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Academic year: 2021

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5. DISCUSSIONE

Analizzando i risultati ottenuti dalle varie prove effettuate è stato possibile verificare, durante la messa a punto della tecnica su cellule amniotiche, l’importanza delle differenti fasi al fine di ottenere una buona riuscita della tecnica FISH. Uno dei passaggi più importanti al quale è necessario porre la massima attenzione è il fissaggio della cellula amniotica sul vetrino. Affinché la sonda possa attraversare la membrana nucleare e legarsi in questo modo ad una regione specifica di DNA:

1. la cellula fissata deve avere un citoplasma quasi o completamente digerito;

2. inoltre è importante che sul vetrino sia presente una concentrazione di proteine, residuali del liquido amniotico, molto bassa così da non interferire con la sonda stessa.

Nella prima fase del lavoro sono stati quindi effettuati molti vetrini allo scopo di:

a) acquisire la manualità necessaria per poter lavorare su un numero di cellule molto basso (5/10 cellule per ogni vetrino),

b) trovare il metodo di fissaggio più adatto per una cellula per aumentare la probabilità di successo.

Nelle prime prove eseguite le percentuali di vetrini positivi alla tecnica FISH non sono risultate molto alte.

Ciò era dovuto essenzialmente al fatto che molte delle cellule fissate, non solo possedevano ancora uno strato abbastanza denso di citoplasma, ma il nucleo di esse non risultava sufficientemente rigonfiato, ostacolando in questo modo l’entrata della sonda.

Tramite alcune modifiche apportate alla fase di fissaggio siamo infatti riusciti ad ottenere una percentuale di vetrini nettamente più alta.

In un secondo momento è stato quindi applicato il protocollo di FISH abbreviato. In questo modo è stato possibile eseguire la tecnica FISH in poche ore e ottenere una risposta diagnostica in tempi relativamente brevi.

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Il tempo necessario per effettuare una diagnosi è elemento essenziale nel caso della Diagnosi Genetica Preimpianto, dal momento che i blastomeri analizzati vengono prelevati da embrioni al terzo giorno di gestazione e che entro il quarto/quinto giorno devono essere trasferiti in utero in caso di diagnosi favorevole.

Molto importante nel caso della Diagnosi Genetica Preimpianto è anche la possibilità di eseguire su una sola cellula più ibridazioni fluorescenti così da ottenere su un solo nucleo un maggior numero di risultati e di indicazioni utili alla diagnosi.

Osservando i segnali provenienti dalle tre ibridazioni in situ fluorescente eseguite su cellule amniotiche possiamo affermare di essere riusciti, anche in questo caso, ad ottenere ottimi risultati.

Generalmente, come è stato osservato dalla letteratura, vengono eseguite più ibridazioni su un solo nucleo per coppie con poliabortività o età materna avanzata. Per i casi di poliabortività l’esame viene effettuato quando dall’analisi dei feti abortiti non è stata ritrovata una particolare e ripetuta anomalia cromosomica come causa dell’aborto stesso. Per i casi con età materna avanzata l’esame viene effettuato per indagare le aneuploidie più comuni.

Vengono utilizzate inizialmente sonde di tipo centromerico al fine di identificare la presenza di aneuploidie nella cellula; nel caso sussistano dei dubbi interpretativi riguardanti un particolare cromosoma viene eseguita successivamente un’ibridazione fluorescente utilizzando una sonda telomerica specifica o locus specifica per il cromosoma stesso.

Dopo aver messo a punto la tecnica di fissaggio di poche cellule e aver ottenuto risultati soddisfacenti per mezzo della tecnica FISH si è presentata la possibilità di recuperare embrioni in arresto mitotico spontaneo e di applicare tali procedure sui blastomeri.

Il blastomero, essendo una cellula ancora non completamente differenziata e non avendo un citoplasma molto denso, a differenza di una cellula amniotica, non necessita durante il fissaggio sul vetrino di uno shock ipotonico. Infatti la sola aggiunta di una piccola goccia di fissativo di Carnoy è stata sufficiente a fissare la cellula, digerire il suo citoplasma ed a permettere

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l’entrata della sonda durante le ibridazioni in situ fluorescenti eseguite successivamente.

Osservando i risultati della prima FISH 14/22 e della seconda FISH X/Y possiamo ritenere di essere riusciti ad applicare correttamente il protocollo sul blastomero.

Nonostante ciò è stato possibile notare una maggior compromissione del nucleo da un’ibridazione all’altra probabilmente a causa del ripetuto passaggio del vetrino ad alte temperature, e alle ripetute disidratazioni crescenti di alcool. Un inconveniente riportato anche in letteratura (Bahçe et al., 2000;

Wilton,2002).

La terza FISH 8/9 eseguita sul blastomero ha riportato invece la presenza all’interno del nucleo di segnali aspecifici.

