ISCUSSIONI 5. D .

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I molluschi bivalvi sono riconosciuti come una fonte dʼinfezione da NoV e da HAV (Le Guyader et al., 2006; SEIEVA, 2003-2008), ed è quindi importante avere a disposizione una metodica che consenta di rilevarne la presenza. La RT-PCR è un metodo sensibile ed automatizzabile per lʼesame di un elevato numero di campioni. I limiti di applicabiltà di questa metodica nei molluschi bivalvi, come la presenza di inibitori nel campione, che possono interferire con la reazione di amplificazione, implicano però la messa a punto di protocolli di estrazione adeguati per evitare la presenza di falsi negativi.

I metodi descritti in letteratura per lʼestrazione di enterovirus da molluschi bivalvi sono spesso laboriosi, richiedono diversi giorni lavorativi per la preparazione del campione e prevedono diversi step, inclusi precipitazioni multiple in glicole polietilenico, cambiamenti di pH ed in alcuni casi lʼuso di freon (tricloroetilfluoroetano) (Kingsley and Richards, 2001). La RT-PCR del genoma virale estratto da molluschi bivalvi è limitata, infatti, dalla presenza di inibitori (sostanze umiche, glicogeno) e dalle proprietà inibenti-PCR dellʼestratto di molluschi stesso (Kingsley and Richards, 2001). Sebbene quindi la RT-PCR si sia dimostrata una tecnica ampiamente usata nella ricerca e nella diagnosi di NoV e HAV nelle diverse matrici, molti ricercatori hanno espresso perplessità relative al rischio di avere falsi positivi per contaminazione crociata o falsi negativi per presenza di inibenti (Lee et al. 2011).

Un obiettivo del presente lavoro è stato quello di valutare lʼapplicabilità da parte del Laboratorio di Ittiopatologia dellʼIstituto Zooprofilattico Sperimentale delle regioni

Lazio e Toscana, Sezione di Pisa, della metodica “Determinazione di Norovirus ed HAV in Molluschi Bivalvi mediante Real Time PCR” che è stata sottoposta a validazione e dichiarata idonea allʼuso in data 26.06.2009 presso il Laboratorio di Riferimento per il Monitoraggio delle Contaminazioni Virali dei Molluschi Bivalvi dellʼIstituto Superiore di Sanità (Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinario e Sicurezza Alimentare).

Per ovviare al rischio di falsi negativi la metodica in questione prevede lʼutilizzo di un controllo di processo e di un controllo esterno. Per controllo di processo la metodica considera “un virus aggiunto alla porzione di campione prima dellʼestrazione, allo

scopo di verificare lʼefficienza dellʼestrazione (quando si aggiunge al campione da analizzare il virus per il controllo di processo deve essere diverso dal virus target). Il virus selezionato come controllo di processo dovrebbe essere un virus coltivabile privo di envelope con RNA a singolo filamento positivo di dimensioni simili a quelle del virus target per provvedere un buon modello genetico, morfologico e fisico-chimico. Il controllo di processo dovrebbe esibire una persistenza nellʼambiente simile a quella del virus target. Esempi di virus utilizzabili come controllo di processo nella presente procedura includono, oltre allʼHAV, il cui uso è possibile laddove lʼHAV stesso non costituisca il target dellʼanalisi, il virus Mengo e il Calicivirus Felino”.

Mentre, per il controllo esterno la metodica adottata riporta “RNA di riferimento con

funzione di target per il saggio di Real Time RT-PCR e.g. appropriate diluizioni di un trascritto in vitro contenente la sequenza del gene target o di un RNA estratto da virus coltivato (HAV e FCV) o da campione fecale contenente virus dello stesso genogruppo (NoV). Il confronto dei risultati ottenuti sul controllo esterno in presenza

e in assenza del campione consente la determinazione dei livelli di inibizione della RT-PCR in ogni campione sotto test”.

Da un precedente studio sono però emerse perplessità relative al kit da utilizzare per estrarre lʼRNA, (Macori G., 2009-2010) in quanto la procedura lascia la scelta tra vari kit commerciali per lʼestrazione dellʼRNA virale.

