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Numerosi studi condotti sull'uomo e sugli animali hanno evidenziato le correlazioni inverse esistenti tra le specie ossigenate (ROS) verso la diminuzione di motilità e fertilità del seme. L'aumento della perossidazione lipidica determina infatti un decremento dell'attività e dell'efficacia dei sistemi antiossidanti cellulari, che si può tradurre in una riduzione della fertilità. Lo scopo di questo studio è stato quello di determinare, negli spermatozoi e nel liquido seminale di cavallo, la presenza di molecole antiossidanti lipofile (CoQ10 e alfa-tocoferolo) e idrofile (dipeptidi istidinici) come una parte dei

meccanismi difensivi antiossidanti non-enzimatici. Le concentrazioni di queste molecole negli spermatozoi e nel plasma seminale sono state determinate con metodica HPLC ed è stata inoltre ricercata una possibile correlazione tra queste e i parametri cinetici e morfologici per una migliore valutazione della capacità fecondante del seme equino.

Key-words

Several studies led on the man and the animals have highlighted a correlation between reactive oxygen species (ROS) and the decrease of semen motility and fertility. Increased lipid peroxidation reduces antioxidant activity and antioxidant cellular system efficiency and it can cause a reduction of fertility. The aim of this research was to determinate in stallion spermatozoa and seminal plasma the presence of antioxidant lipophyl molecules (CoQ10 and alfa-tocopherol) and hydrophil ones (imidazole dipeptides) as a part of the

CAPITOLO 1

SPECIE REATTIVE

OSSIGENATE

1.1 STRESS OSSIDATIVO

Negli ultimi quindici anni, ricercatori e studiosi hanno rivolto particolare interesse e una maggiore attenzione allo stress ossidativo mediato dai radicali liberi, pervenendo a risultati e a conclusioni innovative ed in parte inaspettateche hanno messo in luce come lo stress ossidativo sia implicato in numerose malattie e disordini metabolici dell'uomo così come degli animali e più in generale degli organismi viventi. E’ ormai ben noto in ambito scientifico e medico come lo stress ossidativo sia una delle cause principali del normale processo d'invecchiamento del nostro organismo. La molecola di ossigeno che è fondamentale per le attività cellulari, può risultare molto tossica per gli organismi viventi. La sua riduzione in acqua produce alcune specie reattive ossigenate (ROS), quali l’anione superossido (O2-·), il perossido di idrogeno (H2O2) e il più potente degli

ossidanti, il radicale idrossile (HO·). Queste molecole hanno vita molto breve, tra 10-11 e 10-9 secondi, poiché sono fortemente reattive e possono reagire con i diversi costituenti cellulari per stabilizzare la loro struttura elettronica. Le proteine, il DNA, i carboidrati e in particolare gli acidi

Lo stress ossidativo fu messo in evidenza come possibile causa di deficienza spermatica, per la prima volta nel 1943 (J. Macleod, 1943), studi successivi hanno evidenziato correlazioni tra produzione delle ROS con la diminuzione della motilità spermatica, con la mancata penetrazione dello spermatozoo (spz) nell’oocita e con la fertilità (Aitken e Clarkson, 1989; Alvarez e coll., 1987; Aitken e coll., 1990; De Lamirande e Gagnon, 1992; Iwazaky e Gagnon, 1992).

Fino a poco tempo fa, le ROS erano considerate tossiche per lo spermatozoo, tuttavia studi recenti hanno evidenziato come piccole quantità di ROS sono necessarie allo spz per acquisire la capacità fecondante (Aitken, 1999; Gagnon e coll., 1991; De Lamirande, Gagnon, 1994; Aitken, 1997).

L’ipotesi che limitate quantità di ROS possano agire in maniera fisiologica nella regolazione delle funzioni dello sperma fu sostenuta per la prima volta in uno studio condotto da Aitken e coll. nel 1989 (Aitken e coll, 1989).

Evidenze sperimentali hanno dimostrato che incubando gli spz con basse concentrazioni di perossido di idrogeno (H2O2) viene stimolato il processo

di capacitazione, lo spz produce una motilità iperattiva, una maggiore risposta alla reazione acrosomiale ed inoltre è stato osservato un

Gagnon, 1992a). Altre ROS diverse dal perossido di idrogeno come l'ossido nitrico e l’anione superossido (O2-) hanno mostrato di promuovere

la capacitazione e la reazione acrosomiale (Zini e coll, 1996)

L’anione superossido si muove attraverso canali anionici della membrana cellulare e agisce come una fosfolipasi all'interno di essa (Deby C.,e coll., 1990), portando ad un accumulo di lisofosfolipidi, soprattutto di lisofosfatidilcolina (Kinnard A., e coll., 1988), implicata nella reazione acrosomiale.

L'osservazione che aggiungendo singolarmente i due radicali viene indotta la capacitazione spermatica, dimostra che la presenza di ciascuna molecola è sufficiente per l'avvio di tale reazione (De Lamirande e Gagnon, 1993a; Griveau e coll.,1994; Leclerc e coll., 1997). Comunque, la necessità della presenza di entrambe è dimostrata da altri esperimenti in cui la Superossido Dismutasi (SOD) e la catalasi (CAT) inibiscono la capacitazione spermatica (Leclerc et al., 1997). Tutto ciò non è in contraddizione, anzi aiuta a comprendere che la capacitazione spermatica è parte di un processo di ossidazione.

umana degli spermatozoi equini crioconservati a questa molecola (Ducci e coll., 1999).

