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CAPITOLO 3
PARTE SPERIMENTALE
3.1 SCOPO DELLA TESI
Per secoli i derivati della pianta Cannabis Sativa L. come la marijuana e l’hashish sono stati usati per i loro effetti terapeutici e psicomimetici.98
Gli effetti farmacologici dei derivati cannabinoidi sono mediati attraverso due recettori comunemente denominati CB1 e CB2 appartenenti alla famiglia A
dei recettori associati alle proteine G (GPCRs).
Il recettore CB1 è principalmente localizzato a livello del sistema nervoso
centrale e attualmente è molto studiato per gli effetti terapeutici e psicoattivi dei derivati cannabinoidi a livello del sistema nervoso centrale.73 Il recettore CB2 è principalmente espresso a livello del sistema immunitario ed il ruolo
fisiologico ed il potenziale terapeutico di tale sottotipo risultano ancora oggi relativamente poco esplorati.73 Tuttavia studi recenti suggeriscono per esempio che il recettore CB2 è coinvolto nel controllo del dolore periferico, nei
fenomeni infiammatori, di osteoporosi, nella crescita di tumori e potrebbe avere anche un ruolo in patologie come la sclerosi multipla.73
Lo sviluppo di composti agonisti caratterizzati da alta affinità per il recettore CB2 ed alta selettività nei confronti del sottotipo CB1, risulterebbe
essere un ottimo punto di partenza per esplorare i ruoli fisiologici del recettore CB2 e misurarne il potenziale terapeutico. In letteratura sono presenti numerosi
differenti classi di composti CB agonisti, tra queste la classe dei derivati amminoalchilindolici riveste una particolare importanza poiché oltre a possedere un certo grado di selettività CB2/CB1, diversi studi sperimentali
suggeriscono che questa classe di ligandi interagisce in un sito di legame diverso da quello in cui interagiscono tutte le altre classi di derivati cannabinoidi.73
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Per tutti questi motivi lo studio di questa tesi ha analizzato da un punto di vista computazionale i derivati amminoalchilindolici presenti in letteratura allo scopo di:
Analizzare e descrivere le relazioni struttura attività importanti per l’affinità verso il recettore CB2
Analizzare e descrivere le relazioni struttura-attività importanti per la selettività CB2/CB1
Fornire suggerimenti per lo sviluppo di nuovi potenziali agonisti selettivi per il recettore CB2
Sviluppare una procedura in grado di rendere possibile un eventuale studio di virtual screening
Testare l’affidabilità di una metodica di allineamento dei composti recentemente pubblicata dal nostro gruppo di ricerca.
Data l’assenza di strutture tridimensionali sperimentali dei recettori CB1 e
CB2 lo studio si è sviluppato utilizzando approcci basati solamente sulle
caratteristiche dei ligandi, quali lo sviluppo di modelli farmacoforici e di modelli 3D-QSAR.
Più in dettaglio lo studio di questa tesi si è sviluppata in quattro fasi principali:
Individuazione di derivati amminoalchilindolici con proprietà agoniste verso il sottotipo CB2 testati su entrambi i recettori e
utilizzando le stesse condizioni, in maniera tale da poter correlare l’affinità sperimentale con quella calcolata dai modelli 3D-QSAR. Sviluppo di modelli 3D-QSAR per i recettori CB1 e CB2
utilizzando come procedura di allineamento il metodo “Atom-based” fornito dal programma PHASE92
ed il metodo “MTA” (multitemplate alignment) recentemente riportato dal nostro gruppo di ricerca.99
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Confronto dei modelli 3D-QSAR ottenuti, allo scopo di identificare il migliore metodo di allineamento.
Analisi dei modelli 3D-QSAR per il recettore CB1 e CB2 ottenuti
attraverso la migliore delle due procedure, ponendo particolare attenzione sia agli elementi importanti per l’affinità verso il recettore CB2 che la selettività CB2/CB1.
3.2 RICERCA BIBLIOGRAFICA.
Il mio lavoro di tesi è iniziato con una ricerca bibliografica preliminare. La ricerca è stata fatta per trovare articoli riguardanti derivati amminoalchilindolici e analoghi saggiati per la loro affinità per i recettori dei cannabinoidi.
La scelta dei derivati amminoalchilindolici è derivata da due motivi fondamentali:
Sono composti strutturalmente differenti dalle altre classi e sembrano agire in un sito d’interazione differente rispetto alle classi.
Sono composti con buone proprietà selettive per il recettore CB2.
Una volta terminata la ricerca bibliografica ho compiuto un lavoro di selezione scegliendo tra i numerosi articoli trovati quelli che potevano risultare utili. La scelta degli articoli si è basata su due elementi fondamentali:
Composti saggiati per la loro affinità per entrambi i recettori dei cannabinoidi.
Articoli classificati in base al tipo di saggio utilizzato per valutare l’affinità dei composti.
In base a questi due criteri di selezione sono state trovate 127 molecole testate per entrambi i recettori con metodica analoga.100-103
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L’importanza che questi composti siano stati saggiati per la loro affinità sia per i recettori CB2 che CB1 deriva dal fatto che questo ci permette di fare un
confronto tra le diverse modalità di interazione prendendo quindi in considerazione le caratteristiche che devono avere le molecole per mostrare selettività per il recettore CB2.
L’uso di composti saggiati nella stessa maniera ci dà la possibilità di sviluppare modelli 3D-QSAR attendibili, in grado di correlare l’affinità delle molecole con le loro caratteristiche chimico-spaziali.
I test che vengono effettuati per studiare l’affinità dei derivati selezionati sono test di spiazzamento del radioligando H3[CP-55940] dal sito di legame. Questi test vengono effettuati per i recettori CB2 su una preparazione di
recettori umani clonati, tramite utilizzo di linee cellulari (Chinese hamster ovary)100-103 in cui viene introdotto il DNA codificante per il recettore CB2; per
il recettore CB1 il test viene effettuato su una membrana omogenizzata
preparata a partire dal cervello di ratto.100-103
3.3 COSTRUZIONE DEL MODELLO FARMACOFORICO
La costruzione tridimensionale delle molecole è stata effettuata con il programma MAESTRO.104 Per ogni molecola è stata fatta la minimizzazione
tramite il programma MACROMODEL.105 L’algoritmo usato è stato
Montecarlo, con MMFFs (Merk Molecular Force Field) come forcefield ed una costante dielettrica distanza-dipendente pari a 1 in solvente acquoso.
