La diagnostica microbiologica “classica” e
“innovativa” delle GE
Stefano Andreoni (Novara)
Laboratorio di Microbiologia e Virologia
Azienda O/U Maggiore della Carità
Novara
condizioni cliniche popolazione coinvolta Differente patogenesi
(fattori di virulenza)
nei prematuri negli anziani nei trapiantati
Diarree in
immunodepressi estendersi di condizioni di deficit immunitario
incremento patologie cronico-
debilitanti Differente
prevalenza eziologica
condizioni ambientali predisponenti
diarree dei viaggiatori zoonosi
alimentari food-borne outbreaks differenze
geografiche
differente stagionalità differente
incidenza per fasce d’età
crescita immigrazione
Diarree comunitarie
sedi in cui
si manifestano Diarree nosocomiali
Enteropatie
infettive
Bacterial toxins include toxins produced by Bacillus, Clostridium and Staphylococcus
Food-borne viruses include calicivirus, hepatitis A virus, flavivirus, rotavirus and other unspecified viruses Other causative agents include mushroom toxins, marine biotoxins, histamine, mycotoxins and escolar fish Parasites include primarilyTrichinella, but also Cryptosporidium, Giardia and other unspecified parasites Other bacterial agents include Listeria, Brucella, Shigella, Vibrio and other unspecified bacterial agents
Distribution of all food-borne outbreaks per causative agent in the EU, 2013
22,5%
18,1%
16,1%
28,9% 5.196 focolai
43,183 casi umani 5.946 ricoveri 11 decessi.
Tipi di gastroenteriti batteriche (da Humphries RM et al., CMR, 2015) Parametri Gastroenterite
secretoria Gastroenterite
infiammatoria Gastroenterite invasiva
Localizzazione Tipo di
Manifestazione Cellularità fecale
Meccanismo patogenetico
Patogeni principali
Piccolo intestino prossimale
Diarrea acquosa
Assenza di leucociti fecali
alterazione meccanismi escrezione/assorbimento
aper azione di enterotossine o adesione/invasione
batterica
V. cholerae, ETEC,
C. perfringens, B. cereus S. aureus
Colon
Dissenteria
Leucociti fecali
danneggiamento della mucosa con
infiammazione
per azione di citotossine o invasione batterica
Shigella spp., STEC Salmonella spp. (no S. Typhi/Paratyphi ), V. parahaemolyticus, C.difficile
Campylobacter
Piccolo intestino distale
Febbre enterica
Leucociti fecali
Penetrazione nella mucosa e invasione sistema reticolo- endoteliale
Salmonella Typhi/Paratyphi, Yersinia enterocolitica
a: shift di acqua ed elettroliti nel lume intestinale
Proprietà di E.coli responsabili di infezioni enteriche
ETEC
Meccanismo
patogenetico Sintomi Età
prevalente Quadro
clinico
LT e ST Diarrea, diarrea del viaggiatore
Diarrea acquosa, crampi, nausea, disidratazione
Adulti, bambini
EAggEC
Diarrea acquosa, febbre, vomito, feci mucose Diarrea acuta
Adesività, attachment affacement epitelio int.
< 2 anni, adulti EPEC
EIEC Invasione, Distruzione epitelio int.
Dissenteria Diarrea ematica, febbre, crampi,
feci mucose, ematiche
Adulti
EHEC Tossina
Shiga-like sconosciuto
Diarrea, colite emmorragica Diarrea, acuta
o cronica
Diarrea ematica, febbre, crampi,TTP Diarrea acquosa, vomito
Bambini, anziani
tutte
Enteriti batteriche: patogeni emergenti
E.tarda
ospite comune di pesci, rettili, animali e uccelli marini e dell’acqua; implicata in varie forme diarroiche (diarrea acquosa). Fattori di rischio:assunzione di pesci o frutti di mare contaminati, l’esposizione ad acque di acquari, manipolazione di tartarughe domestiche.
Stipiti di
E.albertii
isolati da feci in bambini del Bangladesh con malattia diarroica. Studi filogenetici avrebbero inoltre dimostrato che Shigella boydii tipo 13 sia di fatto identificabile con E.albertii.Batteri del genere classificati come patogeni emergenti dalla International Commission on Microbial Specifications for Foods (
A . buzleri
). Acqua contaminata o di cibi crudi fonti più frequenti di infezione umana.Microrganismi a localizzazione prevalente in ambiente acquatico (acque dolci e marine); sono stati associati da tempo a quadri di gastroenterite (immunodepressi) e ad episodi di tossinfezione alimentare e a diarrea dei viaggiatori.
Sindromi diarroiche Plesiomonas-associate (
P.shigelloides
) in individui a che hanno ingerito pesce contaminato o sono stati esposti ad acque contaminate.B.fragilis
implicati in malattie diarroiche in bambini sotto i 5 anni, anche associati a diarrea infiammatoria in adulti.Arcobacter
Aeromonas
Plesiomonas
Bacteroides Edwardsiella
Escherichia
K.oxytoca .
Nel 2006 studi istopatologici su 6 pazienti con colite emorragica associata ad antibiotici (AAHC) avrebbero stabilito il ruolo di K.oxytoca quale agente eziologico di colite emorragica C.difficile negativa.Klebsiella
Virus Manifestazione clinica incubazione durata
Rotavirus principale causa di diarrea nei
bambini 1-3 giorni 5-8 giorni
Norovirus Infezioni in adulti e bambini Forme virali epidemiche
1-3 giorni 1-3 giorni
Adenovirus diarrha nei bambini 7-8 giorni 8-12 giorni
Astrovirus Infezioni principalmente in bambini
ed anziani 1-4 giorni 1-4 giorni
Gastroenteriti virali
• Responsabili fino a 3/4 di tutte le diarree infettive.
