Effetto della temperatura sul tasso di crescita

(1)

Effetto della temperatura sul tasso di crescita

e conseguenze a livello molecolare per la cellula microbica

(2)

OPTIMA di temperatura per i microorganismi

(3)

(4)

OPTIMA di pH per i microorganismi

(5)

(6)

Microorganismi e O

₂

L’ossigeno molecolare è un gas che risulta estremamente tossico nei confronti dei sistemi biologici i quali non abbiano sviluppato meccanismi di difesa nei confronti dello stesso.

Bisogna ricordare che l’origine e lo sviluppo delle prime forme di vita sulla Terra è avvenuto in condizioni strettamente anaerobiche. Solo in un secondo momento, con l’avvento della fotosintesi ossigenica, l’atmosfera si è progressivamente arricchita di O₂. Ciò ha spinto l’evoluzione nel senso di organismi capaci di sopravvivere in presenza di questo gas, con indubbi vantaggi sul piano energetico-metabolico per i medesimi.

Al tempo stesso, lo sfruttamento di questi vantaggi ha richiesto l’adozione di adeguati sistemi di difesa contro gli intermedi (veri responsabili della tossicità, dal momento che ossidano molecole biologiche chiave come i lipidi di membrana!) quali lo ione superossido (O₂^-), il perossido di idrogeno (H₂O₂) ed il radicale idrossile (HO·) che si formano allorquando l’O₂ viene ridotto – nella respirazione aerobica - ad H₂O.

La difesa nei confronti della tossicità legata alla presenza di ossigeno molecolare include meccanismi che limitino il più possibile la produzione delle specie chimiche intermedie oppure eliminino questi intermedi allorché inevitabilmente prodotti.

I microorganismi in grado di fronteggiare la presenza di O₂ devono quindi disporre di sistemi enzimatici quali a) superossido-dismutasi che catalizza la seguente reazione:

O₂^- + O₂^- + 2H⁺ ! H₂O₂ + O₂ e b) 1) catalasi e 2) perossidasi che invece catalizzano le reazione seguenti:

1) H₂O₂ + H₂O₂---> 2H₂O + O₂ 2) H₂O₂+ NADH + H⁺---> 2H₂O + O₂ + NAD⁺

(7)

SULLA BASE DELLA RISPOSTA ALLA PRESENZA DI O

₂

, SI DISTINGUONO TRE CATEGORIE DI MICROORGANISMI

Categoria 1 AEROBI

Usano O

₂

e posseggono gli enzimi per detossificare gli intermedi

Categoria 2

ANAEROBI OSSIGENO-TOLLERANTI

Non usano l’O

₂

ma sono in grado di detossificare gli intermedi

Categoria 3

ANAEROBI OBBLIGATI

Non usano l’O

₂

e sono incapaci di detossificare le specie chimiche intermedie

(8)

Classificazione dei microorganismi sulla base della richiesta di ossigeno

Categoria 1

A) AEROBI OBBLIGATI muoiono in assenza di ossigeno molecolare (O₂); non hanno capacità di metabolismo fermentativo

B) MICROAEROFILI crescono in maniera ottimale a concentrazioni di O₂ più basse (5-10 % fino a 15%) rispetto al livello di ossigeno atmosferico (20 -21%)

C) CAPNOFILI crescono in presenza di concentrazioni di O₂ridotte (intorno al 15%) ed elevate concentrazioni di CO₂ (intorno al 5%)

D) ANAEROBI FACOLTATIVI crescono meglio in presenza di ossigeno; se assente, possono fermentare o adottare la respirazione anaerobica: in tali condizioni crescono più lentamente

Categoria 2

E) ANAEROBI AEROTOLLERANTI fermentano sia in condizioni aerobiche che anaerobiche: l’O₂non li uccide (es. Streptococcus lactis)

Categoria 3

F) ANAEROBI OBBLIGATI sono uccisi dalla presenza di ossigeno molecolare; possono avere metabolismo fermentativo ovvero adottare la respirazione anaerobica

(9)

CRESCITA BATTERICA SULLA BASE DELLA RICHIESTA DI OSSIGENO

(10)

Sistema Gas-Pack per colture microbiche in anaerobiosi

(11)

Anaerobic Glove Box

(12)

BATTERI ED OSMOLARITA’

• Hypotonic

• Isotonic (0.85% NaCl)

• Hypertonic

(13)

Halophiles require elevated salt concentrations to grow; often require 0.2 M ionic strength or greater and may some may grow at 1 M or greater; example, Halobacterium.

Osmotolerant (halotolerant) organisms grow over a wide range of salt concentrations or ionic strengths; for example, Staphylococcus aureus.

BATTERI E SALINITA’ DEL MEZZO DI CRESCITA

(14)

(15)

(16)

(17)

IL TASSO DI CRESCITA DI UNA COLTURA BATTERICA

Equation for calculating population size over time:

N

_ƒ

= (N

i

)2

ⁿ

N

_ƒ

is total number of cells in the population.

N

i

is starting number of cells.

Exponent n denotes the number of

generations

(18)

Raffronto della stima della crescita microbica

mediante determinazione della densità ottica (nefelometria) e conta diretta su piastra

(19)

Conta delle cellule batteriche mediante ematocitometro

(es. Camera di Thoma modificata da Helber:

profondità 0.02 mm, superficie del quadrato centrale 0.0025 mm²)

(20)

(21)

Conta delle cellule batteriche mediante turbidimetro (nefelometro)

(OD = optical density; assorbanza espressa in NTU = nephelometric turbidity units)

(22)

Conta microbica diretta

mediante il metodo del piastraggio delle sospensioni/diluizioni seriali

(CFU = colony forming units)

(23)

(24)

CONTA MICROBICA SU PIASTRA

(25)

A quick example problem: Suppose you inoculate a plate with 0.1 ml of a 10

^–1

dilution of a sample of milk. After incubation, you find that 80 colonies have arisen on the plate. How may CFUs were there per ml of the milk?