Successivamente con il programma ADME/Tox WEB106 disponibile in rete è stata analizzato lo stato di protonazione di ogni singola molecola. Questo programma è in grado di fare una previsione della costante di ionizzazione acido-base (pKa) in condizioni standard (soluzione acquosa a 25°C).
Le molecole analizzate sono state raccolte in un unico file dove sono state inserite anche le affinità dei vari composti rispetto ai recettori CB1 e CB2.
I ligandi sono quindi stati poi sottoposti ad analisi conformazionale (vedi procedura descritta nel capitolo 2.1.1 sez. a) ed in questo modo per ogni
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ligando è stata creata una serie di possibili conformazioni che esso può assumere.
Dopo aver effettuato l’analisi conformazionale, i ligandi sono stati analizzati con il programma PHASE92 dall’interfaccia grafica di MAESTRO (GUI), per costruire gli ipotetici modelli farmacoforici.
Nella prima finestra di PHASE abbiamo definito l’intervallo di attività all’interno del quale le molecole sono state considerate attive e l’intervallo di attività all’interno del quale le molecole sono state considerate inattive. Le molecole attive sono state utilizzate per costruire il modello farmacoforico, mentre le inattive sono state utilizzate come strumento di verifica dei modelli farmacoforici.
Il programma PHASE è in grado di identificare le features delle molecole attive; le features sono descrittori in grado di descrivere le principali componenti delle molecole. Nel programma sono presenti un’ampia serie di features già pre-impostate, oppure vi è la possibilità di crearne di nuove. Sotto riportiamo l’elenco delle features presenti in PHASE:
A = Accettore, Gruppo accettore di legami ad Idrogeno D= Donatore, Gruppo donatore legami ad Idrogeno H= Idrofobico, Gruppo idrofobico
N= Negativo, Gruppi carichi negativi P= Positivo, Gruppi carichi positivi R= Anello, Anello aromatico
Oltre alle feature gia pre-impostate è stata utilizzata una feature costruita (vedi procedura descritta capitolo 2.1.1 sez. b). La feature costruita descritta con la lettera X contiene insieme le caratteristiche della feature H (idrofobico) ed R (anello aromatico):
X = H+R
La creazione di questa feature ha permesso per esempio di allineare insieme anelli aromatici con anelli cicloalchilici, in quanto in essa sono presenti sia le
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caratteristiche dell’anello aromatico (R) che le caratteristiche idrofobiche che presenta un ciclo esile (H).
Dopo aver identificato tutte le features dei ligandi attivi il programma cerca di sovrapporre tutti questi ligandi in maniera tale da permettere la loro sovrapposizione con il più alto numero di features allineate per ogni ligando. Sulla base di questa analisi sono state ottenute 5 diverse combinazioni (ipotesi farmacoforiche): 1.AHHRR 2.AHRRR 3.ARRRR 4.HHRRR 5.HRRRR
Le combinazioni sopra elencate indicano le feauters comuni ai ligandi attivi presenti in quella determinata ipotesi, ad esempio l’ipotesi AHHRR indica che tutti i ligandi attivi presentano allineate tra loro una feature che rappresenta il gruppo Accettore (A), due features che rappresentano il gruppo Idrofobico (H) e due features che rappresentano il gruppo Aromatico (R). Sulla base di queste 5 ipotesi farmacoforiche, PHASE propone una serie di modelli plausibili. Tali modelli vengono quindi classificati sulla base di uno score ottenuto sulla base del grado di allineamento dei ligandi attivi (tabella 1, Survival score).
Partendo dalle 5 ipotesi farmacoforiche, PHASE ha dato come output dieci modelli farmacoforici tutti del tipo AHRRR, ma con score diversi (tabella 1). Le altre ipotesi farmacoforiche sono state escluse dal programma per il basso score calcolato.
PHASE, per ogni modello farmacoforico ottenuto, allinea i ligandi inattivi con le features del modello, cercando la migliore sovrapposizione possibile e determinando uno score detto Inactive (tabella 1, Inactive). Tale score indica quanto il modello farmacoforico è in grado di discriminare tra le molecole attive e quelle inattive.
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La combinazione del Survival score con l’Inactive score determina lo score finale del modello farmacoforico denominato Survival-Inactive score (vedi tabella 1).
In ID Survival Survival –
inactive Site Vector Volume #
Matches Energy Activity Inactive 1 AHRRR.1245 7.299 5.765 0.65 0.958 0.639 18 0.000 8.538 1.534 2 AHRRR.1267 7.336 5.710 0.68 0.954 0.651 18 0.000 8.538 1.626 3 AHRRR.1057 7.505 5.567 0.82 0.961 0.673 18 0.000 8.921 1.939 4 AHRRR.2269 7.303 5.549 0.65 0.961 0.635 18 0.000 8.921 1.754 5 AHRRR.2273 7.263 5.524 0.64 0.950 0.623 18 0.000 9.161 1.739 6 AHRRR.217 7.356 5.502 0.72 0.975 0.611 18 0.000 9.161 1.854 7 AHRRR.39 7.302 5.388 0.71 0.938 0.600 18 0.000 8.396 1.914 8 AHRRR.2319 7.252 5.379 0.62 0.964 0.615 18 0.000 9.377 1.873 9 AHRRR.2091 7.226 5.247 0.61 0.956 0.602 18 0.000 8.538 1.979 10 AHRRR.1371 7.314 5.227 0.67 0.944 0.650 18 0.000 8.538 2.088
Tabella 1: Score delle ipotesi farmacoforiche.
Oltre che avere una rappresentazione numerica del modello, con il programma PHASE è possibile avere anche una rappresentazione grafica del modello farmacoforico ed è possibile analizzare la distribuzione delle features nello spazio (figura 1).
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I dieci modelli farmacoforici sono stati successivamente analizzati attraverso calcoli preliminari effettuati con il metodo GRID/GOLPE,93,95 il quale ci ha permesso di scegliere quale modello sviluppare.
3.4 SVILUPPO DEI MODELLI 3D-QSAR PER I RECETTORI CB1 E CB2
3.4.1 Allineamento delle molecole
Utilizzando i 10 modelli farmacoforici sopra descritti PHASE92 è in grado di sviluppare, per ogni modello, un allineamento di tutte le molecole analizzate. I dieci allineamenti così generati sono stati processati con il programma GRID93 tramite l’interfaccia grafica GREATER.94 GRID è un programma che permette di comprendere alcune relazioni struttura-attività e permette di individuare quali sono i siti d’interazione favorevoli tra una macromolecola (target) e piccoli gruppi atomici denominati probes (vedi Capitolo 3.4.2)
3.4.2 Selezione dei Probes
I probes sono dei piccoli gruppi atomici che mimano i gruppi funzionali più comuni posseduti dai farmaci. Per l’individuazione di specifiche regioni di interazione, GRID include un elevato numero di probes che comprende tutti i più comuni gruppi funzionali organici, alifatici o aromatici, unitamente ad acqua, cationi ed anioni.
