Materiali e Metodi
per produrre, nella PCR, molecole di DNA amplificato contenenti la mutazione, utilizzando come stampo iniziale il plasmide wild-type. Mentre quest'ultimo, essendo stato estratto da batteri, è metilato, il DNA amplificato (mutagenizzato), prodotto in vitro, è privo di metilazione.
Dopo una corsa su gel di controllo, si effettua una digestione con l’endonucleasi di restrizione Dpn I, in grado di riconoscere sequenze metilate ed emimetilate di DNA, presenti solo sul DNA parentale non mutagenizzato e sulle molecole ibride (emimetilate) formate da una catena parentale ed una di nuova sintesi. Con questo passaggio si elimina, dal nostro campione, il DNA che non contiene siti mutagenizzati. Successivamente, con un'aliquota della reazione si effettua una trasformazione, cui segue l'estrazione del vettore plasmidico mediante "midi-prep", effettuate a partire da singole colonie. Il DNA estratto, infine, viene controllato per sequenziamento.
2.4.b Screening di colonie tramite PCR
La PCR è una tecnica che abbiamo utilizzato anche per effettuare uno screening delle colonie trasformate con le miscele di ligation.
Le singole colonie devono essere prelevate con un'ansa sterile, stemperandole in 40 µl di brodo LB per 15 minuti. Sulle sospensioni ottenute si esegue il protocollo della PCR per verificare l'esito del clonaggio. La scelta dei primers è importante per poter diagnosticare la presenza dell'inserto all'interno del vettore plasmidico di cui abbiamo effettuato la ligation, nonché il suo corretto orientamento nel vettore. Per questo, abbiamo utilizzato come primer 5' un primer SP6, che riconosce la sequenza dell'SP6 promoter, a 65
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monte del polylinker (in cui vengono clonati gli inserti), insieme ad un primer 3' che riconosce una sequenza specifica all'interno dell'inserto clonato. Ciò consente la reazione di amplificazione della sequenza compresa tra i due primers solo se l'inserto è realmente presente e solo se è stato clonato nel giusto orientamento 5' 3' all'interno del vettore.
Per effettuare la reazione di PCR, abbiamo utilizzato il seguente protocollo:
2 µl di sospensione della colonia batterica 2,5 µl di buffer Taq 10x
0,5 µl di primer SP6 10 mM 0,5 µl di primer interno 10 mM 0,5 µl di dNTP mix (10 mM ognuno) 1 µl di polimerasi Red Taq
18 µl di H20 mq (volume finale di 25 µl)
Come controlli interni all'esperimento si preparano una reazione di controllo positivo, da cui ci attendiamo amplificazione, ed una reazione in cui, al posto della sospensione delle colonie, si mette H20 mq (controllo negativo).
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Dopo aver preparato i campioni, si procede con la reazione di amplificazione:
I ciclo (1x) 94°C per 3 minuti (permette la lisi cellulare ed il rilascio di DNA in soluzione)
II ciclo (35x) 94°C per 30 secondi 52°C per 30 secondi 72°C per 30 secondi III ciclo (1x) 72°C per 3 minuti
Infine, si può valutare il risultato della PCR sottoponendo un'aliquota dei campioni analizzati a elettroforesi su gel. Dei campioni positivi si può effettuare un inoculo della sospensione di partenza in brodo LB, l'estrazione dei vettori plasmidi mediante "midi-prep", che verranno poi controllati per sequenziamento.
