INTRODUZIONE ALLA PARTE SPERIMENTALE

INTRODUZIONE

ALLA PARTE

I canali al potassio sono proteine di membrana che permettono il passaggio di ioni potassio attraverso la membrana cellulare. Tra i differenti tipi di canali al potassio, alcuni di loro definiti come sensibili all’ATP (KATP), sono regolati da variazioni

della concentrazione di ATP, quindi associano il potenziale di membrana con lo stato metabolico della cellula. I canali KATP sono localizzati nel sarcolemma e

nella membrana interna mitocondriale delle cellule di molti tessuti, inclusi il cuore, lo scheletro, i muscoli lisci, le cellule β pancreatiche e i neuroni, e sono quindi coinvolti in molti processi fisiologici come la secrezione ormonale, l’attività della muscolatura liscia e il rilascio di neurotrasmettitori.

Fig.12 Rappresentazione schematica dei canali al potassio

Nel cuore, i canali mitocondriali e sarcolemmatici sono coinvolti nella modulazione dell’attività miocardica, specialmente in condizioni di ischemia o ipossia, durante i quali svolgono un’azione protettiva.

Sono conosciuti vari meccanismi di cardioprotezione; uno di questi è il fenomeno di PRECONDIZIONAMENTO ISCHEMICO (IPC), un meccanismo endogeno nel quale brevi periodi di ischemia (3-5 minuti) hanno dimostrato di aumentare la resistenza dei cardiomiociti al danno indotto da periodi successivi di ischemia, riducendo l’estensione della necrosi nella regione danneggiata. In questo fenomeno sono attivati diversi meccanismi, sia recettore-dipendenti (l’attivazione di bradichinina, adenosina e sistema oppioide), che recettore-indipendenti

(mediati da NO e dai radicali liberi). I canali mito-KATP sembrano giocare un

ruolo chiave nell’IPC; è stato dimostrato che il diazossido, a concentrazioni più basse di quelle che inducono l’attivazione dei canali KATP nel sarcolemma, ha

mostrato di mimare il precondizionamento ischemico producendo effetti cardioprotettivi marcati. Inoltre, è stato osservato che queste risposte farmacologiche risultano bloccate o ridotte da bloccanti selettivi del canale mito-KATP come l’acido 5-idrossidecanoico (5-HD) e da bloccanti non selettivi come la

glibenclamide. Tuttavia, la struttura molecolare dei canali mito-KATP non è ancora

del tutto conosciuta, e la prova per il suo coinvolgimento nella cardioprotezione è quasi interamente di natura farmacologica.

La possibilità di attivare i processi di IPC con meccanismi esogeni rappresenta una base razionale per lo sviluppo di molecole ad attività antischemica interessanti e innovativi.

Negli ultimi anni il nucleo del benzopirano è stato ampiamente studiato, al fine di ottenere nuovi composti dotati di maggiore selettività verso specifici bersagli come ad esempio i canali mito-KATP cardiaci. Sono stati sintetizzati dei derivati

benzopiranilcianoguanidinici, BMS-180448 e BMS-191095, che presentano una buona selettività verso i canali mito-KATP .

O OH N NH Cl BMS 191095 O OH N _NH NH NC NC Cl BMS 180448

Da uno studio delle SAR dei principali KCOs ad attività cardioprotettiva, sono state evidenziate alcune caratteristiche strutturali necessarie per ottenere una selettiva attività sui canali mito-KATP, tra cui:

1) Nucleo eterociclico benzopiranico

2) Piccoli sostituenti lipofili in posizione 2 (R’, R’’) 3) Sostituente elettron-attrattore in posizione 6 ( R)

4) Sostituente ricco di elettroni in posizione 4 (X) a cui è legato il raggruppamento lipofilo aromatico che sembra essere essenziale per la selettività tissutale.

Fig.13 Requisiti strutturali importanti per l’attività ischemica

Su questa base il gruppo di ricerca in cui ho svolto questa tesi di laurea ha sviluppato derivati di tipo spiromorfolinici e spiromorfolonici variamente funzionalizzati come potenziali attivatori dei canali KATP 57.