• La gastroenterite virale è la seconda più comune malattia virale dopo le infezioni del tratto respiratorio superiore.
• Nei paesi in via di sviluppo, la gastroenterite virale è uno dei principali killer di bambini denutriti .
Stime di mortalità annuale da Rotavirus (400.000) e Norovirus (250.000)
(Tate, Lancet Infect Dis, 2012; Patel, NEJM, 2011)
MAIN CAUSES:
• Rotaviruses
• Noroviruses
OTHERS:
• Adenoviruses F & G (40-41-52)
• Sapoviruses
• Astroviruses
• Torovirus
• Enteroviruses
(some Echo and Coxsackie A)
IN IMMUNOCOMPROMISED PATIENTS:
• HIV
• CMV, HSV, VZV
SUSPECTED:
• Bocavirus
• Saffold viruses
• Cosaviruses
• Saliviruses / Klasseviruses
• Aichi virus
• Parechoviruses
• Enteric Coronaviruses
• Polyomavirus MW
• Picobirnaviruses
• SRSV (Small Round Structured Viruses)
• SRV (Small Round Viruses)
• PMMV
Viruses associated with gastroenteritis
Distribution of Viral Etiologies of Acute Pediatric Diarrhea in Three Medical Centers in Taiwan From 2009 to 2011 (Chen C-J et al., Medicine, 2015) (sempl.)
Study Site, % Organism
Study Year, %
Any virus Rotavirus Norovirus Adenovirus Astrovirus Mixed virusesy
Mixed virus/bacteriaz
Tested Samples,
No.
Positive Samples,
No. (%) Site I,
N=1087 Site II,
N=772 Site III,
N=951 2009,
N=1003 2011,
N=854 2010,
N=953
y Coinfections with 2 viral agents were identified in 112 cases, including rotavirus and norovirus in 75 cases, rotavirus and adenovirus in 11 cases, rotavirus and astrovirus in 10 cases, norovirus and adenovirus in 13 cases, norovirus and astrovirus in 2 cases, and adenovirus and astrovirus in 1 case. Coinfections with 3 viral agents (norovirus, rotavirus, and astrovirus) were identified in 2 cases.
z The bacterial agents were identified as Salmonella spp. and/or Campylobacter spp. Other potential bacterial pathogens of enterocolitis (ie, Escherichia coli and Staphylococcus aureus) were not included for analysis.
2810 2809 2766 2810 2766 2810 2810
1055 (37.5) 596 (21.2) 412 (14.9) 105 (3.74) 58 (2.10) 114 (4.06) 83 (2.95)
38.6 21.4 14.8 3.86 2.72 3.86 3.13
37.2 23.8 13.3 3.11 1.84 4.53 4.15
36.7 18.8 16.3 4.10 1.60 3.89 1.79
42.0 21.8 17.8 4.62 2.10 4.09 3.57 36.0
20.6 14.6 3.49 1.90 4.59 3.09
34.4 21.2 11.9 3.04 2.34 3.40 2.11
La maggior parte dei casi di diarrea pediatrici che richiedono il ricovero in ospedale si sono verificati in bambini di età inferiore a 2 anni e rappresentano il 56,0% (591/1055) dei soggetti con gastroenterite virale.
Involvement of main diarrheagenic Escherichia coli, with emphasis on enteroaggregative E. coli, in severe non-epidemic pediatric diarrhea in a high-income country (Tobias et al. BMC Infectious Diseases, 2015)
Detection of enteric pathogens in stool specimens of diarrhea patients
No. specimens %
Negative to all tested pathogens 55 29.3
Rotavirus only 63 33.5
Salmonella only 3 1.6
Shigella only 12 6.4
Campylobacter only 7 3.7
ETEC only 0 0.0
EHEC only 1 0.5
EAEC only 7 3.7
Atypical EPEC only 9 4.8
Typical EPEC only 1 0.5
Co-infections
Rotavirus & Salmonella 3 1.6
Rotavirus & Campylobacter 4 2.1
Rotavirus & ETEC 2 1.1
Rotavirus & EAEC 9 4.8
Rotavirus & atypical EPEC 9 4.8
Shigella & EAEC 1 0.5
Campylobacter & EAEC 1 0.5
Campylobacter & atypical EPEC 1 0.5
Total DEC in both single and co-infections 41 21.8
Total samples tested 188 100.0
Caratterizzazione di E.coli diarreagenici (DEC) umani in campioni di feci ottenuti da bambini con meno di 5 anni di età, ricoverati per gastroenterite (Israele).
Campioni di feci testati mediante multiplex PCR (mPCR) per identificare EAEC, EHEC, EPEC ed ETEC. I campioni sono stati esaminati anche per la presenza di rotavirus, di Shigella, Salmonella e Campylobacter.
Cinquantanove (19%) dei bambini sono risultati positivi per DEC.
L'infezione da rotavirus e EAEC mista è stata caratterizzata da particolare gravità: probabilità di avere feci acquose/molli e giorni di malattia più severi è risultato significativamente aumentato tra i pazienti con co-infezione da rotavirus e EAEC
• Recenti indagini hanno dimostrato molti casi con > 1 patogeno identificato.
• Il paradigma di 1 patogeno e 1 malattia è stato messo in discussione con l'avvento di metodi microbiologici molecolari che hanno limiti di rilevamento più bassi.