Il confronto dei due kit testati sui diversi campioni che pervengono presso il Laboratorio di Ittiopatologia ha messo in evidenza notevoli differenze a seconda del kit scelto, ed in particolar modo ha messo in risalto nel complesso migliori efficienze per il Kit 2 (NucliSENS® MiniMAG®) rispetto al Kit 1(QIAamp Viral RNA Mini Kit).

Per la valutazione dellʼefficienza di estrazione la procedura testata prevede FCV od il Mengo virus come controllo di processo. Nel nostro caso la valutazione dellʼefficienza di estrazione è stata effettuata utilizzando FCV, mentre per lʼefficienza di amplificazione è stato utilizzato NoV GII come controllo esterno. La scelta del NoV GII è stata dettata dalla più facile reperibilità di questo virus rispetto a NoV GI.

Dai risultati ottenuti, il Kit 1 è risultato migliore solo per lʼefficienza di estrazione nella matrice C. gigas (7,85 ± 10,01), mentre il Kit 2 ha dato risultati migliori nellʼefficienza di estrazione di M. edulis (20,41 ± 36,05), D. trunculs (12,44 ± 15,71) e C. gallina (2,43 ± 2,90) e nellʼefficienza di amplificazione di tutte le matrici testate.

Dalla letteratura emerge però che a seconda del kit utilizzato, e quindi della metodica di estrazione, lʼefficienza di estrazione cambia con il virus estratto. Un recente studio effettuato su FCV e HAV confrontando proprio il kit NucliSENS® MiniMAG® (bioMerieux) (Kit 2) con il kit QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) (Kit 1) su matrice acqua, ha messo in evidenza che il Kit 2 risulta più efficiente nellʼestrazione e

purificazione dellʼRNA di FCV rispetto allʼHAV, mentre il Kit 1 risulta più efficiente verso il virus HAV (Di Pasquale et al., 2010). La miglior efficienza di estrazione del Kit 2 potrebbe quindi essere influenzata da una diversa efficienza nei confronti del virus utilizzato come controllo di processo rispetto ai virus target. Le migliori efficienze di amplificazione ottenute con il Kit 2 per tutte le matrici testate sembrano però dimostrare anche una miglior capacità di purificazione per questa tecnica di estrazione.

Le più alte efficienze di amplificazione ottenute con il kit NucliSENS® MiniMAG® (bioMerieux) (Kit 2) potrebbero, infatti, essere legate ad una migliore purificazione del campione utilizzando biglie di silice rispetto al sistema che utilizza membrane di silice (Kit 1, QIAamp Viral RNA Mini Kit - Qiagen), e quindi minor presenza di sostanze inibenti la RT-PCR.

Dal confronto tra i campioni esaminati sono emerse, oltre ad unʼalta variabilità nellʼambito della stessa specie, sostanziali differenze tra le diverse specie di molluschi bivalvi. M. edulis risulta infatti la matrice che presenta valori nellʼefficienza di estrazione e nellʼefficienza di amplificazione più elevati (Kit 1: e.e 15,80 ± 17,37 %, e.a. 71,18 ± 55,72 %; Kit 2: e.e 71,18 ± 55,72 %; e.a. 105,51 ± 40,13 %). Il valore maggiore del 100% dellʼefficienza di amplificazione riscontrato in alcuni campioni è dato da campioni positivi per il NoV GII. Quando infatti il campione è positivo per il target il Ct del campione risulta inferiore rispetto al Ct del controllo esterno e quindi lʼefficienza di amplificazione è maggiore del 100%.

Le minori efficienze di amplificazione dellʼRNA virale riscontrate rispetto a M. edulis nelle specie Donax trunculus (Kit 1: 13,98 ± 29,66 %; Kit 2: 54,74 ± 39,69 %) e

ricondotte alle ridotte dimensioni di queste specie e, di conseguenza, alla difficoltà nellʼeliminazione dei tessuti inibenti lʼamplificazione durante lʼisolamento dellʼepatopancreas. Per i campioni analizzati di Crassostrea gigas invece la bassa efficienza di amplificazione (Kit 1: 51,43 ± 39,67 %; Kit 2: 73,81 ± 40,42 %) potrebbe essere imputabile alle caratteristiche anatomiche dellʼepatopancreas che, in questa specie, presenta una struttura a setti che lo rende difficilmente separabile dagli altri tessuti.