I probes possono identificare:
singoli atomi come ad esempio ossigeno, azoti, carboni, cationi come calcio, litio,zinco ed anioni come cloro, fluoro, bromo, con le loro caratteristiche chimiche (ad esempio tipo di ibridazione)
gruppi funzionali come acidi carbossilici aromatici ed alifatici, ammidi aromatici ed alifatiche, amidine alifatiche ed aromatiche, con le loro caratteristiche chimiche (ad esempio struttura cis o trans).
Le energie di interazione tra i probes selezionati e ciascun composto sono state calcolate utilizzando una griglia di ampiezza pari a 1 Å.
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I descrittori utilizzati sono stati:
Probe C3: scelto perche rappresenta il gruppo metilico, e rappresenta le interazioni di tipo idrofobico, le quali si suppone siano implicate nelle interazioni tra il recettore CB2 e i ligandi.
Probe O: rappresenta il gruppo carbonilico presente sulle molecole, il quale interagisce con i residui aminoacidici agendo come accettore di H e quindi permettendo la formazione di legami ad H tra molecola e recettore.
E’ stata utilizzata questa combinazione di probes in modo da ottenere informazioni combinate sulla lipofilia e sulla proprietà di donare ed accettare legami ad idrogeno.
Per le loro caratteristiche chimiche i probes scelti possono essere messi i relazione con le features del modello farmacoforico costruito precedentemente (capitolo 3.3), in particolare il probe C3 rappresenta tutte le interazioni di tipo idrofobico e quindi andrebbe a identificare le features idorfobiche (H) e le features aromatiche (R) (figura 1), mentre il probe O rappresenta il gruppo carbonilico e può essere identificato con la feature accettore (A), in quanto questa feature è individuata sul gruppo carbonilico (figura1).
Il calcolo ha fornito come output i files grid.lont e grid.kont. Quest’ultimo è un file binario che può essere utilizzato come file di trasferimento da GRID ad altri programmi, in questo caso GOLPE.
3.4.3 COSTRUZIONE DEL MODELLO 3D-QSAR PER IL RECETTORE CB2
3.4.3.1 Scelta del modello migliore
La scelta del modello farmacoforico da sviluppare è stata fatta calcolando modelli 3D-QSAR preliminari utilizzando il programma GOLPE.95 I dieci allineamenti originati dai 10 modelli farmacoforici sono stati processati prima attraverso GRID93 e poi attraverso GOLPE95 per poter ottenere dei risultati preliminari in grado di stabilire il modello più affidabile.
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La scelta del modello è stata effettuata tenendo di conto della predittività interna dei dieci modelli. Il parametro che misura il grado di predittività del modello viene definito q2, più è vicino ad 1 questo valore e migliore è la predittività interna del modello. Oltre a questo parametro l’altro parametro fondamentale preso in considerazione è stato il valore di r2 che indica il coefficiente di correlazione. In tabella 2 sono riportati i valori di q2 ed r2 ottenuti per i 10 modelli.
Mod. Farmacoforico Q2 R2 1 AHHRR1245 0,52 0,88 2 AHHRR1371 0,44 0,87 3 AHHRR2269 0,44 0,75 4 AHHRR2273 0,41 0,81 5 AHHRR39 0,41 0,86 6 AHHRR2319 0,35 0,83 7 AHHRR1057 0,34 0,85 8 AHHRR217 0,34 0,81 9 AHHRR1267 0,31 0,86 10 AHHRR2091 0,31 0,84
Tabella 2: Parametri statistici preliminari, q2 e r2 calcolati per i dieci modelli farmacoforici.
L’analisi preliminare dei valori di q2
ed r2 ci ha permesso di scegliere il modello farmacoforico di partenza per costruire il modello 3D-QSAR.
Il modello scelto è stato l’AHHRR1245, in quanto questo modello farmacoforico ha mostrato il miglior valore di q2 ed r2.
3.4.3.2 Costruzione del modello
I 127 composti costruiti precedentemente sono stati suddivisi in un training set ed in un test set. Il training set è costituito da 92 composti che hanno un attività, misurata come pKi, che varia da 5 a 9,5. Il testset esterno è costituito da
35 composti scelti in maniera tale da avere una distribuzione omogenea lungo l’intervallo di attività del training set.
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Utilizzando i 92 ligandi del training set il sistema presentava inizialmente 46400 variabili.
Il programma GOLPE ha permesso di fare una prima riduzione delle variabili attraverso la procedura di pretrattamento avanzato dei dati.
In questo modo è stata ottenuta un’importante riduzione delle variabili che sono state ridotte a 6556.
Per migliorare le capacità predittive del modello è stata fatta una selezione delle variabili con la procedura Fractional Factorial Design (FFD). Essa non è stata applicata alle singole variabili ma a gruppi di variabili generati con l’algoritmo SSD.
La selezione FFD è stata applicata tre volte. Le variabili finali dopo le tali selezioni sono risultate 1288.
Tabella 3 mostra i principali dati statistici del modello 3D-QSAR.
Vars PC R2 Q2 SDEP SDEP external
1288 1 0,66 0,48 0,67 0,57
1288 2 0,81 0,63 0,57 0,66
1288 3 0,86 0,67 0,54 0,63
1288 4 0,91 0,66 0,55 0,65
1288 5 0,93 0,64 0,56 0,64
Tabella 3: Risultati statistici del modello 3D-QSAR “atom-based” per il recettore CB2.
È stata quindi valutata l’abilità predittiva del modello utilizzando i 35 composti del test set e calcolando il valore della deviazione standard degli errori di predizione SDEPexternal (tabella 3).
Dalla tabella 3 si può notare come la varianza (r2) aumenti significativamente dalla prima componente (r2=0,66) alla seconda (r2=0,81), fino alla quinta (r2=0,93), mentre a questo progressivo aumento non corrisponde un progressivo aumento della predittività (q2).
La componente principale che permette di ottenere risultati ottimali è risultata essere la terza (Figura 2), con un valore di r2=0,86, q2=0.67 e un SDEP del test set esterno pari 0.63.
77 Figura 3: Grafico di pKi sperimentale rispetto a quella predetta dal modello 3D-QSAR
“atom-based” per i recettori CB2.