• La presenza di più agenti patogeni può implicare una loro interazione che può aumentare o
diminuire la probabilità di infezione sintomatica.
Diarree infettive
Quali procedure
Percorso diagnostico
algoritmi diagnostici
Campione fecale
Ricerca di patogeni enterici
Multiplex PCR
Emocoltura
Sierodiagnosi
0 0 20 40 60 80
1a set 2a set 3a set 4a set
Emocoltura Widal
Esame microscopico
Esame colturale
Identificazione
Test immunologici
Test molecolari
Es. macroscopico delle feci (qualità, consistenza, colore, odore, presenza di muco e/o sangue): orientamento nel giudizio preanalitico di idoneità del campione e nelle procedure analitiche.
Diagnostica di laboratorio delle enteriti infettive:
fase pre-analitica
Ricerche microbiologiche Apparato gastro-intestinale
Libretto N° Cognome
Data
Reparto/Ente Data di nascita- età
Data di ricovero
Coprocoltura x Salmonella (screening) C1 Soggetto asintomatico/Controllo
diarrea C2
Coprocoltura in presenza di: diarrea acquosa C6
diarrea con sangue e/o muco C3
Ricerche particolari
Coprocoltura x Yersinia C4
Coprocoltura x Vibrio cholerae C5 Presenza di febbre
Coprocoltura x Candida C7 Trattamento antibiotico in corso
Coprocoltura x C.difficile C8 Trapiantato
Tampone rettale C9
Ricerca Rotavirus (test al lattice) T1 Asintomatico/controllo
Ricerca Adenovirus (test al lattice) T2 Diarrea
Ricerca C.difficile (test al lattice) T3 Febbre
Ricerca sangue occulto 1° campione
2° campione
3° campione
Esame chimico-fisico
Esame parassitologico Asintomatico/controllo
Diarrea
Febbre
Proveniente da ...
AZIENDA OSPEDALIERA “MAGGIORE DELLA CARITÀ” - NOVARA LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA
Ricerche microbiologiche : Apparato gastro-intestinale
Libretto N° Cognome
Data Nome
Reparto/Ente Sesso
Data ricovero Data di nascita- età
Ricerca di Salmonella (screening) Ricerca di Salmonella, Shigella,
Campylobacter Ricerca di Escherichia coli
(enteropatogeni) Ricerca di Yersinia
Ricerca di Vibrio cholerae Ricerca di Candida
Ricerca di Aeromonas - Plesiomonas Tampone rettale x Candida
Tampone rettale x Str.agalactiae (gravidanza)
Tampone rettale
Soggetto asintomatico/Controllo Presenza di:
diarrea
diarrea acquosa
diarrea con sangue e/o muco febbre
Trattamento antibiotico in corso Trapiantato
Si fa presente che una corretta esecuzione degli esami è subordinata all’impiego di contenitori idonei Per le modalità di raccolta ed invio dei campioni si fa riferimento alle indicazioni riportate sul manuale
“Laboratorio di Microbiologia e Virologia
Sommario sui metodi diagnostici disponibili in USA (da Humphries RM et al., CMR, 2015, sempl.; modif.) Microrganismo Caratteri colturali Metodi diagnostici di laboratori clinici
Coltura
Aeromonas spp.
Bacillus cereus * Campylobacter spp.
Clostridium difficile Clostridium perfringens * Edwardsiella tarda
Escherichia coli O157 Escherichia coli STEC Listeria monocytogenes * Salmonella spp.
Shigella spp.
Staphylococcus aureus * Yersinia enterocolitica Vibrio spp.
Beta emolisi su AS Beta emolisi su AS Colonia bianco-grigie Non applicabile
Non applicabile
Colonie lattosio non fermentanti con produzione di H2S su HE, MAC, XLD, SS
SMAC, colonie sorbitolo non fermentanti
MAC, colonie sorbitolo fermentanti (ecc.O157)
Beta emolisi su AS
Colonie lattosio non fermentanti con produzione di H2S su HE, MAC, XLD, SS
Colonie lattosio non fermentanti su HE, MAC, XLD, SS
Non applicabile
CIN, colonie a “occhio di bue”
TCBS, sucrosio fermentazione per V.cholerae; no sucrosio
fermentazione per V.parahaemolyticus
AS: agar sangue; HE: Hektoen enteric agar; MAC MacConkey agar; XLD: xylose-lysine-deoxycholate agar; SS Salmonella Shigella agar; CIN cefsulodin-Irgasan- novobiocin agar; TCBS thiosulfate-citrate-bile salt-sucrose agar; SMAC MAC con sorbitolo
Agar
cromogenico Antigeni NAAT
Segni clinici per la diagnosi
CLASSICA INNOVATIVA
* Alimenti e feci sottoposte ad indagini colturali per eventi epidemici
Campione fecale
Algoritmi diagnostici
Multiplex PCR Esame
colturale
Test immunologici
Test molecolari
Terreni selettivi
Terreni cromogenici
Aeromonas
Aeromonas selective agar
Campylobacter
Campylobacter selective agar
Salmonella Shigella
Salmonella/Shigella selective agar
Escherichia coli Clostridium difficile Yersinia enterocolitica Vibrio cholerae
Bacillus cereus
C.difficile selective agar (CCFA) Y.enterocolitica selective agar (CIN) V.cholerae selective
agar (TCBS)
B.cereus selective agar (PEMBA)
Clinical Laboratory Practices for the Isolation and Identification of Campylobacter in Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet)
Specimen Collection and Transport Methods Among All Laboratories That Reported On-site Testing for Campylobacter