Come riportato anche in letteratura infatti (Joris et al., 1999; Magli et al., 1999; Ciotti et al.,2000), utilizzare blastomeri provenienti da embrioni

crioconservati può diminuire significativamente il successo della FISH, a maggior ragione per blastomeri sottoposti a ripetute ibridazioni.

In generale possiamo affermare di essere riusciti ad ottenere dei buoni risultati non solo partendo da poche cellule amniotiche fissate su un vetrino, ma anche su un solo blastomero biopsato da un embrione in arresto mitotico. Tuttavia la difficoltà riscontrata nel reperire embrioni umani che si trovassero nelle giuste condizioni morfologiche per poter eseguire una biopsia, ha limitato la possibilità di effettuare la diagnosi genetica su pochi blastomeri.

Riteniamo comunque di essere riusciti a mettere a punto una tecnica sofisticata e complessa e auspichiamo in un futuro molto vicino, in stretta collaborazione con il centro di Fecondazione Assistita, di poterla integrare nella routine di un laboratorio pubblico come quello di Citogenetica e Genetica Molecolare dell’Ospedale S.Chiara di Pisa.

Osservando i dati raccolti dalla bibliografia è stato possibile conoscere vantaggi e limiti della Diagnosi Genetica Preimpianto, una tecnica fino ad oggi applicata soprattutto nei laboratori privati di paesi esteri.

La DGP offre la possibilità importante a molte coppie portatrici di malattie autosomiche dominanti e recessive (Strom et al. 1995,Fiorentno F et al., 2003),

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legate al cromosoma X (Griffin et al., 1992) o alterazioni cromosomiche (Munné S et al., 1998; Munné S. et al., 2000; Cozzi J. Et al., 1999;Verlinsky et al., 1995; Harper et al., 1995) di conoscere lo stato di benessere dell’ embrione ancor prima del suo trasferimento in utero.

La Diagnosi Genetica Preimpianto è tuttavia una tecnica che, secondo la letteratura, presenta ancora non pochi limiti :

Rischi connessi alle tecniche di procreazione medicalmente assistita (Reis Soares S et al., 2003).

Possibili effetti negativi che l’embrione impiantato potrebbe avere durante il suo sviluppo in seguito a biopsia (Munné S et al, 1999) (Gianaroli L et al., 1999).

Rischio di fallimento dell’analisi (Orizzonti FC, 2009)

Probabilità di diagnosi errate (Thornhill AR et al., 2005; Garagiola I et al., 2003).

Necessità di riscontro attraverso la diagnosi prenatale

Limiti non tecnici ma legati alla legge 40 non meno determinanti

Abbiamo potuto verificare che alcuni dei limiti riportati in letteratura sono stati riscontrati anche durante il nostro lavoro.

Innanzitutto la difficoltà nel reperire e sperimentare su embrioni umani in arresto mitotico. In Italia, in una struttura pubblica italiana come la nostra, è necessario infatti che il Comitato Etico dell’Ospedale dia il via libera alle sperimentazioni su materiale umano, quale embrioni o globuli polari.

Ottenuta l’approvazione del Comitato Etico un secondo ostacolo che abbiamo dovuto affrontare è stato quello di riuscire su embrioni in arresto mitotico a

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prelevare dei blastomeri sui quali eseguire un’indagine citogenetica. Gli embrioni in arresto mitotico sono ovviamente meno resistenti rispetto ad embrioni vitali in cui la biopsia rimane sicuramente molto meno difficoltosa.

Anche alcuni limiti della tecnica FISH riportati nella letteratura (Thornhill AR. et al., 2005; Lewis CM, 2001; Staessen et al., 1999) sono stati osservati durante il nostro lavoro, tra i quali :

perdita del nucleo durante il fissaggio mancanza di segnale

sovrapposizione dei segnali di ibridazione

Errori valutabili, secondo la letteratura, in un 10% dei casi, la stessa percentuale verificata durante il nostro lavoro.

Anche analizzando i risultati ottenuti sul blastomero e confrontandoli con quelli riportati dalla letteratura sono state osservate delle analogie tra i dati provenienti dal nostro lavoro e quelli bibliografici. Un inconveniente, osservato nella letteratura (Bahçe et al., 2000; Wilton, 2002), che si è presentato anche nel nostro lavoro, consisteva nella presenza di segnali aspecifici sul blastomero sottoposto alla terza ibridazione in situ fluorescente, probabilmente a causa di una maggior compromissione del nucleo.

Inoltre il fatto di aver lavorato su un blastomero proveniente da un

embrione non vitale ma in arresto mitotico crioconservato, può aver amplificato e reso più evidente questo aspetto. Un limite, anche in questo caso, che è stato più volte riportato in letteratura (Joris et al., 1999; Magli et al., 1999; Ciotti et al.,2000).

In generale possiamo affermare di essere riusciti a mettere a punto nel nostro laboratorio la metodica FISH per la Diagnosi Genetica Preimpianto, con percentuali di fallimento, di errore, e di successo molto vicini a quelli riportati in letteratura.

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