Fig.14 Struttura generale di derivati spiromorfolinici e spiromorfolonici.

O N X

O

R R' X= CO, CH2;

R'= NH₂, NHAc, NO₂, CF_3, OMe, Me; R= Br, H; O R R'' R' X 2 4 6 R= CN, NO2, Br...

X= catena ricca di elettroni R'=R''=CH₃ R'=CH₃, R''=C₂H₅

Questi composti sono stati testati come miscela racemica alla dose di 40 mg/kg sui cuori di ratto isolati alla Langerdoff soggetti a cicli ischemia/riperfusione. Il danno ischemico risultante è stato quantificato valutando il parametro funzionale e morfologico, che indicano rispettivamente la ripresa dell’attività contrattile del cuore (RPP) e l’area ischemica necrotizzata espressa come percentuale del rapporto Ai sull’area totale (Ai/Atot %).

Fra questi derivati il più interessante è stato il derivato spiromorfolonico che presenta come sostituente in para dell’anello benzilico un raggruppamento acetoamidico (F163). O N O O NHAc F163

Il composto F163 ha mostrato una buona attività antiischemica con efficacia paragonabile a farmaci di riferimento come il diazossido che è un derivato benzotiadiazinico con buona selettività, e il cromakalim che è un potente agonista del canale KATP a struttura benzopiranica non selettivo (Tabella 1) 57.

COMPOSTI RPP 120’(%) A1/Atot(%)

Cromakalim 86±12 23±3

Diazossido 45±7 25±4

F163 59±13 22±5

Tabella 1. Parametri funzionali (RPP 120’%) e morfologici (A1/Atot%) dei due farmaci di

Il composto F163 è stato anche sottoposto ad ulteriori studi farmacologici per valutarne gli effetti sulla pressione sanguigna e sul metabolismo del glucosio, che sono tipici effetti indesiderati legati all’attivazione dei canali sarc-KATP espressi

nei vasi dei muscoli lisci e nelle cellule β pancreatiche 58

.

E’ stato dimostrato che il composto F163, analogamente al diazossido, ha un modesto effetto vasorilasciante a differenza del cromakalim che causa un’immediata e drammatica caduta della pressione arteriosa. (Tabella 2)

COMPOSTI pIC50 Emax%

Cromakalim 7,01±0,09 98±1

Diazossido 4,72±0,04 97±2

F163 4,60±0,03 57±3

Tabella 2. Parametri di potenza e di efficacia vasorilasciante dei farmaci di riferimento e di F163.

In più sembra che il composto F163 non abbia alcun effetto sul metabolismo del glucosio.

Uno studio successivo sull’attività dei singoli enantiomeri, che sono stati separati tramite HPLC su fase stazionaria chirale, ha indicato che l’attività cardioprotettiva risiede nell’enantiomero levogiro. Infatti l’isomero S, ha mostrato proprietà antischemiche (RPP 120’ = 64 ± 20%; Ai/Atot = 16 ± 6%) paragonabili a quelle a

quelle esibite dalla miscela racemica (RPP 120’ = 59 ± 13%; A1/Atot = 22± 5%) e

dai farmaci di riferimento (cromakalim: RPP 120’= 86± 12%; A1/Atot = 23± 3% e

diazossido: RPP 120’ = 45 ± 7%; A1/Atot = 25 ± 4%). Al contrario l’enantiomero

R si è rivelato completamente privo di attività antishemica (RPP 120’ = 27± 5%;

Ai/Atot = 35 ± 2%) 59.

Visti i buoni risultati ottenuti da questo tipo di composti, in questa tesi di laurea mi sono occupata della sintesi di un analogo di F163 in cui il sostituente acetamidico (e amminico) sull’anello benzilico si trova in posizione meta anziché

in para (composti 1 e 2), con lo scopo di valutare l’effetto di questo tipo di modifica sull’attività di questi derivati.