Question (No. of Responses) No. (%) of Laboratories (N = 411)
Use of any transport medium (n = 345) YesNo
Transport medium used (n = 294)
Alpha Tec enteric transport medium Amies
Amies and another Cary-Blair
Cary-Blair and another Stuart
Stuart and Alpha Tec enteric medium Other
Mean time from medical provider to laboratory (n = 356)
≤23-4 5-67-8 9-1011-12 13-24 25-48
>48
3369
215 4162 8125 14
16572 3021 410 3713 4
(97.4) (2.6)
(0.7) (5.1) (1.4) (55.1) (27.6) (8.5) (0.3) (1.4)
(46.3) (20.2) (8.4) (5.9) (1.1) (2.8) (10.4) (3.7) (1.1)
Type of culture medium used for plating (n = 397) Campy blood agar plate
Campy blood agar plate and another Campy CVA
Campy CVA and another Campy CEFEX
Campy CEFEX and another Skirrow
CSMCCDA, CAT, and another Other
Method of creating microaerophilic environment (n = 400) Commercial gas packs
Commercial gas packs and anoxomat
BBL Campy Pouch and evacuation and replacement BBL CampyPak and candle jar
Mitsubishi CampyGen or otherc Evacuation and replacement Anoxomat
Candle jar
No microaerophilic environment used Other
2042 1506 12 516 110
3442 31 132 67 13
(51.4) (0.5) (37.8) (1.5) (0.3) (0.5) (1.3) (4.0) (0.3) (2.5)
(86.0) (0.5) (0.7) (0.3) (0.3) (8.0) (1.5) (1.7) (0.3) (0.8)
411 laboratori che eseguono ricerche per Campylobacter.
In tutto, ci sono stati 106 gli algoritmi di test tra i 214 laboratori con un profilo completo;
solo 16 laboratori sono stati pienamente aderenti alle linee
guida esistenti.
Procedure da adottare
Metodi colturali
Metodi immunologici
Metodi molecolari
AMCLI PERCORSI DIAGNOSTICI
Definizione di quale percorso utilizzare
Diarrea comunitaria Diarrea del
viaggiatore
Diarrea da tossinfezione
Diarrea nosocomiale Valutazione
clinico- anamnestica Segni/sintomi Viaggi/Terapie/
Malattie
Aspetto delle feci Modalità di attivazione di un
percorso
Diarrea in immunodepresso
Iter diagnostico e microrganismi da considerare
Salmonella Shigella
Campylobacter C.difficile Salmonella Shigella
Campylobacter STECVirus enterici
Salmonella Shigella
Campylobacter Arcobacter Protozoi C.difficile Salmonella Shigella
Campylobacter ……….
……….……….
A B C D E
XXXVIII CONGRESSO
NAZIONALE 2009
Diarrea del viaggiatore – Paziente ambulatoriale/non ricoverato
Diarrea acuta
Ricerca di:
Vibrio cholerae
: coltura; : immunodosaggio;: microscopico; : soggetti provenienti da aree endemico-epidemiche
Ricerca di:
Salmonella,Shigella Campylobacter E.coli shiga-like Yersinia enterocolitica
ingestione di:
acque contaminate, pesce crudo, ostriche
Ricerca di:
Aeromonas,Plesiomonas Vibrio spp. Ricerca di:
Protozoi,Elminti Cryptosporidium
Diarrea acquosa Feci
2010
AMCLI PERCORSI DIAGNOSTICI
B
Campione fecale
Terreno Selettivo
Identificazione Biochimica/
spettrometrica Conferma
sierologica
Antibiogramma Ricerca di:
Salmonella
Refertazione Multiplex
PCR
A B
A
-
+
Arricchimento
COLTURA
-
+
Terreno cromogenico 35°C
Tipizzazione
Emocoltura
Sierodiagnosi
0 0 20 40 60 80
1a set 2a set 3a set 4a set
Emocoltura Widal
2015
Organism Aeromonas
Campylobacter
E.tarda
P.shigelloides
Salmonella
Shigella
STEC
Vibrio
Yersinia
MALDI-TOF for the identification of enteric pathogens
Performance of MALDI-TOFa
Present in IVD and commercial RUO databases; performance not well documented
Excellent for genus and species identification; many species in RUO databases
Present in IVD and commercial RUO databases; performance not well documented
Present in commercial RUO databases;
performance not well documented Good identification to genus
Cannot distinguish from E.coli by use of IVD or commercial RUO databases Cannot distinguish STEC (or other pathotypes) from E. coli by use of IVD or commercial RUO databases
Present in IVD and commercial RUO databases; performance not well documented
Present in IVD and commercial RUO databases; performance not well documented
FDA-cleared organismsb
Biotyper, genus only; VitekMS, genus only
Vitek MS, C.jejuni, C.coli
Vitek MS only
No
Biotyper, genus only; VitekMS, genus only
No
No
VitekMS, V.cholerae, V.parahaemolyticus, V.vulnificus
Biotyper, Y.enterocolitica, Y.pseudotuberculosis;
VitekMS, Y.enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Y.frederikenii, Y.intermedia, Y.kristensenii
Notes
Preliminary data promising
FDA cleared for colonies grown on Campylosel and brucella blood agar; can not perform directly from mCCC
Performance better with MAC vs SSorHEagar; serotype- specific biomarkers have been identified
Shigella-specific biomarkers have been identified
E.coli pathotype-specific biomarkers have been identified
a: IVD, in vitro diagnostic device; RUO,research use only. b: FDA clearance a sof 7 March 2014.Check with manufacturer or FDA.org formostup-to-dateinformation.
