INDICE
RIASSUNTO I
ABSTRACT III
1. LA REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA 1 1.1 Promotore e sequenze regolatrici 3
1.1.a IL PROMOTORE 6
- Caratteristiche conservate del promotore prossimale - Caratteristiche del sito di inizio della trascrizione (TSS) - Striscie di pirimidine (Y-Patch)
- TATA box
- REG (Regulatory Elements Group) - Isole CpG
1.2 Sequenze regolatrici dell’estremità 3’ del gene:
segnali di Poliadenilazione 15
- Degradazione rapida del mRNA
- Meccanismi di poliadenilazione citoplasmatica 2. PROTEINE CHE LEGANO LA SEQUENZA CCAAT: IL FATTORE
NUCLEARE NF-Y 24
2.1 Il motivo di ripiegamento istonico 26 2.2 Interazioni con altri fattori proteici associati alla
Cromatina 29
2.3 Modalità d’azione di NF-Y 30
2.4 Regolazione del fattore NF-Y 33 2.5 Regolazione post trascrizionale 33
2.6 Regolazione della localizzazione nucleare 34 - “Splicing” Alternativo
2.7 Regolazione nelle piante 34
2.8 Le proteine LEAFY COTYLEDON1 e LEAFY COTYLEDON1- LIKE sono subunità altamente specializzate del fattore
NF-Y 35
3. EMBRIOGENESI
3.1 EMBRIOGENESI ZIGOTICA 37
3.1.a Ciclo ontogenetico e differenziazione del
gametofito femminile 37
3.1.b Fecondazione e sviluppo dell’embrione 39 3.1.c Regolazione genica ed embriogenesi zigotica 42
- I geni LEAFY COTYLEDON (LEC) sono regolatori centrali dell’embriogenesi
3.1.d Embriogenesi zigotica in girasole: alcune
Peculiarità 50
3.2 EMBRIOGENESI SOMATICA 51
3.2.a Aspetti generali e ruolo degli ormoni 51 3.2.b Espressione genica ed embriogenesi somatica 55 3.3 ANALOGIE E DIFFERENZE TRA EMBRIOGENESI ZIGOTICA E
SOMATICA 58
4. MATERIALI E METODI 65
4.1 Caratteristiche della Libreria Genomica 65
4.2 Preparazione sonda 65
- Marcatura della sonda
- Lavaggi ed esposizione dei filtri
4.3 PCR per verifica dei cloni scelti della libreria 70
4.4 Estrazione dell’RNA 71
4.5 Corsa elettroforetica su gel di agarosio in condizioni
Denaturanti 73
4.6 RT-PCR semiquantitativa 74
4.7 Scelta degli oligonucleotidi per la β-actina 74 - Retrotrascrizione
- Amplificazione del cDNA mediante PCR - Corsa elettroforetica su gel di Agarosio
4.8 CLONAGGIO 79
- LIGATION - Inserzione dell’amplificato nel DNA plasmidico
- Trasformazione delle cellule - Selezione dei cloni
4.9 Estrazione del DNA plasmidico 82 4.10 Sequenziamento del DNA plasmidico 83 4.11 Isolamento gene WUSCHEL di H. annuus 83
4.12 5’ RAGE 85
- Digestione - Purificazione
- Legame degli adattatori - Amplificazioni
4.13 RACE 3’ 89
4.14 RACE 5’ 89
- Sintesi del cDNA
- Purificazione del cDNA
- Amplificazione del cDNA
5. RISULTATI 96
5.1 Analisi della regione 5’ del gene HaL1L 102
5.2 Cis-acting sequence 104
5.3 Analisi della regione al 3’ del gene HaL1L 125 5.4 Espressione del gene HaL1L in H. annuus 125 5.5 Sequenza nucleotidica del fattore WUS in H. annus 128
6. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI 133
