta con metodica in Capture (Fig.18).
51 Tutti i campioni sono stati saggiati in parallelo su entrambi gli strumenti IH-1000 e ripetuti in tre cicli in entrambe le modalità di trattamento preanalitico. Solo su un campione (paziente politrasfuso) non è stato possibile determinare il fenotipo per la presenza di doppie popolazioni nelle microcolonne contenenti anticorpi anti-C e anti-c (Fig.19). Tuttavia, in entrambe le modalità di centrifugazione, e su entrambi gli strumenti, i risultati si sono dimostrati congruenti con una sovrapponibilità del 100% anche per i campioni particolari (Tab.19), a dimostrazione che il cambiamento del trattamento preanalitico non ha comportato alcun impatto in termini di accuratezza diagnostica, ed anzi, ha prodotto una riduzione dell’IPR in fase preanalitica per quanto riguarda i tempi finali di risposta (Tab.20).
Tab.19 Esecuzione di campioni con particolari caratteristiche nelle due modalità di trattamento preanalitico su entrambi gli strumenti IH-1000
52 Fig.17 Campione con debole espressione dell’antigene D con metodica in Capture ben discriminata con metodica in schedina (score ++)
Fig.18 Gruppo O con tipizzazione indiretta di gruppo A nella metodica in Capture. La metodica in schedina conferma, invece, il gruppo O anche nel test indiretto. La spiegazione potrebbe essere nel tipo di anticoagulante del campione in Litio-eparina e non in EDTA, che nella metodica in Capture può causare emolisi per il mancato sequestro di calcio e conseguente attivazione del complemento presente nel siero, dando una immagine falsamente pallida del micropozzetto.
53 Tab.20 Rivalutazione del Risk Assessment in conseguenza di una modifica della SOP. L’introduzione della modifica ha permesso di dimezzare l’IPR.