Ricerca di:
Campylobacter
A
- +
EIA - IC B
C
+
2015
Refertazione
Campione fecale
Terreno Selettivo
Identificazione Biochimica/
spettrometrica Microaerofilia
Conferma microscopica
Antibiogramma
Terreno Non selettivo 42°C
Microaerofilia 35°C
Membrana filtrante
A
B C
+
Arricchimento
COLTURA
-
Multiplex ArrayPCR
A
- +
A
+
A: test EIA in parallelo al saggio colturale, con refertazione a prescindere dal risultato colturale
B: test EIA in parallelo al saggio colturale, con verifica, nei casi discordanti (EIA positivi, coltura negativi)
C : test EIA come screening iniziale, seguito, in caso di positività, da una conferma colturale.
Bacterial Enteric Infections Detected by Culture-Independent Diagnostic Tests (Iwamoto M., et al, FoodNet, United States, 2012–2014)
Number of culture-confirmed cases and positive culture-independent diagnostic test (CIDT) reports (N = 38,666), by selected pathogens and culture results — FoodNet, United States, 2012–2013
Total culture- confirmed infections and positive CIDT
reports CIDT-positive
and no culture CIDT-positive and
culture-negative CIDT-positive and
culture-positive
Positive CIDT reports
Culture-positive only
Pathogen No. (%) No. (%) No. (%) No. (%) No.
Abbreviation: STEC = Shiga-toxin–producingEscherichia coli.
* Excludes 274 Shiga toxin–positive reports from clinical laboratories that were Shiga toxin–negative at a public health laboratory.
† Excludes 53 positive reports of detection of O157 antigen without testing for Shiga toxin.
Campylobacter 12,894 (83.8) 539 (3.5) 1,099 (7.1) 859 (5.6) 15,391
Salmonella 15,034 (98.0) 115 (0.7) 8 (0.1) 185 (1.2) 15,342
Shigella 4,312 (91.8) 160 (3.4) 27 (0.6) 197 (4.2) 4,696
STEC*† 34 (1.4) 2,205 (90.3) 110 (4.5) 94 (3.8) 2,443
Vibrio 446 (98.0) 0 — 5 (1.1) 4 (0.9) 455
Yersinia 332 (98.0) 0 — 2 (0.6) 5 (1.4) 339
Total 33,052 (85.5) 3,019 (7.8) 1,251 (3.2) 1,344 (3.5) 38,666
Tra le 5.614 segnalazioni CIDT positive, 2.595 (46%) non sono state confermate dalla coltura.
Incidence of culture-confirmed bacterial infections and positive CIDT reports, by selected pathogen — FoodNet, United States, 2012–2013
Abbreviations:
CIDT = culture- independent diagnostic test;
STEC: Shiga toxin–producingEscherichia coli.
Alternate Text: The figure above is a bar chart showing incidence of culture-confirmed bacterial infections and positive culture- independent diagnostic test (CIDT) reports, by selected pathogen in the United States during 2012-2013.
2.4 14.1
2.1 16.0
La percentuale di laboratori clinici che
utilizzano un CIDT è aumentato da meno
del 3% nel 2004 al 15% nel 2014
Statistical analyses of the Premier CAMPY, ProSpectT Campylobacter, and STAT! CAMPY EIA methods using culture as the reference method
Comparison of Premier CAMPY Enzyme Immunoassay (EIA), ProSpecT Campylobacter EIA, and ImmunoCard STAT! CAMPY Tests with Culture for Laboratory Diagnosis
of Campylobacter Enteric Infections (Granato et al., JCM, 2010)
Assay
Meridian EIA Remel EIA
Meridian STAT!
Negative specimens
Positive specimens Predictive value (%)
Sensitivity (%) No. positive by
test/culture No. negative by
test/culture Specificity (%) Positive Negative 126/127
126/127 125/127
99.2 99.2 98.4
344/358 343/358 163/173
96.1 95.8 94.2
90.0 89.4 92.6
99.7 99.7 98.8
Assay
Meridian EIA Remel EIA
Meridian STAT!
Negative specimens
Positive specimens Predictive value (%)
Sensitivity (%) No. positive by
test/PCR No. negative by
test/PCR Specificity (%) Positive Negative 134/135
134/135 132/134
Statistical analyses of the Premier CAMPY, ProSpecT Campylobacter, and STAT! CAMPY EIA methods following real-time PCR arbitration of discordant results
99.3 99.3 98.5
344/350 343/350 163/166
98.3 98.0 98.2
95.7 95.0 97.8
99.7 99.7 98.8
Con la PCR come standard di riferimento, la coltura rilevava 127 di 135 campioni positivi per Campylobacter, con sensibilità di 94.1%.
I risultati mostrano che i 3 EIAs valutati forniscono una rapida ed affidabile alternativa per la diagnosi di laboratorio e che la coltura convenzionale non può ancora a lungo essere considerata il
"gold standard" per la diagnosi.