Tra i sistemi antiossidanti enzimatici presenti nel plasma seminale e nello stesso spermatozoo vi sono tre enzimi che costituiscono la base di questo sistema di protezione: la Superossido Dismutasi (SOD) che accelera la dismutazione dello ione superossido in perossido di idrogeno, (Nissen coll. 1983) la Catalasi (CAT) che permette la degradazione del perossido di idrogeno in acqua ed ossigeno (Julin e coll., 1989) ed il sistema glutatione perossidasi/reduttasi che catalizza la degradazione del perossido di idrogeno e degli idroperossidi lipidici, utilizzando il glutatione ridotto (Alvarez e coll., 1989).

1.2 ORIGINE DELLE ROS

Alcuni studiosi sostengono che due tra le principali fonti di produzione delle ROS nell’eiaculato umano siano da una parte gli spz stessi, in particolar modo quelli che presentano anomalie morfologiche e funzionali (Alvarez e coll., 1987; Aitken e Clarkson, 1987; Iwasaki. e Gagnon, 1992) e dall’altra i leucociti (neutrofili) infiltrati nel seme (Aitken. e West, 1990;

presenti nel seme in elevate concentrazioni ed in stato di attivazione possono essere una seria minaccia per lo spermatozoo, specialmente nel corso di processi flogistici (epididimiti, orchiti, ecc.) in cui stanno a contatto per lungo tempo con gli spermatozoi (Kovalski e coll, 1992).

Un’altra possibile fonte di ROS sono le manipolazioni a cui il seme è sottoposto durante le fasi di preparazione che precedono la fecondazione assistita e la crioconservazione. Ripetute centrifugazioni aumentano i livelli di ROS negli spz umani da 20 a 50 volte (Iwasaki e coll., 1992) a causa di un maggior rilascio da parte degli stessi spz piuttosto che in seguito a una diminuita attività dei sistemi antiossidanti.

La crioconservazione può risultare pericolosa per l’integrità di membrana, che può subire danni derivanti dallo stress indotto durante il passaggio di stato e dalla disidratazione che si verifica durante il congelamento, a cui segue la reidratazione durante lo scongelamento.

Gli spermatozoi con aumentato spazio citoplasmatico, conseguente ad una alterata spermatogenesi, contengono vari enzimi, tra cui glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G-6-PDH), responsabili indirettamente dell'elevata produzione delle ROS. La G-6-PDH stimola la liberazione del NADPH, il

(Aitken e coll., 1992a) e una "diaforesi spermatica" che è un enzima ossidoreduttasi NADPH dipendente, situato nella porzione intermedia dello spz all'interno del sistema respiratorio mitocondriale (Gavella. e Lipovac, 1992).

1.3 MECCANISMO D'AZIONE DELLE ROS

Le membrane degli spermatozoi sono molto sensibili ai danni provocati dai radicali liberi, a causa del loro alto contenuto di acidi grassi polinsaturi. La distruzione della membrana plasmatici da parte delle ROS rappresenta il processo di lipoperossidazione. La presenza di doppi legami permette agli ossidanti di attaccare le catene di carbonio degli acidi grassi polinsaturi, producendo così radicali lipidici, i quali, in condizioni di aerobiosi, reagiscono con l'ossigeno per formare un radicale perossile.

Una volta iniziata la perossidazione lipidica, le reazioni dei radicali coinvolgono tutta la membrana a causa della stretta vicinanza degli acidi grassi insaturi. Gli attacchi dei radicali e la conseguente reazione di perossidazione lipidica alterano l'architettura della membrana, diminuendo la sua funzionalità (Ohyashiki e coll., 1988; Block, 1991).

Esiste anche un altro sistema che partecipa alla formazione dello ione superossido che è quello della xantina-xantina ossidasi (XO)

XANTINA→ACIDO URICO + O2-·

La XO altera il sistema flagellare, recando immobilità allo spermatozoo (De Lamirande e Gagnon, 1992b).

1.4

L'ANIONE SUPEROSSIDO

Alcuni ricercatori (De Lamirande e Gagnon, 1993a, 1995a) hanno evidenziato il ruolo dell'anione superossido nell'indurre la capacitazione dello spermatozoo. Questi hanno inoltre dimostrato che il rilascio extracellulare dell'anione superossido da parte dello spermatozoo avviene immediatamente all'inizio del processo di capacitazione e raggiunge il massimo livello dopo 15-25 minuti per poi decrescere lentamente dopo 1-2 ore. Questo dato, combinato al fatto che l'aggiunta dell'enzima SOD (dopo 30-60 minuti dall'inizio) non previene la reazione, indica che l'anione superossido è il promotore iniziale di una serie di eventi a catena che

La natura del complesso sistema enzimatico responsabile della produzione dell'anione superossido, all'inizio della capacitazione spermatica, non è ancora esattamente conosciuta.

Aitken e coll. (Aitken e coll., 1995 e 1996b) ipotizzano che la membrana spermatica potesse contenere un enzima importante per la produzione dell'anione superossido, simile a quello ritrovato nei neutrofili (Morel e coll., 1991), nei fibroblasti (Meier e coll., 1991): l'enzima NADPH-ossidasi. Nei fluidi biologici, come il liquido seminale e il fluido follicolare, ci sono molte molecole che attivano direttamente o indirettamente il NADPH-asi.