Microscopio ottico: le lenti mettono a fuoco un raggio di luce (raggio fotonico)

Testo completo

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Osservazione Osservazione

Microscopio ottico: le lenti mettono a fuoco un raggio di luce (raggio

fotonico)

(2)

Componenti del

microscopio ottico: stativo Componenti del

microscopio ottico: stativo

Stativo:

1: revolver portaobiettivi 2: piede

3: tavolino porta oggetto 4: oculari

5: vite di messa a fuoco

6: diaframma di apertura 7: diaframma di campo

6 1

3 4

2 5

7 9

(3)

Componenti del

microscopio ottico:

apparato di illuminazione Componenti del

microscopio ottico:

apparato di illuminazione

Apparato di illuminazione:

8: sorgente luminosa 9: condensatore con

diaframma

9

8 9

(4)

Ingrandimento finale del MO

Ingrandimento finale del MO

Ingrandimento dell’obiettivo X

Ingrandimento dell’oculare

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Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)

Microscopio elettronico a trasmissione

(TEM)

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Microscopio elettronico: le lenti mettono a fuoco un fascio di elettroni. Dato che la lunghezza d’onda di un fascio di elettroni è molto più corta di quella di un fascio di luce

visibile, si possono osservare due punti separati da una distanza di 0.005 nm (maggiore potere di risoluzione del TEM

rispetto al MO)

Microscopio elettronico

Microscopio elettronico

(7)

Strumenti per l’analisi submicroscopica Strumenti per l’analisi submicroscopica

Le fasi di preparazione sono le stesse del MO

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Strumenti per l’analisi submicroscopica Strumenti per l’analisi submicroscopica

FISSAZIONE

(es. glutaraldeide, paraformaldeide, tetrossido di osmio)

che permettono la formazione di legami trasversali (molto specifici) delle

componenti proteiche.

Non solo preservano i dettagli strutturali, ma agiscono anche da coloranti elettron-densi che permettono l’osservazione del tessuto,

quando è attraversato da un fascio di elettroni

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Strumenti per l’analisi submicroscopica Strumenti per l’analisi submicroscopica

FISSAZIONE

i fissativi penetrano nel tessuto in maniera più lenta di quelli utilizzati per il MO,

pertanto si utilizzano pezzi piccoli in grandi volumi di fissativo

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Fissazione chimica Fissazione chimica

Fra le aldeidi la glutaraldeide ha una minore capacità di penetrazione ma reticola meglio le proteine formando così legami più stabili. Da dei cross legami resistenti. Necessita di campioni di piccole dimensioni e di un uso combinato con la formaldeide.

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Fissazione chimica Fissazione chimica

Il tetrossido di osmio, impropriamente detto acido osmico, è un ottimo fissativo per i lipidi mentre non reagisce con gli acidi nucleici e con i glucidi. Ha costi elevati ma è il miglior fissativo per indagini ultrastrutturali. E’ volatile.

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Strumenti per l’analisi submicroscopica Strumenti per l’analisi submicroscopica

INCLUSIONE

vengono utilizzati materiali speciali

es. resine epossidiche

(13)

PREPARATI INCLUSI:

l’infiltrazione e l’inclusione PREPARATI INCLUSI:

l’infiltrazione e l’inclusione

Nel caso di resine plastiche termoindurenti catalizzate il tessuto entro la massa fluida verrà posto per tempi e temperature variabili a polimerizzarsi in stufe.

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PREPARATI INCLUSI:

l’infiltrazione e l’inclusione PREPARATI INCLUSI:

l’infiltrazione e l’inclusione

Nel caso di resine idrofilliche usate per l’inclusione di pezzi da destinarsi alla microscopia elettronica per indagini immunocitochimiche i procedimenti di indurimento si effettueranno a basse temperature con o senza l’ausilio di catalisi a raggi UV.

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Strumenti per l’analisi submicroscopica Strumenti per l’analisi submicroscopica

ultramicrotomo

SEZIONAMENTO

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Strumenti per l’analisi submicroscopica Strumenti per l’analisi submicroscopica

SEZIONAMENTO

il tessuto incluso può essere tagliato in sottilissime sezioni (25-100 nm)

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Strumenti per l’analisi submicroscopica Strumenti per l’analisi submicroscopica

ultramicrotomo

SEZIONAMENTO

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PREPARATI INCLUSI:

l’ultramicrotomo

PREPARATI INCLUSI:

l’ultramicrotomo

Per l’osservazione ultrastrutturale i campioni inclusi in resine epossiche o acriliche dovranno essere sezionati con un ultramicrotomo a spessori variabili dai 20 ai 200 nm. Esso è dotato di uno stereomicroscopio per ingrandire opportunamente i preparati da sezionare che sono normalmente assai piccoli.