Performance characteristics of stool antigen tests for detection of C. jejuni and C. coli using culture (CVA agar and mCCDA) and study case definition as the reference methodsa
Multicenter Evaluation of Clinical Diagnostic Methods for Detection and Isolation of Campylobacter spp. from Stool (Fitzgerald C. et al., JCM, 2016)
85.4 (77.4–92.8) 87.6 (80.1–94.4) 79.8 (69.9–87.6) 79.6 (69.6–87.4)
97.4 (96.7–97.9) 97.6 (96.9–98.2) 95.9 (95.1–96.7) 99.5 (99.1–99.7)
53.5 (44.9–61.9) 56.9 (48.2–65.3) 41.3 (33.8–49.0) 84.3 (74.7–91.3)
99.5 (99.2–99.8) 99.6 (99.2–99.8) 99.3 (98.8–99.6) 99.3 (98.9–99.6) Premier Campy
ProSpecT Campylobacter ImmunoCard Stat!
Xpect Campy
Negative Case definition
% sensitivity
(95% CIb) % specificity (95% CI)
% predictive value (95% CI) Positive
Reference method
95 campioni (3,4%) corrispondevano alla definizione di caso; 86 sono risultati positivi da terreno di coltura selettivo, e 9 erano coltura negativa ma positiva in almeno un CIDT fecale e PCR (nove risultati falsi negativi dalla coltura).
Gli altri 196 campioni coltura-negativi, CIDT-positivi (67 [Premier], 61 [Prospect], 101 [ICS] e 16 [Xpect]) erano PCR negativi e venivano ritenuti falsi positivi
Data la relativa bassa incidenza di malattia da Campylobacter e le limitate performance dei test
diagnostici, lo studio mette in discussione l'uso di test CIDT antigenici sulle feci disponibili in commercio
come test standalone per il rilevamento diretto di Campylobacter nelle feci.
Campione fecale
CT-SMACSMAC
Identificazione
Biochimica Conferma
sierologica
Antibiogramma Ricerca di:
E.coli shiga-like (STEC)
Refertazione
Multiplex MicroarrayPCR
A
+
Arricchimento
COLTURA
- CHROM O157
CHROM STEC 35°C
EIA - IC B
Arricchimento
A
B
Stx 1PCR
2015
The STEC diagnostic algorithm consists of both molecular and conventional methods; when stx genes are detected with direct qPCR, the stool sample is enriched
(de Boer R.F. et al. J. Clin. Microbiol. 2015)
Proposed molecular approach for the presumptive categorization of STEC based on enriched BGB PCR results (de Boer R., JCM, 2015) Additional genes
aa escV gene, marker for presence of the LEE PAI; aggR and/or aat gene, markers for the presence of the pAA plasmid carried by EAEC; NA, not applicable.
Direct PCR stx genes Present Yes
Yes
Yes
Yes
Enriched BGB PCR stx genes present
Yes
Yes
Yes
No
Additional genes
aescV positive or aggR and/or aat positive
escV positive or aggR and/or aat positive escV negative and aggR and/or aat negative NA
Serogroup(s)
O26, O103, O104, O111, O121, O145, O157
Any other serogroup Any serogroup
NA
Potential risk
PT group I
II
III
IV
Diarrhea High
High
Moderate
NA
HUS/HC High
Moderate
Low
NA
• Stanno aumentando i ceppi STEC riconosciuti agenti di gastroenterite sporadica e epidemica in tutto il mondo.
• >150 sierotipi non-O157 STEC sono stati segnalati come agenti sia di malattia sporadica che epidemica.
• Le infezioni STEC sono associate allo sviluppo della sindrome emolitico uremica (HUS) nel 2%/>
10% degli individui infetti
• Sia ceppi O157 che non-O157 STEC sono associati a casi di HUS.
• Un sistema EIA per lo screening iniziale seguito da tempestiva successiva coltura di campioni EIA- positivi può essere una valida alternativa alla coltura e rilevamento tossinico simultanei
• Nessuno dei criteri (sangue, età) per determinare quali campioni di feci possano ricevere coltura selettiva e test antigenico per STEC hanno una sensibilità elevata accettabile.
• La bassa prevalenza in molti stati americani non giustifica l’impiego di test EIA affiancati alla coltura.
• Il rapporto costo/beneficio non giustifica l’impiego di test EIA affiancati alla coltura.
• La diagnosi di HUS è fatta su base clinica: un risultato positivo per STEC è di supporto ma non è indispensabile per la valutazione iniziale e il trattamento di un paziente.
• In zone a bassa prevalenza il valore predittivo positivo per il saggio immunologico STEC è ~ del 50%.
• Vi è possibilità che un risultato falso positivo
possa portare ad indagini inappropriate e
costose o a problematici interventi di gestione
del paziente.
