RISULTATI
ELETTROFORESI SDS-PAGE
La figura 14 (a) mostra il marker di riferimento dei pesi molecolari, nella figura 14 (b) possiamo osservare la SDS-PAGE colorata, con il Coomassie, degli estratti proteici di larve di operaia al quinto stadio dello sviluppo larvale. il campione ha subito un trattamento semidenaturante secondo il protocollo Laemli; La figura 14 (c) invece mostra il risultato del blotting e dell'immunorivelazione della figura 14 (b) sono visibili, anche se alcune debolmente, le bande coi rispettivi pesi molecolari che evidenziano i frammenti polimerici della nucleoplasmina.
(a) (b) (c)
Figura 14: (a) mostra la corsia del marker; (b) SDS-PAGE al 12% di 50 µg di estratto proteico di operaia (96h), colorato con Coomassie Blu R-250 ; (b) membrana PVDF risultante dal blotting ed immunorivelazione del gel di fig. 14 (a); in questa immagine, per maggiore chiarezza, abbiamo evidenziato solo le corsia d'interesse sia del gel che della membrana; le frecce mettono in evidenza bande e i rispettivi pesi molecolari.
65kD 45kDa 30kDa 25kDa 19kDa 54kDa 62kDa 65kDa 97kDa 97kDa 66kDa 45kDa 30kDa 20kDa 19kDa
si possono vedere le bande della nucleoplasmina ed i pesi molecolari . Le bande di nucleoplasmina, a parità di trattamento dei due campioni, risultano meno numerose nella regina rispetto all'operaia
Figura 15: (a) mostra la corsia del marker; (b) SDS-PAGE al 12% di 50 µg campione di regina (96h), il gel è stato colorato con Coomassie Blu R-250. (b) membrana PVDF risultante dal blotting ed immunorivelazione del gel di fig. 15 (a); in questa immagine, per maggiore chiarezza, abbiamo evidenziato solo le corsia d'interesse sia del gel che della membrana, le frecce mettono in evidenza le bande e i rispettivi pesi molecolari.
ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE
Sono state prese in esame le differenze che si presentano ad alti pesi molecolari (97- 45 kDa) tra i pattern proteici di larva di operaia e larva di regina allo stesso stadio larvale. La figura 16 (a) mostra la 2-DE di 2500 µg di estratto proteico di operaia di (96h) in cui sono osservabili una serie di spot. Nella figura 16 (b) che mostra una elettroforesi bidimensionale di estratto proteico di larva di regina (96h), possiamo osservare che questi spot non compaiono. Sulla base delle differenze notate sono stati fatti analizzare, mediante la tecnica del MALDI-TOF , alcuni degli spot presenti nel pattern proteico di operaia. L'analisi ha indicato che si tratta di nucleoplasmina.
38kDa 66kDa 68kDa 28kDa 97kDa (a) (b) (c) 66kDa 45kDa 30kDa 20kDa 19kDa 66kDa 45kDa
(
a)
(
b)
figura 16: (a) gel 2-DE al 12% in cui sono stati caricati 2500µg di estratto proteico di operaia colorato con silver staining (MALDI compatibile) nell'immagine abbiamo evidenziato l'area del gel in cui sono visibili gli spot da noi presi in
54kDa 57kDa 45kDa 43kDa 36kDa 32kDa >66kD
Per confermare il risultato ottenuto mediante la spettrometria di massa, abbiamo utilizzato l'anticorpo primario specifico per la nucleoplasmina di ape, per effettuare il blot e l'immunorivelazione .
La figura 17 (a) mette in evidenza l' elettroforesi bidimensionale di larva di operaia (96h) , anche in questo gel possiamo ritrovare alcuni degli spot visti in figura 16 (a),in (b) è mostrata la membrana PVDF del blotting ed immunorivelazione effettuato sul gel di 17 (a). Nella membrana sono ben visibili due spot corrispondenti a 46 e 43 kDa , che corrispondono a forme polimeriche della nucleoplasmina.
a) b)
Figura 17: (a) gel 2-DE al 12% in cui sono stati caricati 3000µg di estratto proteico di operaia colorato con silver staining (MALDI compatibile); (b) membrana PVDF risultante dal blotting ed immunorivelazione di fig.17 (a) permette di osservare l'effettiva presenza di nucleoplasmina negli spot evidenziati in fig. 17 (a); abbiamo messo in evidenza solo l'area del gel in cui si trovano gli spot d'interesse (rettangolo), le frecce indicano gli spot e i rispettivi pesi molecolari.
46kDa 43kDa 66kDa 67kDa 46kDa 43kDa
In figura 18 (a) mostriamo l' elettroforesi bidimensionale di larva di regina (96h), in cui compaiono degli spot ad alto peso molecolare (>97kDa) e qualche spot tra i 96 e i 66 kDa, per verificare se alcuni di quegli spot fossero nucleoplasmina abbiamo effettuato il blot ed l'immunorivelazione del gel (a) il risultato è visibile in figura 18 (b), in cui si può vedere che effettivamente in regina è presente la nucleoplasmina a pesi molecolari e conformazioni diverse rispetto alla operaia
(a) (b)
Figura 18: (a) gel 2-DE al 12% in cui sono stati caricati 3000µg di estratto proteico di regina colorato con silver staining (MALDI compatibile); (b) membrana PVDF risultante dal blotting ed immunorivelazione di fig. (a) permette di osservare l'effettiva presenza di nucleoplasmina (rettangolo) negli spot evidenziati in fig.18 (a); anche in questo caso è visibile solo l'area d'interesse (rettangolo), le frecce indicano gli spot e i rispettivi pesi molecolari.
96kDa 95kDa
66kDa
>97kDa >97kDa
