CANALI DEL POTASSIO

(1)

(2)

Introduzione ai canali ionici

I canali ionici sono localizzati sulla membrana cellulare dove costituiscono dei pori macromolecolari che rappresentano una via di natura idrofila attraverso la membrana cellulare che al contrario è di natura idrofobica [1]

[1] [1]

[1]; la loro funzione principale è quella di regolare il flusso di ioni tra l’interno e l’esterno della cellula (fig. 1).

(3)

Classificazione dei canali del potassio

I canali del potassio rappresentano un gruppo ampio ed eterogeneo [2][2][2][2], si tratta di proteine di membrana integrali ed ubiquitarie con caratteristiche biofisiche e strutturali diverse (fig. 2) [3][3][3] infatti sono espressi in svariati tipi [3] cellulari [4][4][4][4] e coinvolti in numerose funzioni quali la contrazione

muscolare, la trasmissione nervosa o la secrezione [5][5][5][5].

Fig. 2

Nei mammiferi la concentrazione fisiologica del potassio è di 4,5 mM nei liquidi extracellulari e di 160 mM all’ interno delle cellule, i canali del potassio consentono il transito selettivo degli ioni K+

verso la fase extracellulare (10 7

ioni / secondo) in base ad un gradiente elettrochimico e questa fuoriuscita determina una iperpolarizzazione di membrana con

(4)

mantenere il potenziale membranale di riposo, a ripristinarlo dopo

l’eccitazione o ad attenuare gli effetti depolarizzanti di correnti eccitatorie. Invece, nelle cellule non eccitabili, come quelle endoteliali o leucocitarie, i canali del potassio sono coinvolti in numerose attività cellulari :traduzione dei segnali (fig. 3) [5][5][5], regolazione del volume e meccanismi di trasporto. [5]

Fig. 3

Negli ultimi anni studi di biologia molecolare e di elettrofisiologia hanno permesso di acquisire svariate informazioni in merito alla struttura, ai meccanismi di regolazione e alla funzione dei canali del potassio; poiché presentano un elevato grado di omologia anche la loro sequenza

amminoacidica è stata sequenziata [7][7][7][7] ed è emerso che persistono delle caratteristiche comuni (fig. 4) :

- un poro (via di permeazione acquosa) - un filtro di selettività che seleziona K+

come specie ionica permeante - un meccanismo di “gating” che serve ad alternare la conformazione aperta e chiusa del canale [8].[8].[8]. [8].

(5)

Fig. 4

In base al tipo di segnale che ne determina l’apertura vengono suddivisi in 3 classi principali :

- VoltageVoltageVoltageVoltage----gatedgatedgatedgated contenenti sei segmenti transmembrana ed un singolo poro (fig. 5a).

-

Inward rectifiersInward rectifiersInward rectifiersInward rectifiers contenenti due regioni transmembrana ed un singolo poro (fig. 5b) [9].[9].[9]. [9].

(6)

Fig. 5 a

Fig. 5 b

(7)

Il primo gene codificante per un canale del potassio è stato isolato in un mutante, “Shaker” di “

Drosophila melanogaster”

, più di 15 anni fa [10][10][10][10] consentendo di formulare una classificazione sulla base di differenze genetiche; attualmente sono stati identificati più di 200 geni che hanno in comune la sequenza GlyGlyGly----Tyr(phe)GlyTyr(phe)Tyr(phe)----GlyTyr(phe)GlyGlyGly che probabilmente determina la selettività ionica [11][11][11][11].

L’ approccio genetico per la classificazione ha evidenziato che esiste una precisa correlazione tra un canale complesso o una sua subunità e il gene corrispondente (fig. 6).

(8)

Oltre alla suddivisione genetico – strutturale è ancora ampiamente

utilizzata la classificazione che si basa sui modelli biofisici dei canali e sui rispettivi meccanismi di attivazione e inattivazione per cui si distinguono :

- canali VOLTAGGIO-dipendenti - canali ATP-dipendenti - canali Ca–dipendenti.

Canali VOLTAGGIO

Canali VOLTAGGIO----dipendenti

dipendenti

Sono denominati canali KV e controllano la fase di caduta del potenziale

d’azione nei miociti cardiaci e nelle cellule nervose mentre nelle cellule non eccitabili contribuiscono alla regolazione del volume, all’ attivazione dei mitogeni [12][12][12][12]e alla secrezione di ormoni.

Possono essere raggruppati in 4 sottofamiglie e nonostante presentino una notevole variabilità genetica sono accomunati dalla struttura :

- una subunità α comprendente 6 domini transmembranali (S1 – S6)

- una regione poro situata nel linker tra i domini S5 – S6

- le estremità ammino e carbossi terminali localizzate nello spazio extracellulare (fig. 7).

(9)

Talvolta è presente anche una subunità β che influenza l’attività del canale.