SAGGI MOLECOLARI MULTIPLEX
RILEVAMENTO SINDROMICO DEI PATOGENI GASTROINTESTINALI
SAGGI MOLECOLARI MULTIPLI PER CLASSE PATOGENI
AeromonasCampylobacter Clostridium difficile Clostridium perfringens EAECEPEC
ETECSTEC
E.coli O157
Listeria monocytogenes Plesiomonas shigelloides Salmonella
Shigella Vibrio
Vibrio cholerae
Yersinia enterocolitica
Adenovirus
Astrovirus Enterovirus Norovirus Rotavirus Sapovirus
Cryptosporidium
Blastocystis hominis Dientamoeba fragilis Cyclospora cayetanensis Entamoeba histolytica Giardia lamblia
(Zhang H., Clin Lab Med, 2016)
Yes Yes YesNo No Yes
Yes
No
No
No
No
No
No
No
No
Commercial Multiplex assays available for syndromic identification of gastroenteritis causing agents
Luminex - xTAG GPP BioFire – FilmArray GI
BD MAX - Enteric bacterialPanel BD MAX – Enteric Virus
BD MAX – Enteric Parasite Nanosphere - VerigeneEnteric Pathogen
Hologic (Gen-Probe) -ProGastro SSCS
PathoFinder - GastrofinderSmart 17 Fast
r-Biopharm - Rida Gene -Hospital stool (HS), BacterialStool (BS) Viral Stool (VS),Parasitic Stool (PS)
Seegene - SeeplexDiarrheaACE - Viral (V), Bacterial 1(B1) and 2 (B2) Serosep - EntericBio GastroPanel 1 (P1) and 2 (P2)
Fast-Track Diagnostics - FTDStool Parasites (P), EPA,Bacterial (B), Viral (V)
Diagenode- G-DiaBact (B),G- DiaNota (V), G-Diapara (P) Genetic Signatures -EasyScreen Enteric Bacteria(B), Viral (V), Protozoan (P)
AusDiagnostics - FaecalBacteria (B), GI Parasites (P)
Genomica - CLARTEnteroBac
5 1 44 4 2
4
5
2
9-10
6
4
5
3
5 Number
Pathogens Detected
Multiplex endpoint RT-PCR,Hybridization Multiplex RT-PCR, melt analysis
Microfluidic real-time PCR
Microarray
MultiplexRealtime PCR
Multiplex RT-PCR,
ligation probe melt analysis
MultiplexRealtime PCR
Multiplex PCR,
capillary electrophoresis
Multiplex Real time PCR, RT-PCR
Multiplex Real time PCR, RT-PCR
Multiplex Real time PCR, RT-PCR
Multiplex PCR, microarray
Specialized equipment Required
High Low Low
Low
Medium
High
Medium
High
Medium
Medium Medium
Low High Yes
No NoNo No No
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Manufacture – Test Name US-IVD CE-IVD
Yes No YesYes Yes Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
No
No
No
No
No
14 22 43 3 8
4
17
HS=3BS=3 VS=4PS=4
V=4B1=5 B2=5
P=3EPA=3 B=6V=5 B=2V=3 P=3B=9 V=8P=5
B=5P=4
7
Time to Result
(hours) Sample
pre-processing Technology
Yes Yes Yes
Yes
No
No
No
No
No
No
No
Yes
Yes
Complexity
(Zhang H., Clin Lab Med, 2016)
Spectrum of enteropathogens detected by the FilmArray GI Panel in a multicentre study of community-acquired gastroenteritis (Spina, A. et al., CMI, 2015)
Proportion of positive samples and pathogens per sample by country (Austria, Finland, France, Germany, Greece, Ireland, Italy, Portugal, Romania, and the UK; overall positivity rate = 384/709; 54.2%).
Lo studio multicentrico
europeo di prevalenza di
diarrea acquisita in comunità
(EUCODI)
Frequency distribution of pathogens detected in 709 stool samples by diagnostic approach employed: local laboratory protocol vs. FilmArray GI Panel.
EAEC, enteroaggregative Escherichia coli; EIEC, enteroinvasive Escherichia coli; EPEC, enteropathogenic Escherichia coli; ETEC, enterotoxigenicEscherichia coli; STEC, Shiga toxin-producingEscherichia coli.
(Spina, A. et al., CMI, 2015)
Nel complesso, il FilmArray GI Panel ha rilevato almeno un microrganismo nel 54,2% (384/709) dei campioni, rispetto al 18,1% (128/709) quando i test sono stati eseguiti con tecniche convenzionali.
Dei 709 campioni ricevuti, 325 (45,8%) sono risultati negativi, 268 (37,8%) sono risultati positivi per un solo organismo, e 116 (16,4%) per più organismi.
Ampio spettro di possibili patogeni enterici in pazienti con gastroenterite acquisita in comunità (ad eccezione di E. histolytica e V.cholerae , tutti i 22 potenziali patogeni sono stati rilevati).
• Lo studio EUCODI conferma che Rotavirus e Salmonella non sono più i principali patogeni GI virali e batterici in Europa.
• Norovirus è stato identificato quale principale causa di gastroenterite acuta acquisita in comunità in Europa; il risultato concorda con la situazione negli Stati Uniti
•I risultati confermano l'ipotesi che la presenza di più agenti patogeni in campioni di feci diarroiche è sottovalutato dai test di routine correnti (quale rilevanza clinica ?).
• Considerando l'importanza di C.difficile tossigenico, i laboratori dovrebbero valutare la necessità di analisi di routine per C.difficile tossigenico da pazienti con diarrea acquisita in comunità.
• EPEC o EAEC presenti in 98 di 116 (84%) campioni EUCODI con rilevamento multiplo di microrganismi: alto tasso di EPEC nelle feci dei pazienti, ma anche nei controlli.
I risultati dello studio EUCODI
Conclusioni: lo screening multiplex è in grado di ottimizzare il rendimento di esami
su campioni di feci, può migliorare notevolmente la tempestività della diagnosi, e
può facilitare il confronto dei risultati tra i diversi Paesi.