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Sezionamento Sezionamento

per le sezioni in resine plastiche si usano lame in diamante o cristallo

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PREPARATI INCLUSI:

l’ultramicrotomo e le lame PREPARATI INCLUSI:

l’ultramicrotomo e le lame

Le sezioni ultrafini ottenute con gli ultramicrotomi non possono essere maneggiate per la loro estrema fragilità e per le ridotte dimensioni; inoltre non possono essere poste su un supporto di vetro che arresterebbe il fascio elettronico. La sezione è ottenuta sfruttando il filo di una lama di cristallo o diamante che seziona il campione contenuto in una dura resina acrilica o epossidica.

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PREPARATI INCLUSI:

il knifemaker

PREPARATI INCLUSI:

il knifemaker

La preparazione delle lame di vetro richiede l’utilizzo del knifemaker, un particolare “taglialame” che consente di ottenere lame con inclinazioni strettamente legate al tipo di tessuto da trattare.

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PREPARATI INCLUSI:

la raccolta delle sezioni PREPARATI INCLUSI:

la raccolta delle sezioni

Le sezioni sono raccolte in una vaschetta adesa o parte integrante della lama e colma d’acqua. Sul liquido galleggerà la fettina (o un nastro di fettine) dopo essere stata tagliata e prima di essere raccolta su retine metalliche.

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PREPARATI INCLUSI:

l’ultracriomicrotomo e le grids PREPARATI INCLUSI:

l’ultracriomicrotomo e le grids

Le retine metalliche o grids possono essere di rame o, in caso di indagini immunocitochimiche, di nickel o oro. La loro forma e la compattezza delle bar varia a seconda del tipo di osservazione e si misura in mesch.

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Strumenti per l’analisi submicroscopica Strumenti per l’analisi submicroscopica

OSSERVAZIONE

Il fascio di elettroni viene indirizzato sul campione.

Gli elettroni attraversando il tessuto

(colorato con metalli pesanti) perdono parte della loro energia.

Gli elettroni vengono quindi convogliati su una piastra e la loro energia si converte in punti di luce la cui intensità è proporzionale

all’energia cinetica degli elettroni.

Mettendo una pellicola sensibile agli

elettroni si ottiene un negativo (stampa in bianco e nero dell’immagine)

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Strumenti per l’analisi submicroscopica Strumenti per l’analisi submicroscopica

OSSERVAZIONE

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Microscopio elettronico a scansione (SEM)

Microscopio elettronico a scansione (SEM)

Serve a visualizzare la parte superficiale di un campione solido (fornisce una

immagine tridimensionale)

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Microscopio elettronico a scansione (SEM)

Microscopio elettronico a scansione (SEM)

Il campione deve essere preparato in modo da permettere la formazione sulla

superficie di uno strato sottile di metalli pesanti (es. oro, palladio)

Gli elettroni vengono convogliati sul

campione e saranno in parte riflessi e in parte respinti.

Ambedue i tipi di elettroni vengono catturati ed un sistema di analisi

particolare li elabora riproducendo su di un monitor una struttura tridimensionale

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Microscopio elettronico a scansione (SEM)

Microscopio elettronico a scansione

(SEM)

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Tecniche di congelamento- frattura Tecniche di congelamento- frattura

Campioni sottoposti a congelamento veloce (non si formano cristalli di ghiaccio) non

subiscono alterazioni meccaniche.

Quando l’oggetto congelato viene colpito da una lama super-congelata, la sua frattura

avviene secondo piani preferenziali (di solito tra le membrane)

La superficie fratturata viene stratificata con platino e carbonio che da origine ad

una replica della superficie.

Il tessuto viene digerito (allontanato) e la replica viene esaminata al ME

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Freeze fracture Freeze fracture

Nucleo scalzato dalla sede

Nucleo in situ

figura

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Riferimenti

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