3.4.4 COSTRUZIONE DEL MODELLO 3D-QSAR PER IL
RECETTORE CB1
L’allineamento utilizzato per lo sviluppo del modello 3D-QSAR per il recettore CB2 è stato utilizzato anche per lo sviluppo di un modello per il
recettore CB1 utilizzando la stessa procedura descritta sopra e cambiando
solamente i valori di affinità dei ligandi.
Dopo lo step di pretrattamento dei dati e l’applicazione delle tre FFD, le variabili sono risultate 1112.
Sotto riportiamo la tabella dei risultati del modello 3D-QSAR.
Vars PC R2 Q2 SDEP SDEP external
1112 1 0,74 0,52 0,66 0,66
1112 2 0,78 0,62 0,59 0,61
1112 3 0,80 0,59 0,61 0,63
1112 4 0,87 0,52 0,66 0,67
1112 5 0,90 0,47 0,69 0,69
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Come mostrato in Tabella 4, il valore di r2 tende ad aumentare dalla prima alla quinta componente, rendendo ogni componente più attendibile della precedente.
Il q2 invece aumenta dalla prima alla seconda componente, e poi dalla terza alla quinta componente subisce un progressivo decremento (Tabella 4).
Come per il modello per il recettore CB2, è stata poi valutata l’abilità
predittiva del modello CB1 utilizzando i 35 composti del test set, calcolando il
valore della deviazione standard degli errori di predizione SDEP external (tabella
4 ).
La componente principale che permette di ottenere risultati ottimali è risultata essere la seconda (tabella 4), con un valore di r2=0,78, di q2 = 0.62 e un SDEP del test set pari 0.61.
Figura 4: Grafico di pKisperimentale rispetto a quella predetta dal modello 3D-QSAR “atom-based” per i recettori CB1.
79
3.5 ANALISI DEL MODELLO OTTENUTO PER I RECETTORI CB1
E CB2
Da un primo confronto tra i due modelli possiamo vedere che questa procedura risulta essere maggiormente predittiva per i recettori CB2 che non
per i recettoriCB1 (tabella 5). Nonostante questo però il modello presenta una
buona predettività anche per i recettori CB1.
R2 Q2 SDEPext
CB2 0,86 0,67 0,63
CB1 0,78 0,62 0,61
Tabella 5: Confronto dei modelli 3D-QSAR ottenuti per i recettori CB2 eCB1.
3.6. SVILUPPO DEI MODELLI 3D-QSAR PER I RECETTORI CB1 E CB2
UTILIZZANDO LA TECNICA MTA.
Recentemente il nostro gruppo di ricerca ha sviluppato per generare modelli di 3D-QSAR affidabili, una nuova procedura di allineamento per i ligandi denominata “multitemplate alignment” (MTA).99
La procedura del “multitemplate alignment” è un metodo che si basa sull’allineamento dei ligandi a molecole di riferimento detti templati (figura 5). Le molecole scelte come templati hanno un’alta affinità per il recettore e se possibile vengono utilizzate molecole di cui i complessi tridimensionali recettore-ligando sono noti. Per i recettori cannabinoidi non sono presenti in letteratura strutture sperimentali tridimensionali, pertanto sono state utilizzate molecole ad alta affinità con strutture in grado di rappresentare le principali classi di molecole che interagiscono nel sito di legame dei derivati amminoalchilindolici. Una volta scelti i templati ogni ligando del training set e del test set viene allineato ai templati e dopo viene fatta un analisi dell’allineamento per scegliere quello migliore. Infine usando per ogni ligando il miglior allineamento viene sviluppato il modello 3D-QSAR.
80 Figura 5: Diagramma schematico del metodo multitemplate alignment99
Analizzando tutti i composti che si ipotizza interagiscano nel sito di legame dei derivati amminoalchilindolici, sono stati selezionati cinque composti di riferimento che riassumono i principali scaffolds riportati in letteratura e che sono caratterizzati da alta affinità nei confronti del recettore CB2. Le cinque strutture selezionate sono riportate in Tabella 6.
Cristallografia a Raggi X della proteina con il
ligando.
Allineamento delle strutture a raggi X
Estrazione delle coordinate dei ligandi
Ligandi del training e del test set Allineamento dei ligandi
del training e test set ai ligandi complessati
Analisi del miglior allineamento per ogni ligando del training e test
set Sviluppo del modello
3D-QSAR , usando per ogni ligando il miglior
81 CB1 Ki(nM) CB2 Ki(nM) 48_213 O N 1,5 0,42 50_307 O N F 7,7 3,3 2_10 N N O N H F O 9,6 0,7 8_22 N O OCH3 O 45 0,12 12_11l N O O N H F 30,5 0,8
Tabella 6: Composti di riferimento usati per la costruzione dell’ipotesi farmacoforica e loro Ki
82
I 5 ligandi sopra descritti sono stati analizzati dal programma PHASE92 allo scopo di sviluppare un modello farmacoforico in grado di rappresentare le caratteristiche di questi ligandi.
Con il programma MAESTRO104 sono stati costruiti i 5 ligandi che sono stati poi sottoposti a calcoli di minimizzazione molecolare ed analisi conformazionale.
L’output di tali calcoli è stato analizzato da PHASE che ha identificato 5 features comuni ai 5 ligandi e 18 combinazioni possibili di cui però solo due sono realmente plausibili:
1. ARXXX 2. AHRXX
Dove A corrisponde ad accettore di legami ad idrogeno, R anello aromatico, H gruppo idrofobico, ed X custom ovvero una feature da noi definita che rappresenta le caratteristiche di aromatico e idrofobico.
PHASE ha dato come risultato 20 ipotesi farmacoforiche ad ognuna delle quali è stato applicato uno score ovvero un punteggio di predizione dell’ipotesi basato sul migliore allineamento dei cinque ligandi. Più è alto il punteggio migliore sarà quella determinata ipotesi farmacoforica. Sotto riportiamo la tabella con tutte e 20 le ipotesi farmacoforiche (tabella 7).