EPEC; 6; 46%
STEC; 1; 8%
Giardia; 1; 8%
Campylobacte;
2; 15%
C.difficile; 1;
8%
Rotavirus; 2;
15%
Single infections 13/13 (100%) Classical techniques Positive 13/54 (23%)
Single infections 24/54 (61%)
Molecular techniques Positive 39/54 (72%) 23 vs. 72 %
STEC; 2; 8%
Norovirus; 5;
21%
Astrovirus; 1;
4%
C.difficile; 1;
4%
Salmonella; 1;
4%
Campylobacter;
7; 29%
EPEC; 7; 30%
Norovirus-EPEC;
4; 26%
Norovirus- Campylobacter;
4; 26%
Rotavirus-EPEC;
1; 7%
EPEC- Campylobacter;
2; 13%
Giardia- Campylobacter;
1; 7%
Cryptosporidium- EPEC; 1; 7%
Rotavirus- Norovirus; 1; 7%
STEC- Campylobacter;
1; 7%
Mixed infections 15/54 (39%) Comparison of enteric pathogens detection in adult kidney transplant recipients by classical microbiological
techniques and the multiplex PCR assays (Coste J-F et al., JCM, 2013)
Determination of cut-off cycle threshold values in routine RT–PCR assays to assist differential diagnosis of norovirus in children hospitalized for acute gastroenteritis (Trang N.V., Epidemiol. Infect.,2015)
Modelli sui valori di ciclo soglia (Ct) e sulla distribuzione e l'identificazione dei valori di cut- off. Il numero di campioni con Ct <40 era di 346 ed è rappresentato dagli istogrammi grigi.
Utilizzo di Real-time RT-PCR per rilevare e quantificare NV-RNA in campioni clinici.
Osservata una distribuzione bimodale dei valori del ciclo soglia (Ct) in cui il picco più basso si è supposto rappresentare casi in cui NV era agente causale di diarrea (picco più alto = casi con patogeno alternativo).
Su questa base, abbiamo applicato un modello di miscele simulate per stimare una soglia di Ct<21.36 per distinguere i pazienti per i quali NV è da ritenere probabile causa di diarrea.
L'uso di un adeguato valore di cut-off
per l'interpretazione dei risultati di NV
real time RT-PCR può migliorare la
diagnosi differenziale delle infezioni
enteriche.
(Stockmann C. et al, CMI, 2015)
How well does physician selection of microbiologic tests identify Clostridium difficile and other pathogens in paediatric diarrhoea? Insights using multiplex PCR-based detection
Clostridium difficile e altri enteropatogeni rilevati da campioni di feci pediatriche mediante metodi di laboratorio tradizionali e mediante multiplex molecolare, gastrointestinale.
Un potenziale agente eziologico è stato identificato nel 46% dei campioni di feci con i metodi standard di laboratorio e nel 65% dei campioni analizzati utilizzando il Pannello di GI multiplex.
Il co-rilevamento di diversi patogeni diarroici è
aumentata dal 2% al 20%.
(Stockmann C. et al, CMI, 2015)
Patterns di richieste cliniche e loro impatto sul rilevamento di patogeni enterici in campioni di feci pediatriche
Per pazienti per i quali era stato richiesto solo C.difficile, è stato individuato un patogeno alternativo nel 29% dei casi con FilmArray. In particolare, sono stati identificati 11 (12%) casi di norovirus.
Tra coloro per i quali era stato richiesto C. difficile in combinazione con altri test, un patogeno aggiuntivo è stato identificato nel 57% dei campioni di feci con FilmArray.
Per i pazienti che non avevano eseguito test per C.
difficile, FilmArray ha identificato un patogeno nel 63% dei casi, tra cui C.difficile in 8%.
Screening
Sospensione fecale
Giardia Cryptosporidium
Entamoeba Dientamoeba
Estrazione
Salmonella
Norovirus Rotavirus Adenovirus Multiplex PCR
Identificazione fenotipica Isolamento
Conferma sierologica (sierogruppo)
Antibiogramma Shigella
Campylobacter E.coli STEC
Yersinia Vibrio
C.difficile tossinogenico Positivo
Enteric Array
Ascaris Trichuris Cyclospora
E.coli EPEC Astrovirus
Sapovirus
Blastocystis Tenia Strongiloides
E.coli EIEC E.coli EAggEC Aeromonas
Screening Screening
• Cause infettive di gastroenteriti ampie e diversificate: agenti batterici, virali o fungini.
• Sintomi sono raramente agente specifici.
•Riduzione dei tempi di risposta (TAT)
•Riduzione dei tempi di intervento terapeutico
•Riduzione delle terapie empiriche
•Riduzione dei costi terapeutici (terapie antibiotiche improprie; effetti collaterali di antibiotici )
•Riduzione delle degenze ospedaliere
•L'attuazione delle misure di controllo (cohorting dei pazienti, l'uso o non uso delle precauzioni di isolamento)
•Pannelli PCR multiplex sindromici permettono decisioni tempestive circa il ricovero in ospedale, il trattamento, il controllo delle infezioni.
• Il loro uso ha il potenziale per ridurre i costi di assistenza sanitaria
•la rapidità dei risultati è estremamente soddisfacente sia per i pazienti sia per fornitori di servizi sanitari.
•Pannelli Multiplex devono essere i test di prima linea da utilizzate per tutti i pazienti con una sindrome o limitati a specifiche categorie di pazienti.
•Quali agenti patogeni vanno inclusi in questi pannelli (la composizione dei pannelli è determinato dai produttori).
•I pannelli commerciali sono piuttosto costosi per il paziente, così come per il laboratorio.
•La combinazione di agenti patogeni in un pannello può risultare disomogenea da un punto di vista clinico od epidemiologico
•Test per alcuni patogeni dovrebbe essere guidata da fattori di rischio (esposizione ad agenti antimicrobici, ricovero ospedaliero, origine alimentare)
•risultati negativi per i patogeni comuni dovrebbero precedere test per gli agenti patogeni non comuni (prevalenza di enteropatogeni).
