Osservazione Osservazione
Microscopio ottico: le lenti mettono a fuoco un raggio di luce (raggio
fotonico)
Componenti del
microscopio ottico: stativo Componenti del
microscopio ottico: stativo
Stativo:
1: revolver portaobiettivi 2: piede
3: tavolino porta oggetto 4: oculari
5: vite di messa a fuoco
6: diaframma di apertura 7: diaframma di campo
6 1
3 4
2 5
7 9
Componenti del
microscopio ottico:
apparato di illuminazione Componenti del
microscopio ottico:
apparato di illuminazione
Apparato di illuminazione:
8: sorgente luminosa 9: condensatore con
diaframma
9
8 9
Ingrandimento finale del MO
Ingrandimento finale del MO
Ingrandimento dell’obiettivo X
Ingrandimento dell’oculare
Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)
Microscopio elettronico a trasmissione
(TEM)
Microscopio elettronico: le lenti mettono a fuoco un fascio di elettroni. Dato che la lunghezza d’onda di un fascio di elettroni è molto più corta di quella di un fascio di luce
visibile, si possono osservare due punti separati da una distanza di 0.005 nm (maggiore potere di risoluzione del TEM
rispetto al MO)
Microscopio elettronico
Microscopio elettronico
Strumenti per l’analisi submicroscopica Strumenti per l’analisi submicroscopica
Le fasi di preparazione sono le stesse del MO
Strumenti per l’analisi submicroscopica Strumenti per l’analisi submicroscopica
FISSAZIONE
(es. glutaraldeide, paraformaldeide, tetrossido di osmio)
che permettono la formazione di legami trasversali (molto specifici) delle
componenti proteiche.
Non solo preservano i dettagli strutturali, ma agiscono anche da coloranti elettron-densi che permettono l’osservazione del tessuto,
quando è attraversato da un fascio di elettroni
Strumenti per l’analisi submicroscopica Strumenti per l’analisi submicroscopica
FISSAZIONE
i fissativi penetrano nel tessuto in maniera più lenta di quelli utilizzati per il MO,
pertanto si utilizzano pezzi piccoli in grandi volumi di fissativo
Fissazione chimica Fissazione chimica
Fra le aldeidi la glutaraldeide ha una minore capacità di penetrazione ma reticola meglio le proteine formando così legami più stabili. Da dei cross legami resistenti. Necessita di campioni di piccole dimensioni e di un uso combinato con la formaldeide.
Fissazione chimica Fissazione chimica
Il tetrossido di osmio, impropriamente detto acido osmico, è un ottimo fissativo per i lipidi mentre non reagisce con gli acidi nucleici e con i glucidi. Ha costi elevati ma è il miglior fissativo per indagini ultrastrutturali. E’ volatile.
Strumenti per l’analisi submicroscopica Strumenti per l’analisi submicroscopica
INCLUSIONE
vengono utilizzati materiali speciali
es. resine epossidiche
PREPARATI INCLUSI:
l’infiltrazione e l’inclusione PREPARATI INCLUSI:
l’infiltrazione e l’inclusione
Nel caso di resine plastiche termoindurenti catalizzate il tessuto entro la massa fluida verrà posto per tempi e temperature variabili a polimerizzarsi in stufe.
PREPARATI INCLUSI:
l’infiltrazione e l’inclusione PREPARATI INCLUSI:
l’infiltrazione e l’inclusione
Nel caso di resine idrofilliche usate per l’inclusione di pezzi da destinarsi alla microscopia elettronica per indagini immunocitochimiche i procedimenti di indurimento si effettueranno a basse temperature con o senza l’ausilio di catalisi a raggi UV.
Strumenti per l’analisi submicroscopica Strumenti per l’analisi submicroscopica
ultramicrotomo
SEZIONAMENTO
Strumenti per l’analisi submicroscopica Strumenti per l’analisi submicroscopica
SEZIONAMENTO
il tessuto incluso può essere tagliato in sottilissime sezioni (25-100 nm)
Strumenti per l’analisi submicroscopica Strumenti per l’analisi submicroscopica
ultramicrotomo
SEZIONAMENTO
PREPARATI INCLUSI:
l’ultramicrotomo
PREPARATI INCLUSI:
l’ultramicrotomo
Per l’osservazione ultrastrutturale i campioni inclusi in resine epossiche o acriliche dovranno essere sezionati con un ultramicrotomo a spessori variabili dai 20 ai 200 nm. Esso è dotato di uno stereomicroscopio per ingrandire opportunamente i preparati da sezionare che sono normalmente assai piccoli.