In ID Survival Site Vector Volume # Matches Energy
1 ARXXX.379 3.023 0.59 0.932 0.506 5 3.520 2 ARXXX.210 2.982 0.56 0.915 0.505 5 2.513 3 ARXXX.651 2.977 0.57 0.887 0.516 5 2.613 4 ARXXX.384 2.977 0.57 0.887 0.516 5 2.613 5 ARXXX.173 2.955 0.51 0.926 0.520 5 2.613 6 ARXXX.376 2.934 0.49 0.937 0.507 5 3.079 7 ARXXX.647 2.934 0.49 0.937 0.507 5 3.079 8 ARXXX.184 2.885 0.47 0.933 0.485 5 0.000 9 ARXXX.197 2.881 0.45 0.958 0.475 5 2.503 10 ARXXX.613 2.859 0.49 0.897 0.471 5 1.889 11 AHRXX.85 2.859 0.49 0.897 0.471 5 1.889
83 12 AHRXX.59 2.859 0.49 0.897 0.471 5 1.889 13 AHRXX.87 2.837 0.43 0.928 0.477 5 1.804 14 AHRXX.61 2.837 0.43 0.928 0.477 5 1.804 15 AHRXX.86 2.835 0.44 0.902 0.492 5 1.889 16 AHRXX.60 2.835 0.44 0.902 0.492 5 1.889 17 AHRXX.24 2.823 0.43 0.911 0.483 5 6.953 18 AHRXX.74 2.823 0.49 0.898 0.438 5 2.523 19 AHRXX.48 2.823 0.49 0.898 0.438 5 2.523 20 AHRXX.28 2.784 0.47 0.880 0.436 5 2.504 Tabella 7: Ipotesi farmacoforiche ottenuto con Phase e loro score.
Le 20 ipotesi farmacoforiche sono state sottoposte ad analisi preliminari attraverso il metodo GRID93/GOLPE95 che hanno confermato che il modello ARXXX379 era il migliore. Tale modello è stato quindi utilizzato per costruire i modelli 3D-QSAR per il recettore CB1 e CB2.
Figura 7 mostra l’ipotesi farmacoforica ARXXX379 con i 5 ligandi di riferimento. Dalle figure possiamo vedere la corrispondenza che c’è tra le features e le molecole: la feature rossa è l’accettore (A) e corrisponde ai gruppi carbonilici, la feature ad anello, color arancio, è l’anello aromatico (R) e corrisponde agli anelli aromatici, e la feature celeste X, contiene in se le caratteristiche idrofobiche e di anello aromatico e quindi rappresenta sia le strutture idrofobiche alifatiche cicliche e non, che gli anelli aromatici.
I 5 ligandi, allineati utilizzando il modello ARXXX379, sono stati usati come strutture di riferimento per effettuare l’allineamento delle 127 molecole100-103 precedentemente già utilizzate per lo sviluppo dei modelli di 3D-QSAR.
84 Modello farmacoforico ARXXX379 e ligando
2_10
Modello farmacoforico ARXXX379 e ligando 8_22
Modello farmacoforico ARXXX379 e ligando 12_11l
Modello farmacoforico ARXXX379 e ligando 48_213
Modello farmacoforico ARXXX379 e ligando 50_307
85
L’allineamento è stato effettuato usando il programma ROCS97
(Rapid Overlay of Chemical Structure), tale programma applica un metodo di sovrapposizione delle molecole basato sulla forma; le molecole vengono allineate secondo un processo di ottimizzazione del corpo rigido che massimizza il volume sovrapposto. Durante il processo di allineamento il programma ROCS prende in considerazione le caratteristiche elettrostatiche delle molecole tramite il color force field; quest’ultimo permette di rendere la sovrapposizione migliore in quanto considera le somiglianze chimiche delle molecole. Il color force field permette di rifinire la sovrapposizione perché durante il processo di allineamento delle molecole prende in considerazione la presenza di gruppi funzionali accettori e donatori di legami ad idrogeno, anioni, cationi, gruppi idrofobici ed anelli aromatici. Il programma prende in considerazione solo gli eteroatomi dei ligandi ed ignora gli idrogeni.
I 127 ligandi, sono stati allineati ad ognuno dei 5 templati, utilizzando ROCS. Ogni ligando è stato sovrapposto ad ogni templato di riferimento, ottenendo così 127 sovrapposizioni per ogni templato.
Prima di poter procedere con l’allineamento delle molecole attraverso il programma ROCS è necessario effettuare l’analisi conformazionale delle suddette molecole attraverso il programma OMEGA296. A questo punto con il programma ROCS tutte le molecole sono state allineate ai 5 templati allineati tra di loro attraverso il modello farmacoforico ARXXX379. Il programma ROCS per ogni molecola sceglie la conformazione, costruita con OMEGA2, che meglio si allinea al templato. Il miglior allineamento viene scelto in base alla sovrapposizione della forma della molecola stessa ed in base alle caratteristiche elettrostatiche, questo metodo viene definito Combo Score. Ad ogni allineamento viene dato un punteggio, più alto è il punteggio e migliore è l’allineamento. Ogni molecola è stata allineata ai 5 templati di riferimento e per ogni allineamento è stato attribuito un punteggio (tabella 8). In tabella 8 sono riportati i punteggi dati dal ROCS per l’allineamento di ogni molecola ad ogni templato.