O N O O NHAc F163 O N O O NHAc 1

In più relativamente al composto F163, considerando l’importanza ai fini dell’attività di un enantiomero rispetto all’altro si è resa necessaria la sintesi enantioselettiva e quindi in questa tesi di laurea si è cercato di mettere a punto un metodo per la sintesi enantioselettiva di F163, attraverso la formazione di un epossido in posizione 4 e la sua successiva apertura selettiva.

O N O O NH₂ 2

SCHEMA 1

a: acetone, pirrolidina, toluene; riflusso, 24h. b: TMSCN, ZnI₂, CH₂Cl₂; N₂, t.a., 12h.

c: LiAlH₄, THF; N₂, t.a., 2h.

d: ClCOCH₂Cl, NaOH, CH₂Cl₂; N₂, t.a., 1h.

e: t-BuOK, toluene; N₂, t.a., 2h.

f: m-nitrobenzilbromuro, NaH, DMF; N₂, t.a., 2h.

g: SnCl₂.2H₂O, EtOH; riflusso, 4h;

La sintesi dei composti 1 e 2 è stata effettuata seguendo la procedura riportata nello SCHEMA 1.

La reazione dell’acetofenone commerciale 3 con acetone e pirrolidina a riflusso, ha fornito il 2,2 dimetilcromano 4, che successivamente è stato sottoposto a reazione con il trimetilsililcianuro per ottenere il ciano derivato 5. La reazione di riduzione con LiAlH4 ha portato alla formazione dell’amminoalcol 6, che per

successiva aggiunta di cloro acetilcloruro ha fornito il composto 7. La ciclizzazione di 7 in presenza di t-BuOK, ha condotto al morfolone 8, che mediante la reazione di benzilazione con il m-nitrobenzilbromuro ha portato alla formazione del composto 9. Questo intermedio è stato fatto reagire con il SnCl2.2

H2O in EtOH a riflusso fornendo il derivato amminico 2. Infine l’acetilazione con

SCHEMA 2

a: Ph₃PCH₃Br, n-BuLi, THF; temperatura ambiente (t.a.), 16h;

b: Ph₃PCH₃Br, t-BuOK, THF; t.a.,1h;

c: Ph3PCH3Br, t-BuOK, THF; -10°C, 2h;

d: Ph₃PCH₃Br, t-BuOK, THF; 40°C, 12h;

e: Reattivo di Jacobsen, NaOH, Na₂HPO₄, NaOCl; 0°C, 24 h;

La sintesi del derivato olefinico 10 è stata effettuata, come descritto nello schema 2, a partire dal cromanone 4 e dal metil-trifenil-fosfoniobromuro. Questa reazione è stata eseguita impiegando differenti condizioni di reazione.

La reazione in THF e a temperatura ambiente utilizzando il n-BuLi come base, ha condotto ad un grezzo costituito essenzialmente dal prodotto di partenza.

L’impiego di t-BuOK al posto di n-BuLi, nelle stesse condizioni di reazione (THF e t.a.), ha fornito il derivato vinilico 10 desiderato con resa bassa (23%). Per ottimizzare questo passaggio sintetico, la reazione è stata ripetuta variando la temperatura: una prima prova è stata condotta a -10°C portando però all’apertura indesiderata del cromanone. La reazione è stata quindi ripetuta impostando la temperatura a 40°C e in questo caso è stato ottenuto il prodotto desiderato 10 con una resa del 60%.

Il secondo step di questa via sintetica consiste nella formazione dell’epossido 11. La reazione, eseguita secondo la procedura classica di Jacobsen’s 60

, non ha portato al prodotto desiderato, forse a causa dell’ingombro sterico tra i reagenti. Successivamente la reazione è stata fatta seguendo una metodica che prevede l’utilizzo dell’acido m-cloroperbenzoico in presenza di 2,6 di–t-butil-4-metilpiridina in CH2Cl2 a temperatura ambiente 61. In queste condizioni la

reazione ha permesso di ottenere l’epossido desiderato 11.

I tentativi per l’apertura dell’epossido mediante l’utilizzo di una soluzione di NH3

7N in CH3OH e della p-nitrobenzilammina non sono andati a buon fine,