Solution

As plating 0.1 ml of a 10

^–1

dilution is the equivalent of plating 1 ml of a 10

^–2

dilution which is in turn equivalent to plating 10

^–2

ml of the original, undiluted sample of milk, then you could say that there would have been 80 CFUs per 10

^–2

ml of the sample, and – proportionately – there would have been 10

²

times as many CFUs (i.e., 8000 or 8.0 X 10

³

) per ml of the undiluted milk sample.

Looking at the problem this way:

IF 80 colonies arise from plating 0.01 ml of the milk,

THEN there were 8.0 X 10

³

CFUs per one ml of the milk.

(26)

2.9 3

2 3

2.1 2

2 3

1.5 1

2 3

0.93 0

2 3

1.6 3

1 3

1.2 2

1 3

0.75 1

1 3

0.43 0

1 3

0.95 3

0 3

0.64 2

0 3

0.39 1

0 3

0.23 0

0 3

Stima della carica microbica secondo il Metodo MPN mediante ricorso alle Tavole di McCrady

The heading of the last column tells us that this combination of results (in order: 3-2-0) suggests an average of 0.93 organisms being inoculated into each of the tubes of the middle set (of the three sets of tubes chosen) – i.e., those inoculated with one ml of a 10^–3 dilution. Therefore, the most-probable number of organisms per one ml of the original, undiluted sample would be 0.93 X 10³ or 9.3 X 10².

Conta microbica mediante determinazione MPN (Most Probable Number)

(27)

10

^-1

10

^-2

10

^-3

10

^-4

Annotare il numero di tubi positivi per ciascuna diluizione

Al fine di calcolare l’MPN, la prima cosa da individuare è l’ultima diluizione (detta anche diluizione limite) che presenta tutti i tubi negativi (nell'esempio è la diluizione 10

^-4

, dove la non-positività dei tubi è indicata dal mancato accumulo di gas nella campanula di Durham) e il numero di tubi positivi nelle due precedenti diluizioni. Nell'esempio in figura:

3 tubi positivi alla diluizione 10

^-1

; 3 tubi positivi alla diluizione10

^-2

; 2 tubi positivi alla diluizione10

^-3

; 0 tubi positivi alla diluizione10

^-4

(28)

Dinamica della crescita di Penicillium sp. e della produzione di penicillina

(29)

Bioassay plate showing antibacterial activity

(30)

Saggio per la determinazione dell’attività antibatterica

(31)

ANTIBIOGRAMMA

(32)

Three bacterial colonies growing on this plate

secrete antifungal-antibiotics that diffuse into the

medium and inhibit the growth of a mold

(33)

Inhibit translation (protein synthesis) Gram-positive and Gram-negative bacteria,

Doxycycline Semisynthetic

Inhibit translation (protein synthesis) (30S ribosomal subunit inhibitor) Gram-positive and Gram-negative bacteria,

Rickettsias Streptomyces species

Tetracycline Tetracyclines

Inhibits transcription (eubacterial RNA polymerase)

Gram-positive and Gram-negative bacteria, Mycobacterium tuberculosis

Streptomyces mediterranei Rifampicin

Rifamycins

Inactivate membranes containing sterols

Fungi (Candida) Streptomyces noursei

Nystatin

Inactivate membranes containing sterols

Fungi Streptomyces nodosus

Amphotericin Polyenes

Inhibits steps in murein (peptidoglycan) biosynthesis and assembly

Gram-positive bacteria Bacillus subtilis

Bacitracin

Damages cytoplasmic membranes Gram-negative bacteria

Bacillus polymyxa Polymyxin

Polypeptides

Inhibits translation (protein synthesis) (50S ribosomal subunit inhibitor) Gram-positive bacteria, Gram-negative

bacteria not enterics, Neisseria, Legionella, Mycoplasma

Streptomyces erythreus Erythromycin

Macrolides

Inhibits translation (protein synthesis) Gram-positive and Gram-negative bacteria

esp. anaerobic Bacteroides Streptomyces

lincolnensis Clindamycin

Lincomycins

Inhibits steps in murein (peptidoglycan) biosynthesis and assembly

Gram-positive bacteria, esp. Staphylococcus aureus

Streptomyces orientales Vancomycin

Glycopeptides

Inhibit translation (protein synthesis) Gram-positive and Gram-negative bacteria

esp. Pseudomonas Micromonospora

species Gentamicin

Inhibit translation (protein synthesis) (30S ribosomal subunit inhibitor) Gram-positive and Gram-negative bacteria

Streptomyces griseus Streptomycin

Aminoglycosides

Inhibits steps in cell wall (peptidoglycan) synthesis and murein assembly

Gram-positive and Gram-negative bacteria Streptomyces cattleya

Imipenem Carboxypenems

Gram-positive and Gram-negative bacteria Chromobacter

violaceum Aztreonam

Monobactams

Suicide inhibitor of beta-lactamases Gram-positive and Gram-negative bacteria

Streptomyces clavuligerus Clavamox is

clavulanic acid plus amoxycillin Clavulanic Acid

Gram-positive and Gram-negative bacteria Ampicillin,

Amoxycillin Semisynthetic

penicillin

murein assembly species

cephalosporins)

Ta b le 3 . C la ss e s o f a nt ib io tic s a nd th e ir p ro p e rt ie s M E T O D O L O G IE d i M IC R O B IO L O G IA

(34)

Bacterial Hopanoids

Fungal Sterols

Classes of antibiotics and their properties

(35)