Anche dal confronto dei due kit con i limiti della procedura adottata il Kit 2 è risultato quello che ha soddisfatto nella maggior parte dei casi i limiti di accettabilità. Il Kit 1 è risultato migliore solo per i campioni di M. edulis (21 su 24 campioni) con una differenza peraltro significativa rispetto al Kit 2 (12 su 24 campioni), e questo potrebbe essere un problema nellʼutilizzo del Kit 2 nella routine diagnostica su questa specie in quanto un minor numero di campioni risulterebbe analizzabile qualora risultasse negativo. La procedura adottata considera infatti “accettabile unʼefficienza

di amplificazione maggiore o uguale al 50%. Determinazioni con efficienza di amplificazione inferiore sono considerate accettabili qualora la ricerca del parametro target abbia dato esito positivo.” e inoltre “accettabile un efficienza di estrazione maggiore dellʼ1%. Determinazioni con efficienza di estrazione inferiore sono considerate accettabili qualora la ricerca del parametro target abbia dato esito positivo”. Nel caso quindi di valori inferiori ai limiti di accettabilità con esito negativo i

risultati dovrebbero espressi come “nessun risultato”. Non è possibile infatti esprimere il risultato come “non rilevato genoma virale in 5 μl di estratto di

amplificazione ed estrazione non è possibile escludere la presenza di falsi negativi in questi campioni.

Il minor numero di campioni di M. edulis che soddisfano il parametro di accettabilità dellʼefficienza di estrazione con il Kit 2 è però compensato per questa matrice dal più alto numero di campioni che soddisfano il limite dellʼefficienza di amplificazione con questo kit (24 su 24 campioni) rispetto al Kit 1 (14/24). Anche per C. gigas, il Kit 1 ha mostrato un maggior numero di campioni che soddisfano il limite dellʼefficienza di estrazione (17 su 24) rispetto al Kit 2 (15 su 24), ma in questo caso non è stata riscontrata una differenza significativa, per cui possiamo affermare che abbiano unʼefficienza simile. Al contrario il Kit 2 si è dimostrato più efficiente per le altre matrici nel soddisfare i parametri indicati dalla procedura adottata.

Sebbene C. gigas sia lʼunico tra questi molluschi che viene abitualmente consumato crudo e quindi più a rischio di trasmissione di NoV GI e GII e HAV, la miglior efficienza di estrazione ottenuta con il Kit 1 solo per questa specie non giustificherebbe la scelta di questo kit per la matrice molluschi bivalvi. Inoltre, tipica del nostro territorio, è la produzione ed il consumo di D. trunculus. La maggior parte dei campioni pervenuti al Laboratorio di Ittiopatologia è rappresentata dunque da questa specie; lʼutilizzo del Kit 2 potrebbe assicurare quindi risultati più attendibili rispetto al Kit 1.

Sebbene il presente lavoro abbia confrontato due kit di estrazione utilizzabili secondo la procedura adottata, sembrerebbe emergere la necessità di ulteriori studi per valutare lʼefficienza di estrazione e di amplificazione per singolo virus e per singola matrice. In particolar modo, sebbene sia stato esaminato un minor numero di

campioni rispetto alle altre specie, dai dati ottenuti sembra che C. gallina sia quella meno adatta ad essere analizzata con questa metodica.

Un altro problema emerso da una preliminare valutazione è stata la disponibilità di controlli positivi. Infatti, mentre lʼHAV è coltivabile su linee cellulari, malgrado richieda un lungo periodo di adattamento e replichi senza segni dʼinfezione e danni apparenti alla cellula ospite (Cohen et al., 1989; Emerson et al., 1991; Emerson et al., 1993; Funkhouser et al., 1994; Siegl et al., 1984), i NoV non sono coltivabili. La disponibilità di controlli positivi per questi ultimi è legata quindi alla reperibilità di campioni fecali di soggetti infetti. Se questo è relativamente semplice per NoV GII, che è il genogruppo predominante in tutto il mondo, in particolar modo nelle infezioni ospedaliere e nelle case di cura (Bon et al., 2005; Ike et al., 2006), per NoV GI è più difficile riuscire ad assicurarsi una quantità sufficiente da utilizzare come controllo positivo nella routine diagnostica.