Sezionamento Sezionamento
per le sezioni in resine plastiche si usano lame in diamante o cristallo
PREPARATI INCLUSI:
l’ultramicrotomo e le lame PREPARATI INCLUSI:
l’ultramicrotomo e le lame
Le sezioni ultrafini ottenute con gli ultramicrotomi non possono essere maneggiate per la loro estrema fragilità e per le ridotte dimensioni; inoltre non possono essere poste su un supporto di vetro che arresterebbe il fascio elettronico. La sezione è ottenuta sfruttando il filo di una lama di cristallo o diamante che seziona il campione contenuto in una dura resina acrilica o epossidica.
PREPARATI INCLUSI:
il knifemaker
PREPARATI INCLUSI:
il knifemaker
La preparazione delle lame di vetro richiede l’utilizzo del knifemaker, un particolare “taglialame” che consente di ottenere lame con inclinazioni strettamente legate al tipo di tessuto da trattare.
PREPARATI INCLUSI:
la raccolta delle sezioni PREPARATI INCLUSI:
la raccolta delle sezioni
Le sezioni sono raccolte in una vaschetta adesa o parte integrante della lama e colma d’acqua. Sul liquido galleggerà la fettina (o un nastro di fettine) dopo essere stata tagliata e prima di essere raccolta su retine metalliche.
PREPARATI INCLUSI:
l’ultracriomicrotomo e le grids PREPARATI INCLUSI:
l’ultracriomicrotomo e le grids
Le retine metalliche o grids possono essere di rame o, in caso di indagini immunocitochimiche, di nickel o oro. La loro forma e la compattezza delle bar varia a seconda del tipo di osservazione e si misura in mesch.
Strumenti per l’analisi submicroscopica Strumenti per l’analisi submicroscopica
OSSERVAZIONE
Il fascio di elettroni viene indirizzato sul campione.
Gli elettroni attraversando il tessuto
(colorato con metalli pesanti) perdono parte della loro energia.
Gli elettroni vengono quindi convogliati su una piastra e la loro energia si converte in punti di luce la cui intensità è proporzionale
all’energia cinetica degli elettroni.
Mettendo una pellicola sensibile agli
elettroni si ottiene un negativo (stampa in bianco e nero dell’immagine)
Strumenti per l’analisi submicroscopica Strumenti per l’analisi submicroscopica
OSSERVAZIONE
Microscopio elettronico a scansione (SEM)
Microscopio elettronico a scansione (SEM)
Serve a visualizzare la parte superficiale di un campione solido (fornisce una
immagine tridimensionale)
Microscopio elettronico a scansione (SEM)
Microscopio elettronico a scansione (SEM)
Il campione deve essere preparato in modo da permettere la formazione sulla
superficie di uno strato sottile di metalli pesanti (es. oro, palladio)
Gli elettroni vengono convogliati sul
campione e saranno in parte riflessi e in parte respinti.
Ambedue i tipi di elettroni vengono catturati ed un sistema di analisi
particolare li elabora riproducendo su di un monitor una struttura tridimensionale
Microscopio elettronico a scansione (SEM)
Microscopio elettronico a scansione
(SEM)
Tecniche di congelamento- frattura Tecniche di congelamento- frattura
Campioni sottoposti a congelamento veloce (non si formano cristalli di ghiaccio) non
subiscono alterazioni meccaniche.
Quando l’oggetto congelato viene colpito da una lama super-congelata, la sua frattura
avviene secondo piani preferenziali (di solito tra le membrane)
La superficie fratturata viene stratificata con platino e carbonio che da origine ad
una replica della superficie.
Il tessuto viene digerito (allontanato) e la replica viene esaminata al ME
Freeze fracture Freeze fracture
Nucleo scalzato dalla sede
Nucleo in situ