86 Templati CPD 12_11l 2_10 48_213 50_307 8_22 Best Score 39_004 1,17 1,07 1,72 1,52 1,18 1,72 39_009 1,14 1,05 1,61 1,47 1,18 1,61 39_016 1,17 1,05 1,66 1,53 1,18 1,66 39_019 1,14 1,07 1,71 1,51 1,19 1,71 39_020 1,14 1,05 1,60 1,52 1,15 1,60 39_042 1,05 0,99 1,52 1,35 0,99 1,52 39_043 1,08 0,98 1,55 1,39 1,04 1,55 39_047 1,17 1,04 1,59 1,46 1,17 1,59 39_049 1,16 1,06 1,70 1,52 1,16 1,70 39_050 1,13 1,04 1,60 1,46 1,16 1,60 39_070 1,05 0,95 1,50 1,36 1,00 1,50 39_071 1,08 0,96 1,53 1,40 1,04 1,53 39_073 1,17 1,04 1,65 1,55 1,19 1,65 39_077 1,08 0,96 1,54 1,34 1,10 1,54 39_078 1,07 0,94 1,57 1,38 1,09 1,57 39_080 1,15 1,00 1,66 1,53 1,17 1,66 39_082 1,07 1,00 1,71 1,49 1,14 1,71 39_083 1,05 0,97 1,63 1,49 1,12 1,63 39_093 1,01 0,99 1,56 1,34 1,12 1,56 39_095 1,06 0,99 1,63 1,34 1,19 1,63 39_096 1,14 1,01 1,65 1,45 1,15 1,65 39_097 1,03 0,97 1,68 1,44 1,10 1,68 39_099 1,10 1,01 1,70 1,50 1,17 1,70 39_100 1,08 1,00 1,64 1,44 1,16 1,64 48_007 1,19 1,07 1,75 1,57 1,19 1,75 48_015 1,10 1,01 1,57 1,42 1,09 1,57 48_018 1,19 1,07 1,73 1,59 1,19 1,73 48_046 1,09 1,00 1,55 1,41 1,08 1,55 48_048 1,19 1,06 1,73 1,56 1,17 1,73 48_072 1,11 1,00 1,56 1,44 1,17 1,56 48_076 1,10 0,99 1,55 1,45 1,15 1,55 48_079 1,07 0,96 1,59 1,43 1,16 1,59 48_081 1,14 1,02 1,77 1,56 1,13 1,77 48_094 1,07 0,97 1,61 1,40 1,08 1,61 48_098 1,15 1,03 1,78 1,54 1,17 1,78 48_120 1,09 0,98 1,58 1,45 1,17 1,58 48_122 1,18 1,05 1,75 1,58 1,18 1,75 48_148 1,09 0,99 1,60 1,41 1,08 1,60 48_149 1,18 1,05 1,77 1,56 1,18 1,77 48_151 1,10 1,00 1,54 1,40 1,08 1,54 48_153 1,19 1,06 1,71 1,55 1,15 1,71 48_159 1,18 1,05 1,70 1,54 1,15 1,70 48_160 1,08 0,99 1,53 1,39 1,08 1,53 48_163 1,10 0,99 1,53 1,43 1,13 1,53 48_164 1,17 1,04 1,69 1,56 1,15 1,69 48_165 1,09 0,98 1,52 1,43 1,13 1,52 48_166 1,18 1,05 1,69 1,56 1,15 1,69 48_180 1,06 0,95 1,64 1,41 1,13 1,64 48_181 1,09 1,02 1,73 1,53 1,12 1,73 48_182 1,13 1,01 1,79 1,55 1,11 1,79 48_189 1,05 0,96 1,65 1,38 1,15 1,65 48_210 1,15 1,03 1,90 1,57 1,13 1,90 48_211 1,07 0,98 1,74 1,40 1,07 1,74 48_212 1,07 0,97 1,73 1,43 1,15 1,73 48_213 1,16 1,03 1,92 1,54 1,16 1,92 48_234 1,16 1,04 1,69 1,56 1,11 1,69 48_235 1,09 0,98 1,53 1,43 1,13 1,53 48_236 1,08 0,99 1,53 1,40 1,10 1,53 48_239 1,11 0,94 1,57 1,39 1,17 1,57 48_240 1,03 0,94 1,74 1,47 1,10 1,74 48_241 1,07 0,95 1,59 1,37 1,15 1,59 48_242 1,07 0,95 1,69 1,42 1,11 1,69 48_258 1,03 0,93 1,70 1,55 1,07 1,70 48_259 1,06 0,95 1,58 1,41 1,12 1,58 48_260 1,07 0,96 1,71 1,52 1,12 1,71 48_261 1,05 0,96 1,60 1,36 1,12 1,60
87 48_262 1,15 1,05 1,70 1,55 1,15 1,70 48_265 1,08 1,05 1,55 1,43 1,15 1,55 48_266 1,06 1,01 1,55 1,39 1,12 1,55 48_267 1,15 1,02 1,69 1,56 1,16 1,69 48_268 1,15 1,02 1,70 1,55 1,16 1,70 49_167 1,25 1,18 1,48 1,33 1,19 1,48 49_201 1,24 1,16 1,41 1,25 1,13 1,41 49_202 1,21 1,14 1,39 1,25 1,11 1,39 49_203 1,24 1,17 1,45 1,35 1,17 1,45 49_204 1,21 1,17 1,47 1,29 1,17 1,47 49_205 1,25 1,16 1,48 1,28 1,18 1,48 49_206 1,25 1,17 1,47 1,27 1,18 1,47 49_207 1,25 1,16 1,47 1,26 1,16 1,47 49_208 1,25 1,17 1,47 1,29 1,18 1,47 49_209 1,26 1,16 1,47 1,26 1,16 1,47 49_237 1,25 1,17 1,43 1,32 1,14 1,43 49_248 1,25 1,17 1,51 1,26 1,18 1,51 49_249 1,24 1,17 1,45 1,35 1,20 1,45 49_250 1,22 1,15 1,47 1,29 1,16 1,47 49_251 1,24 1,17 1,44 1,35 1,17 1,44 49_252 1,24 1,17 1,47 1,29 1,17 1,47 49_253 1,17 1,05 1,42 1,25 1,12 1,42 49_302 1,24 1,15 1,44 1,33 1,12 1,44 49_303 1,22 1,15 1,42 1,27 1,13 1,42 49_304 1,25 1,15 1,49 1,26 1,16 1,49 49_305 1,24 1,17 1,47 1,29 1,17 1,47 49_306 1,16 1,04 1,45 1,30 1,13 1,45 49_311 1,24 1,17 1,44 1,29 1,17 1,44 49_312 1,25 1,17 1,43 1,33 1,14 1,43 49_313 1,26 1,17 1,47 1,27 1,18 1,47 49_314 1,19 1,16 1,43 1,29 1,14 1,43 49_315 1,22 1,16 1,43 1,28 1,13 1,43 49_316 1,26 1,16 1,47 1,26 1,16 1,47 50_145 1,20 1,04 1,41 1,89 1,09 1,89 50_146 1,06 0,92 1,34 1,80 1,03 1,80 50_147 1,11 1,00 1,41 1,83 1,04 1,83 50_150 1,22 1,05 1,39 1,84 1,03 1,84 50_156 1,12 1,04 1,31 1,75 1,02 1,75 50_243 1,15 1,04 1,36 1,85 1,05 1,85 50_244 1,19 1,04 1,39 1,87 1,07 1,87 50_245 1,19 1,04 1,39 1,87 1,07 1,87 50_246 1,11 1,01 1,39 1,88 1,06 1,88 50_292 1,08 0,94 1,39 1,88 1,05 1,88 50_293 1,10 1,00 1,34 1,83 1,02 1,83 50_307 1,10 1,02 1,41 1,90 1,06 1,90 50_308 1,19 1,04 1,38 1,87 1,07 1,87 50_309 1,07 1,07 1,39 1,85 1,07 1,85 50_346 1,12 1,01 1,39 1,88 1,06 1,88 50_347 1,07 1,04 1,32 1,82 0,97 1,82 50_348 1,14 1,01 1,28 1,80 1,02 1,80 50_363 1,05 0,99 1,31 1,80 1,01 1,80 50_364 1,15 1,02 1,37 1,85 1,04 1,85 50_365 1,08 0,94 1,39 1,89 1,05 1,89 50_366 1,14 1,08 1,47 1,90 1,12 1,90 50_367 1,09 0,96 1,37 1,86 1,07 1,86 50_368 1,12 1,01 1,38 1,88 1,06 1,88 50_369 1,15 1,02 1,41 1,90 1,07 1,90 50_370 1,16 1,04 1,41 1,90 1,06 1,90 50_371 1,06 0,98 1,30 1,81 1,02 1,81 50_372 1,11 1,01 1,38 1,84 1,04 1,84 50_373 1,04 0,98 1,33 1,84 1,02 1,84
Tabella 8: Tabella del punteggio di allineamento di ogni ligando alle 5 molecole di riferimento. Evidenziato in giallo il miglior allineamento.100-103
88
Dalla tabella 8 risulta che tutti i derivati 1,2-alchil-3-(alchil-1-naftoil)indoli (39_XXX, 48_XXX), 1,2-alchil-3-(alcossi-1-naftoil)indoli (39_XXX, 48_XXX), 1-pentil-3-fenilacetilindoli (49_XXX) sono meglio allineati con il templato 48_213, mentre i derivati 1-alchil-2-fenil-4-(1-naftoil)pirroli (50_XXX) e 1-pentil-2-aril-4-(1-1-alchil-2-fenil-4-(1-naftoil)pirroli (50_XXX) sono meglio allineati con il templato 50_307.