Dal punto di vista funzionale si dividono in 3 sottotipi :

-

transient

con una conduttanza di 15 – 20 pS, si aprono e si inattivano rapidamente in risposta alla depolarizzazione e sono coinvolti nella generazione degli impulsi nelle cellule pace-maker [13][13][13] [13]

-

delayed rectifier

con una conduttanza di 10 – 65 pS, rispondono più lentamente alla depolarizzazione

-

inward rectifier

con una conduttanza di 5 – 3 pS, permettono agli ioni K+

di fluire attraverso la membrana in entrambe le direzioni e determinano l’ insorgenza del potenziale di riposo nei miociti cardiaci.

Canali ATP

Canali ATP----dipendenti

dipendenti

Sono denominati canali KATP e costituiti da due domini transmembranali

(M1 – M2) ed un singolo poro (fig. 8) [14,15][14,15][14,15][14,15].

(10)

Possiedono due siti di legame :

- uno inibitorio per l’ ATP che quando è legato mantiene i miociti in uno stato eccitabile per cui possono sviluppare o mantenere la contrazione - uno attivatorio per il nucleotide difosfato Mg-ADP che determina l’apertura del canale per cui la cellula si iperpolarizza e i miociti vengono rilasciati o sviluppano resistenza allo stimolo contrattile [16][16][16]. [16]

Un meccanismo alternativo di attivazione, tipico dei tessuti vascolari, è rappresentato dalla fosforilazione cAMP-dipendente [17][17][17][17]; in questo caso il canale è un complesso ottamerico che comprende 4 subunità Kir

(segmenti M1 e M2) che costituiscono il poro, 4 subunità SUR accessorie e

le porzioni ammino e carbossi terminali che sono intracellulari. Di queste subunità sono state identificate varie isoforme per cui la

composizione dei canali KATP varia a seconda della localizzazione tissutale;

si trovano prevalentemente a livello cardiaco ma anche nelle cellule β del pancreas, nel muscolo scheletrico e liscio, sui neuroni e sulla vena porta.

Canali Ca

Canali Ca----dipe

dipe

dipendenti

ndenti

Questi canali sono coinvolti in svariati processi fisiologici come l’ eccitabilità neuronale, la generazione del potenziale d’ azione e la neurosecrezione, inoltre esercitano un potente controllo a feed-back sul tono vascolare.

La contrazione delle cellule muscolari lisce è indotta dall’ aumento del calcio intracitoplasmatico imputabile a molteplici fattori, tra questi la depolarizzazione di membrana, l’interazione di agonisti endogeni o esogeni con recettori accoppiati a proteine G che attivano la cascata di secondi messaggeri come l’ I3P (Inositolo 3-fosfato) oppure l’attivazione dei canali del calcio recettore-accoppiati [18][18][18][18].

(11)

All’ interno della cellula l’ aumento di ioni Ca2+

scatena una successione di eventi che comprende l’ attivazione di una protein-chinasi Ca-calmodulina dipendente, l’ interazione tra miosina e actina fosforilata ed infine la

contrazione.

I canali KCa sono attivati da una depolarizzazione di membrana o dall’

aumento dei livelli intracellulari di Ca2+

, all’ attivazione segue un massiccio efflusso di ioni K+

all’esterno della cellula che iperpolarizza la membrana; questo meccanismo d’ azione è comune a tutti i KCa-openers che inducono

una vasodilatazione attraverso il controllo a feed-back perché in questo stato di iperpolarizzazione viene impedito un ulteriore ingresso di Ca2+

(fig. 9).

Fig. 9

In base alla conduttanza si distinguono 3 gruppi fondamentali di canali KCa

[19] [19] [19] [19]:

(12)

I canali SK svolgono un ruolo importante nella regolazione

dell’eccitabilità sinaptica, attualmente ne sono stati clonati tre membri che vengono distinti in base alla sensibilità all’ apamina (fig. 10) estratta dal veleno delle api; altri bloccanti sono il dequalinio cloruro, la

d-tubocurarina e la scillaro tossina [20][20][20]. [20]

Fig. 10

Sono ampiamente rappresentati sia nel SNC a livello degli interneuroni e dei neuroni aminergici sia in periferia, nel muscolo scheletrico durante la fase di sviluppo embrionale o a seguito di denervazione.

Inoltre sembra che siano coinvoloti nella genesi di alcune malattie psichiatriche e neurologiche, in particolare in quelle caratterizzate dalla perdita di elasticità delle sinapsi come il

Morbo di Alzheimer

.

I canali IK si dividono in due gruppi : sensibili e voltaggio-dipendenti che sono stati individuati nei globuli rossi di molti animali e determinano una intensa conduttanza al potassio protratta per un’ ora o più e mostrano un’ attivazione Ca-calmodulina dipendente [21][21][21][21].