La costituzione del plasmide e del trascritto ha risolto questo problema, in quanto la mancanza di un controllo positivo non avrebbe permesso di escludere falsi negativi dai risultati ottenuti.

Anche per HAV, sebbene non sia stata approntata la retta di taratura, è stato costruito il plasmide ed il trascritto. La rilevazione dellʼamplificato dal plasmide e dal trascritto mediante RT e PCR classica hanno messo in evidenza però che il problema è legato alla sonda utilizzata.

La procedura adottata prevede lʼutilizzazione del controllo esterno (“RNA di

riferimento con funzione di target per il saggio di Real Time RT-PCR e.g. appropriate diluizioni di un trascritto in vitro contenente la sequenza del gene target o di un RNA

estratto da virus coltivato (HAV e FCV) o da campione fecale contenente virus dello stesso genogruppo (NoV)), quindi la costituzione dei trascritti ha permesso di

risolvere il problema dei falsi negativi anche in assenza di campioni fecali positivi. Questo è il primo passo per rendere utilizzabile questa metodica nella diagnostica di routine. Permane però il problema di falsi positivi dovuti a contaminazione crociata non potendo distinguere il controllo esterno dal virus target. Allʼinterno di un laboratorio di biologia molecolare falsi positivi possono essere evitati mettendo in atto le misure necessarie per evitare contaminazioni e mediante lʼutilizzo di controlli negativi (Lee et al., 2011). La procedura adottata prevede un sufficiente numero di controlli tali da evitare questo problema. Emerge comunque dalla comunità scientifica la necessità di poter discriminare tra il controllo esterno ed il target. Il sequenziamento dei trascritti utilizzati nel nostro caso potrebbe essere il primo passo per monitorare questo fenomeno.

Recenti studi hanno comunque messo a punto trascritti riconoscibili per NoV GI e GII. Lʼinserimento del sito BamHI nel trascritto (Le Guyader et al., 2009) e prodotti di amplificazione che differiscano in lunghezza dal prodotto di RT-PCR della regione target dei NoV (Lee et al., 2011; Gregory et al., 2011) sono alcuni esempi di come il problema rimanga di attualità.

Lʼanalisi del rischio può essere lʼapproccio corretto per aumentare la sicurezza nel consumo dei molluschi bivalvi. La Quantitative Microbial Risk Assessment (QMRA) è uno strumento statistico che permette di stimare la probabilità che un evento, come ad esempio lʼinfezione virale, avvenga sulla base dellʼesposizione e dei modelli dose-risposta (Pinto et al., 2009). È stato dimostrato che per causare l'infezione da NoV è sufficiente una dose di 10-100 particelle, ma per una valutazione dellʼesposizione al

consumo dei molluschi bivalvi è necessaria la determinazione quantitativa di virus presente nel veicolo di trasmissione (Caul, 1996; Leuenberger et al., 2007; Pinto et al., 2009).

Lo sviluppo quindi di un metodo quantitivo, oltre che qualitativo, permetterebbe un ampliamento delle conoscenze inerenti alla trasmissione dei virus oggetto della ricerca tramite i molluschi bivalvi. La metodica utilizzata nel presente lavoro sembra quindi rendere possibile il passaggio al metodo quantitativo utilizzando la procedura adottata.

La procedura prevede infatti la retta di taratura del controllo di processo e del controllo esterno (virus target o trascritto) e risulta quindi già predisposta per lʼutilizzo come Real Time RT-PCR quantitativa. Nonostante il basso numero di campioni sottoposto ad analisi, la costituzione del plasmide e del trascritto di NoV GI e GII ha permesso di effettuare una Real Time RT-PCR quantitativa.

La possibilità di mantenere il plasmide e di ottenere controlli di amplificazione a concentrazione nota permettono inoltre di standardizzare questa metodica.