Prendendo in considerazione per ogni ligando il miglior score di allineamento sono stati quindi costruiti i modelli 3D-QSAR per l’affinità nei confronti del recettore CB1 e CB2.
3.7COSTRUZIONE DEL MODELLO 3D-QSAR PER I RECETTORI CB1 E
CB2
Per sviluppare il modello 3D-QSAR “MTA”99 è stata usata la stessa identica procedura GRID93/GOLPE95 utilizzata per i costruire i modelli 3D-QSAR “atom-based” precedentemente descritti.
Lo studio è iniziato utilizzando il programma GRID tramite l’interfaccia grafica GREATER94, i probes selezionati sono stati gli stessi del modello precedente, C3 che rappresenta i gruppi idrofobici ed O che rappresenta il gruppo carbonilico. Nel costruire i modelli 3D-QSAR “MTA” sono stati usati gli stessi training set (92 ligandi) e test set esterno (35 ligandi) adoperati precedentemente.
Con il programma GOLPE è stata fatta una prima riduzione delle variabili tramite la funzione pretrattamento avanzato dei dati e successivamente per aumentare le capacità predittive del modello è stata fatta una selezione delle variabili tramite l’operazione Factorial Fractional Design (FFD). Essa non è stata applicata alle singole variabili ma a gruppi di variabili generati con l’algoritmo SSD.
3.7.1 Modello 3D-QSAR dei recettori CB2
Il pretrattamento dei dati e l’applicazione del Factorial Fractional Design ha portato a 719 variabili. Di seguito riportiamo la tabella con i dati statisti del modello 3D-QSAR.
89
Vars PC R2 Q2 SDEP SDEPexternal
719 1 0,69 0,59 0,60 0,60
719 2 0,75 0,65 0,55 0,46
719 3 0,80 0,65 0,57 0,44
719 4 0,84 0,63 0,57 0,42
719 5 0,87 0,62 0,58 0,43
Tabella 9: Risultati statistici del modello 3D-QSAR “MTA” per il recettore CB2.
È stata poi valutata l’abilità predittiva del modello inserendo i 35 composti del test set e calcolando il valore della deviazione standard degli errori di predizione SDEPexternal (tabella 9).
La componente principale che permette di ottenere risultati ottimali è risultata essere la terza (Figura), con un valore di r2=0,80, q2 = 0.65 e un SDEPexternal del test set = 0.46.
Figura 8: Grafico di pKi del modello 3D-QSAR “multitemplate alignment” per i CB2, in blu
90
3.7.2 Modello 3D-QSAR “MTA” dei recettori CB1
Utilizzando l’allineamento delle molecole ottenuto attraverso la tecnica del
“MTA”99
è stato sviluppato anche un modello 3D-QSAR per l’affinità dei ligandi nei confronti del recettore CB1.
Per lo sviluppo del modello 3D-QSAR è stata usata la stessa metodica GRID93/GOLPE95 e gli stessi parametri usati precedentemente.
La procedura FFD è stata applicata tre volte ottenendo 813 variabili finali. Nella tabella 10 sono riportati i dati statistici ottenuti.
Vars PC R2 Q2 SDEP SDEPexternal
813 1 0,60 0,48 0,68 0,68
813 2 0,77 0,63 0,58 0,53
813 3 0,80 0,64 0,57 0,48
813 4 0,85 0,61 0,60 0,45
813 5 0,88 0,58 0,62 0,43
Tabella 10: Risultati statistici del modello 3D-QSAR “MTA” per i recettori CB1
È stata poi valutata l’abilità predittiva del modello inserendo i 35 composti del test set e calcolando il valore della deviazione standard degli errori di predizione, SDEPexternal.
La componente principale che permette di ottenere risultati ottimali è risultata essere la terza (tabella 10, con un valore di r2=0,80 q2 = 0.64 e un SDEPexternal del test set = 0.48.
91 Figura 9: Grafico di pKi del modello 3D-QSAR “multitemplate alignment” per i CB1, in blu
training set ed in rosso testset.
3.8 ANALISI DEL MODELLO 3D-QSAR “MTA” PER I RECETTORI CB2 E
CB1 E CONFRONTO CON IL MODELLO 3D-QSAR “ATOM-BASED”.
3.8.1 Confronto del modello 3D-QSAR “Mutlitemplate alignment” con il
modello 3D-QSAR “atom-based”
I quattro modelli 3D-QSAR ottenuti, due per i CB2 e due per i CB1 (tabella
11), sono stati confrontati utilizzando tre parametri fondamentali: r2, q2 ed SDEPext. Il parametro r2 indica il valore della regressione lineare e più è alto e
migliore è la descrizione della regressione (può assumere valore da 0 a 1), mentre il q2 indica il grado di predittività interna del modello e più è alto questo valore e migliore sarà il modello (può assumere valore da 0 a 1). SDEPext infine
indica la deviazione standard dell’errore di predizione del test set esterno, e più si avvicina a zero e migliore risulta essere la predittività esterna del modello 3D-QSAR.
92
In tabella 11 sono riassunti i principali dati statistici risultanti dai 4 modelli 3D-QSAR.