L’ ultimo gruppo è rappresentato dai canali BK che sono i principali interessati nel progetto di questa tesi, presentano una conduttanza elevata e risultano sensibili a concentrazioni di ioni Ca2+

di circa 1 µM.

H-Cys-Asn-Cys-Lys-Ala-Pro-Glu-Thr-Ala-Leu-Cys-Ala-Arg-Arg-Cys-Gln-Gln-His-NH2

(13)

Topologia dei canali BK

CaCa CaCa

Risultano composti da associazioni tetrameriche di una subunità proteica, detta α, che sagoma il poro ionico, a questa possono essere associate, mediante legami non covalenti, delle subunità regolatorie dette β.

Ciò che oggi sappiamo di tali canali deriva dai numerosi studi eseguiti su un mutante “

Slowpoke

” della “

Drosophila”

.

La struttura della subunità α, caratterizzata da undici domini idrofobici (S0

-S10), è molto simile a quella dei canali al potassio voltaggio-dipendenti

(fig. 11).

Fig. 11

Tuttavia, la subunità α dei BK presenta notevoli differenze strutturali e funzionali (fig. 12) :

- un settimo dominio transmembranale (S0), che termina con un gruppo

(14)

Fig. 12

La regione compresa tra i domini S5 ed S6 è parte integrante del poro

ionico insieme al P-loop; la porzione più stretta è denominata

selectivity

filter

perché garantisce la permeazione ai soli ioni K+

mentre il P-loop è responsabile del legame con antagonisti come Iberiotossina o

Caribdotossina.

Il dominio S4 sembra essere il sensore del voltaggio infatti la

depolarizzazione induce movimenti dei residui basici del suddetto dominio e questo provoca cambiamenti conformazionali atti a favorire l’ apertura del canale [22][22][22][22].

La regione compresa tra S9-S10 (“the calcium bowl”) probabilmente è

responsabile della sensibilità al calcio intracellulare anche se non è l'unica regione con tale caratteristica [23][23][23]. [23]

Oltre al meccanismo calcio-dipendente il recettore presenta un terzo sito di legame per gli ioni zinco localizzato sul residuo carbossi terminale della subunità α che partecipa attivamente alla regolazione del recettore [24][24][24][24]. La subunità β è costituita da due domini transmembranali (T1-T2) connessi

da un loop extracellulare invece le porzioni ammino e carbossi terminali sono intracellulari. S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 Spazio extracellulare H2N Membrana Subunità α Subunità β ψ ψ COOH H2N HOOC Spazio intracellulare

(15)

Attualmente sono stati identificati otto sottotipi di subunità β, ognuna svolge un’ azione modulatoria diversa nei confronti dei canali BK [25, 26][25, 26][25, 26][25, 26] di cui varia le proprietà biofisiche e farmacologiche come la sensibilità al calcio o agli antagonisti Iberiotossina e Caribdotossina [27].[27].[27]. [27].

Localizzazione ed azione dei canali BK

Sistema cardiovascolare

A questo livello i canali BK si aprono in seguito al rilascio di calcio da parte del reticolo sarcoplasmatico a sua volta dovuto all’ influsso di calcio dal mezzo extracellulare; l’ attivazione dei canali induce quindi una

iperpolarizzazione provocando la chiusura dei canali del calcio voltaggio-dipendenti e l’ inibizione del sistema calcio-calmodulina per cui

complessivamente si ha un effetto vasodilatatorio (fig. 13).

Fig. 13

(16)

Fig. 14

Anche l’ azione del NO sembra mediata dall’ apertura dei canali BK come è dimostrato dal fatto che nell’ ipertensione l’ attivazione dei canali BK NO-mediata è decisamente ridotta [28][28][28][28].

Ulteriori studi hanno evidenziato che la perdita del gene che codifica per la subunità β1 aumenta il tono arteriolare provocando ipertensione [29][29][29][29].

Per questi motivi i nuovi BK-openers potrebbero essere applicati nel trattamento dell’ ipertensione o delle disfunzioni vascolari associate a disturbi cardiaci.

Apparato urinario

Il fenomeno dell’ incontinenza urinaria è dovuto all’ iperattività del tessuto muscolare che provoca un’ involontaria perdita di urina; questa anomalia riflette la scomparsa dei canali BK funzionali che inducendo il

rilasciamento della muscolatura garantiscono un equilibrio tra contrazione e rilassamento. Pertanto una potenziale applicazione dei BK-openers potrebbe essere il trattamento di disturbi funzionali del muscolo detrusore della vescica.

(17)

Sistema nervoso centrale

I canali BK sono presenti a livello dei dendriti, degli assoni e dei terminali sinaptici, in particolare a livello presinaptico inibiscono il rilascio dei

neurotrasmettitori con azione neuroprotettiva per cui potrebbero essere applicati nel trattamento delle ischemie cerebrali.

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