Atom-based Multitemplate-alignment
R2 Q2 SDEP SDEPext R2 Q2 SDEP SDEPext
CB2 0,86 0,67 0,54 0,63 0,80 0,65 0,57 0,44
CB1 0,78 0,61 0,59 0,61 0,80 0,64 0,57 0,48
Tabella 11: Confronto tra i modelli 3D-QSAR “atom-based” e i modelli 3D-QSAR “MTA”.
Confrontando i risultati ottenuti per il recettore CB2 si nota che il valore di
r2 è migliore per il modello Atom-based, il q2 risulta essere molto simile mentre il valore di predizione per il test esterno è notevolmente migliore per il modello ottenuto con il multitemplate alignment. Per quanto riguarda il recettore CB1
invece i valori di r2, q2 ed SDEPext sono tutti e tre migliori per il modello
sviluppato con il metodo multitemplate-alignment. In conclusione il metodo MTA risulta essere più efficace per lo sviluppo dei due modelli 3D-QSAR in quanto mostra migliori risultati per entrambi i modelli in termini di predittività esterna, migliori risultati per la predittività interna del modello per il recettore CB1 e risultati di predittività interna molto simili a quelli ottenuti con la
procedura Atom-based per il recettore CB2.
3.8.2 Analisi dei PLS-coefficient plots dei modelli 3D-QSAR “MTA”
I modelli MTA sono quindi stati ulteriormente analizzati attraverso lo studio grafico dei risultati. Infatti un’importante caratteristica dell’analisi 3D-QSAR è la rappresentazione grafica del modello, solitamente utile per semplificare la sua interpretazione. Il programma GOLPE ha diverse opzioni per mostrare il modello finale: tra di esse PLS pseudocoefficient e activity contribution plots sono le opzioni più utilizzate.
Il PLS coefficient plots visualizza le interazioni favorevoli e sfavorevoli tra i probes e le molecole studiate, mentre l’activity contribution plots è differente
93
per ogni molecola del training set e mostra le regioni dello spazio che sono singolarmente importanti per ciascuna molecola selezionata.
Le figura 10 ed 11 mostrano i PLS coefficient plots positivi (poliedri turchesi) e negativi (poliedri verdi) ottenuti con i probes C3 e O per i modelli 3D-QSAR per il recettore CB2 e CB1. In entrambe le figure per una migliore
analisi è riportato anche il composto 48_149, che risulta essere uno dei composti più affini per entrambi i sottotipi recettoriali (Ki CB1=5.0 nM, Ki
CB2=0,73 nM). La presenza delle regioni negative (poliedri verdi) nel probe
C3 indica che un interazione favorevole tra il sostituente del ligando e il probe determina un decremento dell’attività, mentre un interazione sfavorevole tra la regione negativa del probe e il sostituente del ligando determina un aumento d’attività. La presenza delle regioni positive (poliedri turchesi) per il probe C3 indica che un’interazione favorevole tra il sostituente del ligando ed il probe C3 determina un incremento dell’attività, mentre un’interazione sfavorevole tra il sostituente del ligando ed il probe C3 determina un decremento dell’attività. Per il probe O invece le regioni negative (poliedri verdi) indicano che un interazione favorevole tra il sostituente del ligando ed il probe determinano un incremento di attività, mentre un interazione sfavorevole tra il sostituente del ligando ed il probe determinano un decremento dell’attività. Per il probe O le regioni positive (poliedri turchesi) indicano che un interazione favorevole tra il sostituente del ligando ed il probe determinano un decremento d’attività, mentre un interazione sfavorevole tra sostituente e probe determina un incremento dell’attività. Le regioni negative indicano le zone dove avvengono interazioni di tipo elettrostatico.
L’analisi delle superfici del modello per il recettore CB2 (figura 10)
evidenzia come l’affinità sia quasi esclusivamente correlata alle interazioni lipofile, infatti non si osservano superfici negative importanti per entrambi i probes. Per quanto riguarda il probe C3 le regioni positive A, B, C e D descrivono l’interazione del sostituente legato all’azoto indolico e la presenza della principale regione A suggerisce un’efficace interazione da parte dei sostituenti di piccole dimensioni di natura n-propilica. Le regioni positive F e G indicano come il secondo fattore principale ai fini dell’affinità sia il
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sostituente in posizione 4 dell’anello naftilico. In particolare le due regioni evidenziano come il sostituente di natura metilica mostri le dimensioni ottimali per l’attività.
Le superfici positive del probe O sostanzialmente confermano le indicazioni fornite dall’analisi del probe C3 e sottolineando l’importanza delle interazioni lipofile. Come precedentemente detto, l’assenza di importanti regioni negative per il probe O suggerisce l’assenza di fondamentali interazioni elettrostatiche ai fini dell’affinità.
Figura 10 PLS coefficient plots positivi, del probe C3 ( a sinistra) e del probe O (a destra) , per il recettore CB2. Il composto 48_149101 è riportato come struttura di riferimento.
In Figura 11 sono mostrate le superfici del modello 3D-QSAR per il recettore CB1. Per quanto riguarda il probe C3 le regioni dei ligandi importanti
ai fini dell’attività corrispondono al sostituente legato all’azoto indolico (regioni A, B, C), al sostituente in posizione 4 dell’anello naftilico (regioni D ed E) come per il modello per il recettore CB2 ed anche al sostituente in
posizione 7 dell’anello naftilico (regioni F). Per quanto riguarda il sostituente legato all’azoto indolico le principali regioni A e B suggeriscono che, a differenza del modello CB2 la presenza di un sostituente alchilico n-pentilico
sia favorita. Anche per quanto riguarda il sostituente in posizione 4 dell’anello naftilico le regioni D ed E sono relativamente distanti dal gruppo metilico del composto di riferimento 48_149 suggerendo un’affinità migliore in presenza di
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sostituenti di dimensioni maggiori. La regione F infine suggerisce che la presenza di sostituenti alchilici in posizione 7 determini un aumento dell’affinità per il recettore CB1. L’analisi del probe O ed in particolare la
presenza della regione negativa a’, suggerisce che la presenza di sostituenti accettori di legami ad idrogeno nella regione corrispondente alla posizione 2, 3 e 6 dell’anello naftilico determina un aumento di attività. Per quante riguarda invece le regioni positive del probe O sostanzialmente confermano le ipotesi dedotte dall’analisi delle regioni positive del probe C3.
Figura 11 PLS coefficient plots positivi (turchesi) e negativi (verdi) , del probe C3 ( a sinistra) e del probe O (a destra) , per il recettore CB1, e composto di riferimento 48_149.101
